Vi presenterer syntesen av en splitt-intein-mediert protein hydrogel. Byggesteinene i denne hydrogel er to protein-kopolymerer som hver inneholder en subenhet av en trimere protein som fungerer som en kryssbinder og en halvdel av en splittet intein. Blanding av de to protein kopolymerer utløser en intein trans-spleising reaksjon, noe som gir et polypeptid enhet som selv setter sammen til en hydrogel. Denne hydrogel er sterkt pH-og temperatur-stabile, er forenelig med organiske løsningsmidler, og lett inkorporerer funksjonelle globulære proteiner.
Vi presenterer syntesen av et meget stabilt protein hydrogel mediert av en splitt-intein-katalysert protein trans-skjøting reaksjon. Byggesteinene i denne hydrogel er to protein blokk-kopolymerer som hver inneholder en subenhet av en trimere protein som fungerer som en kryssbinder og en halvdel av en splittet intein. Et sterkt hydrofil tilfeldig spole er innsatt i en av blokk-kopolymerer for vannretensjon. Blanding av de to proteiner blokk-kopolymerer utløser en intein trans-spleising reaksjon, noe som gir et polypeptid med tverrbindingsenhet ved hver ende som raskt selv setter sammen til en hydrogel. Denne hydrogel er meget stabilt under både sure og basiske betingelser, ved temperaturer opp til 50 ° C og i organiske løsemidler. Den hydrogel raskt reformer etter skjær-indusert ruptur. Innlemmelse av en "docking station peptid" inn i hydrogelen byggeblokken muliggjør praktisk inkorporering av "docking protein"-merket målproteiner.Hydrogelen er kompatibel med vevskultur vekstmedier, støtter diffusjonen av 20 kDa-molekyler, og gjør det mulig for immobilisering av bioaktive globulære proteiner. Anvendelsen av intein-mediert protein hydrogel som et organisk-løsningsmiddel-forenlig biokatalysator ble demonstrert ved å innkapsle pepperrot peroksydase enzym og bekreftende dens aktivitet.
Hydrogeler laget utelukkende av proteiner bære potensial til å avansere felt så forskjellige som tissue engineering, levering av legemidler og biofabrication en. De har fordeler i forhold til tradisjonelle syntetiske polymer hydrogeler inkludert biokompatibilitet og et potensial til invasivt støtte inkorporering av bioaktive globulære proteiner.
I dette arbeidet, vil vi beskrive utviklingen av et nytt protein hydrogel dannet via en splitt-intein-mediert protein trans-skjøting reaksjonen og dens anvendelse som et protein immobilisering stillaset (figur 1). Byggesteinene for denne hydrogel er to protein blokk-kopolymerer hver omfattende den N-eller C-terminale fragment av en splittet intein (IN og IC) og en subenhet av et multimert protein tverrbinder. Den DnaE intein fra Nostoc punctiforme (NPU) ble brukt som split intein 2,3 og en liten trimere protein (12 kDa) CutA fra Pyrococcus horikoshii </ Em> ble anvendt som tverrbindingsprotein 4,5. Forskjellige tverrbindere er sluttet gjennom intein katalysert trans-spleising reaksjon, som fører til dannelsen av et sterkt tverrbundet proteinnettverket (hydrogel). NPU intein ble valgt på grunn av sin raske reaksjonskinetikk (t 1/2 = 63 sek) og høy trans-spleising yield (nær 80%) 2,3. Den CutA protein ble valgt som tverrbindingsmiddel på grunn av sin høye stabilitet. CutA trimerer har en denaturering temperatur på nær 150 ° C og beholde trimere kvaternær struktur i oppløsninger inneholdende så mye som 5 M guanidin-hydroklorid 4,6. Siden subenheten utveksling mellom ulike crosslinkers er en stor bidragsyter til den fysiske hydrogel overflateerosjon 7, bør den meget sterke inter subenheten samhandling i CutA fraråde slike subenheten børser, som fører til en mer stabil hydrogel. En av disse byggeklosser inneholder også et sterkt hydrofilt peptid S-fragment som midtblokken for å forenkle vannoppbevaring åtte.
Blanding av de to hydrogel byggeklosser initierer en trans-spleising reaksjonen mellom IN og IC intein fragmenter, generering av et lengre polypeptid-kjede med tverrbindingsmidler i begge terminaler. Tverrbindere fra flere slike molekylære enheter kommuniserer med hverandre og danner en meget kryssbundet hydrogel nettverk (figur 1A). En spesifikk "docking station peptid" (DSP) er innlemmet i en av de hydrogel byggeblokker for å lette stabil immobilisering av en "docking protein" (DP)-merket målprotein inn i hydrogelen. Bruk av et delt intein å mediere hydrogel sammenstillingen ikke bare gir ytterligere fleksibilitet for proteinsyntese hydrogel, men også gjør det mulig med høy tetthet, jevn belastning av målproteinet i hele hydrogel, som målproteiner lastes før hydrogel formasjonen.
Den intein-mediert protein hydrogel er svært stagjengelig i vandig oppløsning med liten til ingen påvisbar erosjon etter 3 måneder ved romtemperatur. Stabilitet er beholdt i et bredt spekter av pH-verdier (6-10) og temperaturer (4-50 ° C), og hydrogelen er også kompatibel med organiske løsningsmidler. Denne hydrogel blir brukt for immobilisering av to globulære proteiner: grønt fluorescerende protein (GFP) og pepperrotperoksidase (HRP). Hydrogel omslutte den sistnevnte protein blir brukt til å utføre biocatalysis i et organisk løsningsmiddel.
I dette arbeidet, viste vi syntesen av en svært stabil intein-mediert protein hydrogel. Bruk av et delt muliggjør intein hydrogel som skal betinget dannet i respons til en blanding av to væske-fase-komponenter. Nærmere bestemt, intein kovalent forbinder split to væske-fase byggeklosser via en trans-spleising reaksjon, noe som gir et polypeptid enhet flankert ved tverrbinding enheter som i sin tur selv setter sammen til en hydrogel. Blandingen-indusert dannelse av hydrogelen omgår tekniske vanskeligheter i…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke dr. David Tirrell (Caltech) for hans type gave av plasmidet pQE9 AC 10 Atrp 12, Dr. Tom Muir (Princeton University) for hans type gave av plasmidet KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Upplands Väsby, Ishikawa, Japan) for hans type gave av plasmidet pET30-CutA-Tip1 10, og Dr. Jay D. Keasling (UC Berkley) for hans type gave av plasmidet pJD757 13 . Dette arbeidet ble støttet delvis av National Science Foundation KARRIERE, US Air force YIP og Norman Hackman Advanced Research Program.
Name |
Company |
Catalog Number |
Comments |
Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs |
M0530S |
|
Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs |
C2527I |
|
Luria Bertani |
VWR |
90003-350 |
|
Bacto Agar Media |
VWR |
||
kanamycin sulfate |
VWR |
||
IPTG |
VWR |
EM-5820 |
|
Imidazole |
VWR |
EM-5720 |
|
Urea |
VWR |
EM-9510 |
|
Dithiothreitol (DTT) |
Fisher |
BP172-5 |
|
Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science |
11836153001 |
|
DPBS |
VWR |
82020-066 |
|
Brilliant Blue R |
Acros Organics |
A0297990 |
|
Sodium Azide |
Fisher |
AC190380050 |
Caution, highly toxic |
Horseradish peroxidase |
Sigma |
P8125-5KU |
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher |
AC408460250 |
Caution, highly toxic |
phenol |
Fisher |
AC149340500 |
Caution, highly toxic |
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher |
AC180340050 |
Caution, highly toxic |
n-heptane |
Acros Organics |
120340010 |
|
[header] | |||
Shaker/Incubator |
Fisher Scientific |
Max Q 6000 |
|
Centrifuge |
Sorvall |
RC 6 |
|
Sonicator |
QSonica |
Misonix 200 |
|
Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra |
UFC903024 |
|
Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5248-01 |
|
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5156-01 |
|
Plate reader |
Molecular Devices |
SpectraMax Gemini EM |