Мы представляем синтез сплит-интеин опосредованного белка гидрогеля. Строительные блоки этом гидрогель две белковые Сополимеры каждая из которых содержит субъединицу тримерного белка, который служит в качестве сшивающего агента и одной половине разделенной интеина. Смешивание двух сополимеров белка вызывает интеин реакцию транс-сплайсинга, уступая полипептидную блок, объединяющаяся в гидрогеля. Этот гидрогель весьма рН и температуры стабильной, совместимый с органическими растворителями, и легко включает в себя функциональные глобулярных белков.
Мы представляем синтез высокостабильного гидрогеля белка при посредничестве сплит-интеин катализируемой белком реакции транс-сплайсинга. Строительные блоки этом гидрогель две белковые блок-сополимеры, содержащие каждый субъединицу тримерного белок, который служит в качестве сшивающего агента и одной половине разделенной интеина. Высоко гидрофильный статистического клубка вставлен в один из блок-сополимеров для удержания воды. Смешение двух блочных белок сополимеров вызывает интеин реакцию транс-сплайсинга, уступая полипептидную блок с сшивателей с обоих концов, что быстро объединяющаяся в гидрогеля. Этот гидрогель является очень стабильным при обеих кислотных и основных условиях, при температурах до 50 ° C, и в органических растворителях. Гидрогелевые быстро реформы после разрыва сдвига, вызванных. Включение в "Док-станция для пептида" в гидрогель строительного блока позволяет удобно включение «стыковки белка"-меченых белков-мишеней.Гидрогель совместим с роста среды культуры ткани, поддерживает диффузию молекул 20 кДа, и дает возможность иммобилизации биологически активных глобулярных белков. Применение интеин-опосредованного белком гидрогеля в качестве органического растворителя, совместимого биокатализатора была продемонстрирована путем инкапсуляции пероксидаза хрена фермента и подтверждающих его активность.
Гидрогели, сделанные полностью из белков нести потенциал, чтобы значительно продвинуться таких различных областях, как тканевой инженерии, доставки лекарств и biofabrication 1. Они предлагают преимущества перед традиционными синтетические полимерные гидрогели включая биосовместимости и потенциал для неинвазивного поддержки включения биологически активных глобулярных белков.
В этой работе мы описываем развитие нового белка гидрогеля, образованного с помощью сплит-интеин опосредованного белка реакции транс-сплайсинга и его применение в качестве белка иммобилизации эшафот (рис. 1). Строительные блоки для этой гидрогеля два белка блок-сополимеры каждая из которых включает N-или С-концевой фрагмент раскола интеин (в и IC) и субъединицы мультимерного белка сшивателя. DnaE интеин от Nostoc punctiforme (НПУ) использовали в качестве раскола интеина 2,3 и небольшой тримера белка (12 кДа) CutA от Pyrococcus horikoshii </ EM> был использован в качестве сшивающего агента белка 4,5. Различные сшивающие агенты соединены через интеин катализируемой реакции транс-сплайсинга, что приводит к образованию высоко сшитого белкового (гидрогель). НПУ интеин был выбран из-за его быстро кинетики реакции (T 1/2 = 63 сек) и высоким выходом транс-сплайсинга (близко к 80%) 2,3. Белок CutA был выбран в качестве сшивающего агента из-за его высокой стабильности. CutA тримеры иметь температуру денатурации ближайшем 150 ° С и удерживать тримерную структуру четвертичного в растворах, содержащих целых 5 М гуанидина гидрохлорид 4,6. С субъединицы обмен между различными сшивателей является одной из основных причин физического гидрогеля эрозии поверхности 7, очень сильное взаимодействие взаимодействие субъединицы в CutA должны препятствовать такие обмены субъединиц, что приводит к более стабильной гидрогеля. Один из этих блоков содержит также высоко гидрофильный пептид S-фрагмент в качестве середине блока, чтобы облегчить водуУдержание 8.
Смешивание двух строительных блоков гидрогель инициирует реакцию транс-сплайсинга между IN и IC интеин фрагментов, создавая более длительный полипептидную цепь с сшивающими агентами на обоих терминалах. Сшивающие агенты из нескольких таких молекулярных единиц взаимодействуют друг с другом, образуя высоко сшитого сети гидрогеля (рис. 1А). Конкретный "док-станцией пептид" (DSP) включен в один из гидрогеля строительных блоков для облегчения стабильного иммобилизации "док" белка (DP)-меченый белок-мишень в гидрогеле. Использование раскола интеин опосредовать сборку гидрогеля не только обеспечивает дополнительную гибкость для синтеза белка гидрогель, но также обеспечивает высокую плотность, равномерную загрузку целевого белка в течение всего гидрогеля, как целевые белки загружены до образования гидрогеля.
Белок гидрогель интеин опосредованного весьма станцииBLE в водном растворе с небольшим до исключения любых эрозии после 3 месяцев при комнатной температуре. Стабильность сохраняется в широком диапазоне рН (6-10) и температурах (4-50 ° С), а гидрогель также совместим с органическими растворителями. Этот гидрогель используется для иммобилизации двух глобулярных белков: зеленый флуоресцентный белок (GFP) и пероксидазы хрена (HRP). Гидрогель улавливания последний белок используется для выполнения Биокатализ в органическом растворителе.
В этой работе мы показали, синтез высокостабильного интеин-опосредованной белка гидрогеля. Использование раскола интеин позволяет гидрогель быть условно образованный в ответ на смешении двух жидкофазных компонентов. В частности, раскол интеин ковалентно связывает два жидкофазных с?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы выразить признательность д-р Дэвид Tirrell (Caltech) за его любезное дар плазмиды pQE9 переменного тока 10 ATRP 12, доктор Том Мьюир (Принстонский университет) за его любезное дар плазмиды KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Доктор Такэхиса Мацуда (Канадзава технологический институт, Хакусан, Исикава, Япония) за его любезное дар плазмиды pET30-CutA-Tip1 10, и д-р Джей Д. Keasling (UC Berkley) за его любезную дар плазмиды pJD757 13 . Эта работа была частично поддержана Национальным научным фондом карьеры, ВВС США Ип и программы Норман Hackman Advanced Research.
Name |
Company |
Catalog Number |
Comments |
Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs |
M0530S |
|
Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs |
C2527I |
|
Luria Bertani |
VWR |
90003-350 |
|
Bacto Agar Media |
VWR |
||
kanamycin sulfate |
VWR |
||
IPTG |
VWR |
EM-5820 |
|
Imidazole |
VWR |
EM-5720 |
|
Urea |
VWR |
EM-9510 |
|
Dithiothreitol (DTT) |
Fisher |
BP172-5 |
|
Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science |
11836153001 |
|
DPBS |
VWR |
82020-066 |
|
Brilliant Blue R |
Acros Organics |
A0297990 |
|
Sodium Azide |
Fisher |
AC190380050 |
Caution, highly toxic |
Horseradish peroxidase |
Sigma |
P8125-5KU |
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher |
AC408460250 |
Caution, highly toxic |
phenol |
Fisher |
AC149340500 |
Caution, highly toxic |
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher |
AC180340050 |
Caution, highly toxic |
n-heptane |
Acros Organics |
120340010 |
|
[header] | |||
Shaker/Incubator |
Fisher Scientific |
Max Q 6000 |
|
Centrifuge |
Sorvall |
RC 6 |
|
Sonicator |
QSonica |
Misonix 200 |
|
Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra |
UFC903024 |
|
Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5248-01 |
|
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5156-01 |
|
Plate reader |
Molecular Devices |
SpectraMax Gemini EM |