Summary
Aanhoudende activering van remmende G-eiwit gekoppelde receptoren leidt tot een sensibilisering van adenylylcyclase signalering. Om de essentiële moleculaire pathways identificeren nonbiased stappen noodzakelijk zijn, maar deze strategie vereist de ontwikkeling van een schaalbare celgebaseerde cAMP overgevoeligheid assay. Hierin beschrijven we een overgevoeligheid test voor kleine moleculen en siRNA screening.
Abstract
Sensibilisatie van adenylylcyclase (AC) signalering is betrokken bij diverse neuropsychiatrische en neurologische aandoeningen waaronder verslaving en ziekte van Parkinson. Acute activering van Gai / O-gekoppelde receptoren remt AC activiteit, terwijl aanhoudende activering van deze receptoren leidt tot heterologe sensibilisatie van AC en verhoogde niveaus van intracellulair cAMP. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze verbetering van AC respons na chronische activatie van verschillende soorten Gai / o-gekoppelde receptoren zoals dopamine D2 en μ opioïde receptoren waargenomen zowel in vitro als in vivo. Hoewel heterologe sensibilisatie van AC eerst werd gemeld vier decennia geleden, het mechanisme (s) dat dit verschijnsel ten grondslag liggen blijven grotendeels onbekend. Het ontbreken van mechanistische gegevens vermoedelijk weerspiegelt de complexiteit die betrokken zijn bij deze adaptieve respons, wat suggereert dat nonbiased aanpak zou kunnen helpen bij het identificerening de moleculaire pathways die betrokken zijn bij heterologe sensibilisering van AC. Eerdere studies hebben kinase en Gbγ signalering geïmpliceerd als overlappende componenten die het heterologe sensibilisatie van AC regelen. Om unieke en extra overlappende doelstellingen in verband met sensibilisatie van AC identificeren, is de ontwikkeling en validatie van een schaalbare cAMP sensibilisatie kwantitatieve analyse vereist voor een grotere verwerkingscapaciteit. Vorige benaderingen van sensibilisatie studeren zijn over het algemeen omslachtig waarbij continue celkweek onderhoud, alsmede een complexe methode voor het meten van cAMP dat meerdere wasstappen inhoudt. Aldus zou de ontwikkeling van een krachtige cel-gebaseerde test die kan worden gebruikt voor high throughput screening (HTS) in 384 putjes toekomstige studies te vergemakkelijken. Met twee D2 dopamine receptor cellulaire modellen (dwz. CHO-D 2L en HEK-AC6 / D 2L), hebben we 48-well assay gevoeligheid (> 20 stappen 4-5 dagen) omgezet in een vijf-step, enkele dag assay in 384-well formaat. Dit nieuwe format vatbaar is klein molecuul screening, en we tonen aan dat deze assay ontwerp ook gemakkelijk kan worden gebruikt voor omgekeerde transfectie van siRNA in afwachting gerichte siRNA bibliotheekscreening.
Introduction
Een adaptief adenylylcyclase (AC) signalering reactie bekend als heterologe-of super-overgevoeligheid werd voor het eerst ontdekt in het laboratorium van Nobelprijswinnaar dr. Marshall Nirenberg. Dr Nirenberg voorgesteld dat de waargenomen toename AC respons na chronische δ opioïde receptor activering was een mechanisme betrokken bij opiaten tolerantie en afhankelijkheid 1. Naast chronische δ opioïde receptor activatie dit neuroadaptive reactie van AC signaal komt voor na aanhoudende activatie van verscheidene andere Gai / o-gekoppelde receptoren 2. Met name veel van deze receptoren worden geassocieerd met pijn, neuropsychiatrische en neurologische aandoeningen, en omvatten μ / κ opioïde, D 2/4 dopamine, 5HT 1A en M 2/4 muscarinereceptoren 2. Naast Dr Nirenberg bevindingen, een grote hoeveelheid bewijs bestaat koppelen sensibilisering van AC signalering naar chronische opioïde receptor activering zowel
Deze studies vormen de reden voor het onderzoek van de mechanismen voor de sensibilisering van adenylylcyclase als een belangrijke neurobiologische doelwit. Ook moet de fysiologische relevantie van AC signalering 8 en het belang dat de individuele AC isovormen houden in deze adaptieve respons ook worden erkend 2,9,10. In het kader van het onderzoek, de algemene kenmerken geassocieerd met heterologe sensibilisering van de recombinante isovormen van AC parallel die kenmerken described voor het bestuderen van endogene isovormen van AC. Specifiek, heeft eerder onderzoek gevonden dat de activering van Gai / o eiwitten en daaropvolgende afgifte / omlegging βγ subeenheden belangrijkste voorwaarden voor receptor geïnduceerde sensibilisatie van AC-isovormen. Bovendien zijn een aantal studies suggereren dat het signaleren van proteïne kinasen en Gβγ subeenheden zijn betrokken bij overgevoeligheid 2,11-13. Individuele AC ook weer unieke en aparte sensibilisatie patronen 12. Zo is aanhoudende blootstelling D 2 receptoren agonisten geassocieerd met overgevoeligheid van AC1 en AC8 Ca 2 + / calmoduline stimulatie 14,15, terwijl de nauw verwante AC3 niet gesensibiliseerd 2. AC2, AC4, en AC7 zijn nauw verwant, echter alleen PKC-gestimuleerde AC2 groei robuust lichtgevoelig na langdurige blootstelling van D2 receptoren agonisten 7,14,16,17. Daarnaast AC5 en AC6 tonen een aanzienlijke mate van heterologous sensibilisatie voor Gas-en-forskoline gestimuleerde cAMP accumulatie na activatie van D 2 receptoren 14,18-20, maar lijken te verschillen in hun behoefte aan Gβγ subunit-AC interacties 21. Hoewel de meeste studies van AC sensibilisatie model cellijnen (bijv. HEK293 cellen die individuele AC-isovormen) gebruikt, blijkt dat deze bevindingen vertalen naar natieve neuronale celmodellen 4,22. Meer recent, kunnen de effecten van AC isovorm selectieve remmers van kleine moleculen die in HEK293 cellen die AC-isovormen worden vertaald in vivo gedragsonderzoek 23.
Het ontbreken van een geïdentificeerde moleculaire mechanisme voor heterologe sensibilisatie waarschijnlijk weerspiegelt de complexiteit van de adaptieve respons en de unieke regulerende eigenschappen van de individuele AC-isovormen 12. Het ontrafelen van een dergelijke complexiteit wordt verder gecompliceerd door het gebruik van de methode omslachtig thoed heeft beperkte academische onderzoekers van dienst onpartijdige benaderingen. Bijvoorbeeld, onze vorige mechanistische studies betrof het gebruik van continu gekweekte cellulaire modellen met 24 - en 48-well weefselkweek formaat 15. Gekweekte cellen werden meestal gekweekt gedurende 48 uur en vervolgens onderworpen aan agonist behandeling (2-18 uur), gevolgd door een reeks van cel wassingen en incubaties (figuur 1). AC-isovorm specifieke cAMP protocols werden vervolgens toegepast gevolgd door meting van cAMP via een omslachtige en tijdrovende [3H] cAMP bindende methodologie 15,24. De duur van begin tot eind voor elke assay algemeen vereist een totaal van vier tot vijf dagen van cel plateren gegevensanalyse (figuur 1). De toepassing van nieuwe technologieën en automatisering heeft geleid tot duidelijke verbeteringen voor sensibilisatie studies in de industriële en HTS centrum setting. Bijvoorbeeld, een groep die werkt met het National Center for Chemical Genomics meldde een tweedaagse HTS testprocedure voor het identificeren van kleine molecule inhibitoren van μ opioïd receptor geïnduceerde sensibilisatie in 1536-well formaat 25.
Het huidige artikel beschrijft onze inspanningen om een HTS-test voor studies van heterologe sensibilisatie met behulp van technologieën die beschikbaar zijn op de meeste academische onderzoeksinstellingen ontwikkelen. Deze strategie werd bereikt door de integratie van het gebruik van cryogeconserveerde cellen uit cel modellen heteroloog tot de uiting van de D2 dopamine receptor in combinatie met endogene of individuele recombinante adenylylcyclase isovormen (CHO-D 2L of HEK-AC6 / D 2 L). Om onze doorvoer te verbeteren, hebben we onze vernieuwde 48 en sensibilisatie assay (ca.> 20 treden meer dan 4-5 dagen) een vijf-stap, dag assay in 384-well formaat, dat was in wezen "mixen en te lezen". De nieuwe indeling maakt gebruik van een commercieel verkrijgbare homogene tijdopgeloste fluorescentie (HTRF) test om cAMP acc metenumulation in intacte cellen met een multi mode plaat lezer. De test is robuust en vatbaar voor kleine molecuul screening, en kunnen effectief worden toegepast voor het screenen op remmers van heterologe sensibilisatie. Daarnaast bieden wij de gegevens die het gebruik van deze test met reverse transfectie van siRNA voor gerichte of genome wide siRNA bibliotheek screening met slechts een geringe wijziging in de algemene aanpak maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uitbreiding en cryopreservatie van Assay Ready Cells
- Cultuur CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) cellen op een 15 cm 2 celkweek schotel in Ham's F12 medium aangevuld met 1,0 uM L-glutamine, 800 ug / ul G418, 300 ug / ul hygromycine, 100 U / gl penicilline, 100 ug / ul streptomycine en 10% foetaal runderserum (FBS).
- Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 totdat de cellen 90-95% confluent. Was de cellen met 10 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), en oogst de cellen door toevoeging van 3 pi cel dissociatie buffer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Resuspendeer de cellen met 12 ul van het kweekmedium en tel cellen met trypan blauw exclusie.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 pl ijskoud medium (10% dimethylsulfoxide, 90% FBS). Verdun de celsuspensie om de gewenste celconcentratie (bijv. 1-20 x 10 6 cellen / ul) bereiken.
- Aliquot 1,0 pi celoplossing elke cryovial. Incubeer de cryovials in een cel container bevriezen bij -80 ° C overnacht. Breng de cryovials een vloeibare N 2 tank voor lange termijn opslag.
2. Plating Assay Ready Cells (en Reverse transfectie Option)
- Snel ontdooien van een bevroren cryovial cellen in een 37 ° C waterbad. Wanneer cellen worden ontdooid, dragen de cellen om een 15 pl conische buis met 9 pl Opti-MEM en meng door de buis 3-5x.
- Centrifugeer de cellen bij 500 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 pl Opti-MEM.
- Tel de cellen met behulp van trypanblauwexclusie levensvatbaarheid van de cellen te bepalen en verdun de levensvatbare cellen als nodig (bv. 3 x 10 5 cellen / ul concentratie) inOpti-MEM. Plaat 10 ul / putje van cellen in een weefselkweek behandeld 384-wells plaat met behulp van een multichannel pipet.
- Maak seriële verdunningen van cAMP in Opti-MEM om een standaardcurve te schatten cAMP-productie door de cellen te genereren (volgens de aanbevelingen van de fabrikant - zie hoofdstuk 7). Voeg 10 ul / putje van de cAMP standaarden aan de plaat. Opmerking: een standaard curve kan worden bereid op een afzonderlijke plaat of blanco putjes op een van de testplaten.
- Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur en incubeer bij 37 ° C bij een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 1 uur.
3. Reverse siRNA transfectie Option *
Deze sectie is optioneel en relevant figuur 3.
- Bereid een oplossing van siRNA in RNase-vrij DDH 2 O (bijv. 0,4 pmol / pl). Voeg 5 ul aan individuele putjes van 384-well plaat, en centrifuge de plaat bij 100 xg gedurende 15 sec bij kamertemperatuur.
- Verdun Lipofectamine 2000 in Opti-MEM met een factor 0.006 (bijv. commentaar 6 pl Lipofectamine 2000 tot 1000 pl Opti-MEM), en meng door en neer te pipetteren.
- Incubeer de Lipofectamine 2000/Opti-MEM oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Voeg 5 ul van de verdunde Lipofectamine 2000/Opti-MEM oplossing voor individuele putjes van 384-wells plaat die al bevat siRNA. Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur.
- Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Plaatassay klaar cellen zoals hierboven (hoofdstuk 2) beschreven. Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur.
- Terug assayplaat naar bevochtigde incubator bij 37 ° C (5% CO 2) voor 48-96 uur zoals bepaald voor gerichte gen knock down (zie bespreking).
4. Small Molecule Screening
- Verdun het middel van belang (bijvoorbeeld. Klein molecuul-remmers) in Opti-MEM om de gewenste eindconcentraties 6x. Seriële verdunningen kan worden ingevuld met behulp van hand-held pipetten of een liquid handling station.
- Voeg 2,5 ul / putje van de testverbinding of buffer bevattende voertuig (bijv. DMSO) aan de zijkant van de wells met een multichannel pipet.
- Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur (incubatie is optioneel).
5. Persistent Agonist Behandeling
- Bereid een 600 nM (dwz. 6 keer de gewenste uiteindelijke concentratie van 100 nM) oplossing van quinpirole in Opti-MEM.
- Voeg 2,5 ul / putje van de 600 nM quinpirole oplossing aan de zijkant van de wells met een multichannel pipet.
- Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 2 uur.
6. Stimulatie van cAMP accumulatie
- Tijdens de 2 uur incubatie, bereiden de stimulation oplossing in Opti-MEM. De stimulatie oplossing bestaat uit 40 uM forskoline, 2 uM 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX), en 4 uM spiperon (alle concentraties in stap 6 worden 4x de gewenste eindconcentratie).
- Voeg 5 ul / putje van de stimulatie oplossing aan de zijkant van de wells met een multichannel pipet.
- Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
7. Afschrikken en Schatting van cAMP accumulatie
- De productie van cAMP door de cellen wordt gemeten met de cAMP dynamische 2 kit volgens instructies van de fabrikant. In het kort, reconstrueren anti-cAMP-cryptaat en cAMP-d2 in gedestilleerd water. Freeze fracties bij -20 ° C gedurende korte termijn opslag.
- Verdun een aliquot van anti-cAMP-cryptaat en een aliquot van cAMP-D2 afzonderlijk in de lysis buffer volgens de instructies van de fabrikant be-oplossingen.
- Eendd 10 ul / putje van anti-cAMP-cryptaat werkende oplossing en 10 gl / putje van de cAMP-d2 werkoplossing de 384-wells plaat met een multichannel pipet.
- Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Lees de plaat in een fluorescentieplaatlezer (automatische schaal instelling voor gevoeligheid) met behulp van een excitatie van 337 nm en bij 620 nm en 665 nm per maatregel de uitstoot produceert instructies.
- Solliciteer ratiometrisch analyse om te beoordelen cAMP standaard curve per instructies van de fabrikant. De resulterende waarden extrapoleren de geschatte cAMP in de test wells met gegevensanalyse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deel I. Het ontwikkelen van een 384 goed heterologe overgevoeligheid test voor het identificeren van kleine molecule inhibitoren met een algemeen verkrijgbare cel model.
Om heterologe sensibilisatie studeren in een cel model, hebben we een aantal verbeteringen die ons in staat om de test te stroomlijnen in een "mix en lees" formaat. Enkele belangrijke aanpassingen zijn hieronder aangegeven en worden in meer detail in de discussie. De eerste belangrijke stap wijzigde onze celkweek continu gekweekte cellen gecryopreserveerd cellen 26. We hebben nu routinematig cultuur batches van cellen die kunnen worden gecryoconserveerd bij concentraties tussen 1-20 x 10 6 cellen / ul. Voor elke respectieve assay worden cellen voorraden ontdooid, verdund, geteld en dan direct uitgeplaat in 384 putjes. Waardoor de noodzaak van een cultuurperiode en vergroten het gemak van de test. Het formaat van onze vorige overgevoeligheid test gebruikt 48-well tissue cultuur platen, en betrokken een aantal wassen, decanteren, overdracht stappen, en een-filtratie gebaseerd [3 H] cAMP binding assay (figuur 1). Dus dit formaat voor sensibilisatie niet vatbaar high throughput toepassingen. Daarom hebben we uitgeoefende aanzienlijke inspanningen om de test eerst stroomlijnen een 96 putjes en vervolgens een 384-well formaat amendeerbaar voor high throughput screening. De optimalisatie betrokken eliminatie van wasbehandelingsstappen en evaluatie van meerdere soorten van cultuur / assayplaten, variërend cel dichtheden, en verschillende periodes incubatie. We onderzochten ook verschillende methodologieën voor cAMP detectie en vond dat het goed gekarakteriseerde HTRF cAMP technologie die gebruikt wordt in het huidige protocol was zeer reproduceerbaar, betrouwbaar en uiterst stabiel. Deze assay platform is gebaseerd op immunocompetition tussen de cAMP geproduceerd door de cellen en gelabeld cAMP (dwz. CAMP-d2) die door de kit. We hebben nu met succes ontwikkeld en toegepast protocollen voor heterologe SENSITnisatie in 384-well formaat die in wezen "mix en lees" (rechter paneel Figuur 1).
Onze eerste doel was om een high-throughput D 2L-receptor overgevoeligheid test met behulp van in de handel verkrijgbare CHO-D 2L cellen (humane DRD 2L, toegangsnummer: NM_000795) genereren dat endogeen uiten AC6 en AC7 27. Gecryopreserveerde CHO-D 2L cellen werden uitgeplaat bij 3000 cellen / putje in een 384-well weefselkweek plaat en werden geëquilibreerd gedurende 1 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator. De platen werden uit de incubator toenemende concentraties van de D2 agonist quinpirole toegevoegd bij kamertemperatuur. De cellen werden vervolgens gedurende 2 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator. Cyclisch AMP ophoping werd geïnitieerd door de toevoeging van 10 uM forskoline (een directe activator van AC). De cAMP steraccumulatiebuffer bevatte een fosfodiesteraseremmer, isobutylmethylxanthine (IBMX), Alsmede de D2-antagonist, spiperon (1 uM, Ki voor D, 2L = 0,07 nM), teneinde residuele D 2 receptoractivering dat ze tijdens de cAMP accumulatie periode. De cellen werden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. De test werd beëindigd door toevoeging van een lysisbuffer die de cAMP HTRF reagentia. De studies blijkt dat een 2 uur voorbehandeling met quinpirole verbeterde latere forskoline gestimuleerde cAMP accumulatie in een dosis-afhankelijke wijze die met heterologe sensibilisatie (Figuur 2A). De resultaten van dit experiment tonen aan dat sensibilisatie assays in een 384-well formaat kan worden uitgevoerd. De nieuwe testformaat verminderde het aantal stappen van meer dan 20-4 treden zonder dat wassen of decanteren stappen waardoor het een "mix en door" assay (figuur 1).
De tweede reeks experimenten onderzocht of deze nieuwe gestroomlijnde assay kan worden gebruikt om eenssess remmers van sensibilisatie in de CHO-D 2L model. Gecryopreserveerde CHO-D 2 L-cellen werden uitgeplaat in een 384 well weefselkweek plaat bij een dichtheid van 3000 cellen / putje in Opti-MEM. Bekend D 2-antagonisten werden toegevoegd aan D blok 2-receptor geïnduceerde sensibilisatie. Opti-MEM bevattende 100 nM quinpirole (eindconcentratie) werd vervolgens toegevoegd tot een totaal volume van 15 pl en de cellen werden gedurende 2 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator. Na de incubatie werd cAMP gestart door de directe toevoeging van forskoline (10 uM eindconcentratie), en werd de test beëindigd en cAMP gemeten met HTRF. De eerste resultaten bleek dat voorbehandeling met spiperon of haloperidol (prototypische D 2-antagonisten) volledig verhinderd quinpirole geïnduceerde overgevoeligheid van forskoline gestimuleerde cAMP accumulatie (Figuur 2B). Deze resultaten bieden bevestiging dat deze benadering kan worden gebruikt om te identificeren kleinemolecule inhibitoren van D2-receptor geïnduceerde sensibilisatie. In een tweede experiment hebben we deze methode om de sterkte van een reeks D2-antagonisten beoordelen om te testen of deze verbindingen remmen sensibilisatie. Net als bij de vorige resultaten, deze studies aangetoond dat het D2-antagonisten geremd agonist veroorzaakte sensibilisatie op een dosis afhankelijke wijze (Figuur 2C). De rangorde van de potentie voor remming van overgevoeligheid was consistent met hun acties als D 2-receptor antagonisten en hun eerder beschreven farmacologie bij D 2-receptoren 28.
Deel II. Toepassing van de 384-wells sensibilisatie assay voor omgekeerde transfectie van siRNA in screening inspanningen.
Het volgende doel was om een 384-well sensitisatie test die kan worden gebruikt om schaalbare omgekeerde transfectie siRNA bibliotheekscreening conduct. Voorlopige studies warenuitgevoerd met een HEK cel model dat heteroloog uitdrukt zowel D 2L dopaminereceptoren (rat DRD 2L, toegangsnummer: NM_012547) en AC6 (rat ADCY6, toegangsnummer: NC_005120) (dwz HEK-AC6 / D 2L cellen). De eerste experimenten onderzocht het vermogen agonist geïnduceerde sensibilisatie van AC demonstreren de cellijn. In het kort werden gecryopreserveerde AC6 / D 2L cellen uitgeplaat (1.000 cellen / putje) in een 384-well weefselkweek plaat. Opti-MEM dat 1 uM quinpirole (eindconcentratie) werd toegevoegd tot een totaal volume van 15 pl en de cellen werden gedurende 2 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator. Na de incubatie werd cAMP gestart door de toevoeging van toenemende concentraties forskoline. De test werd beëindigd door toevoeging van lysisbuffer die de HTRF reagentia. De resultaten openbaarden dat blootstelling van cellen aan de agonist quinpirole 2 uur tot een duidelijke verbetering van forskoline-gestimuleerde cAMP accumulatie (Figuur 3A). De verhoogde accumulatie van cAMP zowel 100 nM en 300 nM forskoline was groter dan 15-voudig in vergelijking met draagstof behandelde cellen (Figuur 3A).
Vervolgens gebruikten we gepubliceerd siRNA methodologieën 29,30 onze optimalisatie inspanningen die een beoordeling van de verschillende reverse voorwaarden transfectie opgenomen begeleiden (bijv. transfectiereagentia, transfectie-efficiëntie, celdichtheid, incubatietijd, enz.). Voorlopige studies gebruikten siGloRed, een indicator van transfectie in combinatie met Lipofectamine 2000 optimale reverse transfectie omgevingsomstandigheden. De experimenten toonden aan dat 2-4 pmol siRNA / 5 ul H2O gecombineerd met 0,03 pi Lipofectamine 2000/5 pl Opti-MEM leverde een bijna 95% transfectie efficiëntie op 72 uur zonder waarneembare toxiciteit in HEK-cellen (gegevens niet getoond). Vervolgens hebben we het effect van Gαs siRNA op heterologe sensibilisatie onderzochtforskoline gestimuleerde cAMP accumulatie in AC6 / D 2L cellen. De Gas siRNA werd voorgesteld als een mogelijke positieve controle omdat Gαs is geïdentificeerd als een belangrijke component van heterologe overgevoeligheid voor verscheidene AC-isovormen (dwz AC1, AC2, AC5, en AC6) 19-21. Bovendien is de 15-voudig sensibilisatie signaal in onze AC6 / D 2L cellen bij (figuur 3A) verschaft een sterk signaal ruis venster om de efficiëntie van reverse transfectie beoordelen. Met de hierboven beschreven voorwaarden aangevuld wij vooronderzoek beoordelen Gαs siRNA als een positieve controle, en de resultaten toonden een sterke blokkade (> 90%) van de sensibilisatie (gegevens niet getoond).
De dramatische siRNA-geïnduceerde reductie van de sensibilisatie signaal biedt een geschikte positieve controle voor de siRNA screening. Om een meer kwantitatieve beoordeling krijgen voor siRNA screening van AC heterologe sensibilisatie, we gegenereerde data waaropeen Z-factor werd berekend voor een aantal testomstandigheden met de AC6 / D 2L cellen 31. Voor dit experiment combineerden we 2 pmol siRNA Gαs of de niet gerichte siRNA beheersing in 5 ui met 0,03 pi Lipofectamine 2000/5 pl Opti-MEM per putje in een 384-well plaat (totaal volume 10 ui). Gecryopreserveerd cellen werden ontdooid, opnieuw gesuspendeerd in Opti-MEM en vervolgens toegevoegd aan afzonderlijke putjes die siRNA / Lipofectamine mengsel met verschillende celdichtheden (dwz. 500-5000 cellen/10 ul / putje). De duur van quinpirole behandeling (2 uur versus 18 uur) en de eindconcentratie van forskoline (100-300 nM) werden onderzocht in onze AC6 / D 2L overgevoeligheid test. De resultaten van deze experimenten bleek dat een stabielere Z-factor werd verkregen onder de volgende omstandigheden: 750 cellen / putje, 72 uur transfectie duur 2 uur quinpirole behandeling en 300 nM forskoline op cAMP accumulatie (Figuur 3B) stimuleren. Onder deze conditions We verkregen een 15-voudig sensibilisatie respons die werd verminderd met 94% in aanwezigheid van Gαs siRNA (Z 'van 0,6 voor Gαs siRNA vs. controle siRNA).
Figuur 1. In de traditionele vorm, worden cellen uitgeplaat in een 48 putjes en gekweekt tot confluentie in 48 uur. Het kweekmedium wordt gedecanteerd, kleine molecule inhibitoren toegevoegd, gevolgd door toevoeging van de D2 agonist. Na 2 uur incubatie wordt testmedium gedecanteerd en de cellen worden onderworpen aan een serie was / decanteren stappen. Vervolgens AC gestimuleerd en de cellen worden gelyseerd. Cyclisch AMP accumulatie wordt vervolgens beoordeeld met behulp van [3H] cAMP bindingstest die een 2 daagse test die een filtratiestap en scintillatietelling. Terwijl de 96 putjes Eliminated veel van het wassen en decanteren stappen, vonden we dat dit formaat was niet gemakkelijk vatbaar voor HTS of automatisering. De HTS format gebruikt gecryopreserveerd cellen die direct uitgeplaat in 384 putjes. Deze gecryopreserveerde cellen zijn "assay klaar" na een 1 uur equilibratie. Na deze incubatieperiode kan kleine molecule inhibitoren worden toegevoegd gevolgd door de toevoeging van D2 agonist voor 2 uur incubatie. AC wordt gestimuleerd en de cellen worden gelyseerd met behulp van de HTRF detectiereagentia de testplaat.
Figuur 2. Gecryopreserveerde CHO-D 2L cellen werden direct uitgeplaat in 384 en testplaten bij 3000 cellen / putje en geëquilibreerd gedurende 1 uur. A.) Toenemende concentraties van de D2 agonist, quinpirole, toegevoegd en cellen werden gedurende 2 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator. Cyclisch AMP accumulatie werd gestimuleerd met 10 uM forskoline (eindconcentratie) in aanwezigheid van spiperon en IBMX gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het reactiemengsel werd afgeschrikt met HTRF cAMP assay reagentia (n = 1, representatief voor ten minste 3 experimenten). Gegevens zijn uitgedrukt als een percentage respons van met hulpmiddel behandelde cellen. B.) CHO D-2L cellen werden voorbehandeld in afwezigheid (controle) of aanwezigheid van de aangegeven D2 receptorantagonisten (bijvoorbeeld spiperon of haloperidol). Quinpirole (100 nM) werd toegevoegd en de cellen werden gedurende 2 uur sensibilisatie veroorzaken. AC werd gestimuleerd met 10 uM forskoline (eindconcentratie) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Cyclisch AMP werd bepaald met HTRF. Gegevens zijn uitgedrukt als een percentage respons van met hulpmiddel behandelde cellen. C.) CHO-D 2L cellen werden voorbehandeld in afwezigheid (controle =100%) of aanwezigheid van toenemende concentraties van aangegeven D2 receptorantagonisten. Quinpirole (100 nM) werd toegevoegd en de cellen werden gedurende 2 uur sensibilisatie veroorzaken. AC werd gestimuleerd met 10 uM forskoline (eindconcentratie) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Cyclisch AMP werd bepaald met HTRF. De gegevens worden uitgedrukt als een percentage van de-quinpirole geïnduceerde sensibilisatie respons. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Gecryopreserveerde werden HEK-AC6 / D 2L cellen uitgeplaat met 1000 cellen / putje en geëquilibreerd gedurende 1 uur. A) Cellen werden geïncubeerd met drager of 100 nM quinpirole gedurende 2 uur in een bevochtigde incubator. AC was gestimuleerd met toenemende concentraties forskoline gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Cyclisch AMP werd bepaald met behulp HTRF. B.) Reverse transfectie van Gαs siRNA blokken sensibilisatie in AC6 / D 2L cellen. Gαs siRNA of nontargeting siRNA controle (2 pmol) werd met 0,03 gl Lipofectamine2000 (Lipo) in een totaal volume van 10 pl, en de oplossing werd aan afzonderlijke putjes toegevoegd in een 384-well plaat. Gecryopreserveerde AC6 / D 2L cellen werden vervolgens toegevoegd voor omgekeerde transfectie en gedurende 70 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator. De D2 receptoragonist, quinpirole (1 uM final) of vehikel werd toegevoegd gevolgd door 2 uur incubatie. Cyclisch AMP accumulatie werd gestimuleerd met 300 nM forskolin (uiteindelijke concentratie) gedurende 1 uur en gemeten met behulp HTRF. Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In een poging om studies van heterologe sensibilisatie te vergemakkelijken, hebben we behoorlijk gemodificeerd onze vorige methode het bereiken van een gestroomlijnd "mix en lees" formaat dat amendeerbaar naar high-throughput screening en werkingsmechanisme onderzoek. De belangrijkste wijzigingen in ons protocol kan als volgt worden samengevat: 1) het gebruik van cryogeconserveerde cellen als "test klaar" reagentia, 2) de miniaturisatie van de assay in 384 putjes, en 3) het gebruik van de meting van HTRF cAMP.
De goedkeuring van cryopreservatie voor onze cel-gebaseerde testen is sterk verbeterd de efficiëntie en reproduceerbaarheid voor onze dagelijkse experimenten en screening inspanningen. Deze aanpak is een industrie standaard, en kan gemakkelijk worden vertaald naar het academisch onderzoek instellen 26. Om celcultuur efficiëntie te verbeteren, zijn flesjes van cellen die worden gebruikt als "off the shelf reagentia" in die cel voorraden worden ontdooid, verdund en vervolgens direct uitgezet in 384-wells platen for elke test. We hebben eerder opgenomen cryogeconserveerde cellen in studies gericht op het identificeren van antagonisten van ongewervelde G-eiwit gekoppelde receptoren 32,33. Deze methodiek was gunstig omdat het eerste werk niet werd uitgevoerd in ons laboratorium en noodzakelijk transport van gekweekte cellen over de campus die uitdagingen gepresenteerd en waarschijnlijk geïntroduceerd variabiliteit. Gebruik makend van onze nieuwe aanpak, bevroren cellen kunnen nu direct worden ontdooid en verdund op het terrein van voor de aanvang van de test. Naast het verbeteren van de reproduceerbaarheid, cryopreservatie eveneens geëlimineerd de 48 hr periode van cel plating tot uitvoering assay (figuur 1). We hebben met succes toegepast cryopreservatie benadering stabiele en transiënte transfectie studies met verschillende recombinante receptoren en subtypes van ACs met functionele uitlezingen zoals cAMP en β-arrestine rekrutering (Brust, TF, Ejendal, KFK en Watts, VJ gepubliceerde waarnemingen) . DesPite onze positieve ervaringen tot nu toe, moet de onderzoekers controleren of hun receptor of doel, en model mobiele systeem is compatibel met cryopreservatie hebben alvorens de grootschalige studies.
Een tweede wijziging die belangrijk zijn voor onze inspanningen om de sensibilisatie assay betrokken eliminatie van decanteren stroomlijnen en te wassen stappen (figuur 1) was. Deze veranderingen waren gelijktijdig met onze miniaturisering van de bepaling om een 96-well formaat (Conley en Watts, ongepubliceerde waarnemingen). Specifiek werd een gemodificeerd protocol ontwikkeld overgevoeligheid waar cAMP werd geïnitieerd door de directe toevoeging van forskoline in assaybuffer volgende D2 agonist incubatie in afwezigheid van wassen of decanteren stappen (zie middenpaneel figuur 1). Bovendien, de cAMP accumulatie buffer bevatte een relatief hoge concentratie spiperon (1 uM), een D2 antagonist die een Ki-waarde van 0,07 nM voor D 2 isreceptoren 15. Deze 100 voudige overmaat concentratie van spiperon in volledige D 2-receptor bezetting tijdens de cAMP accumulatie fase, waardoor de resterende D 2-receptor activering door agonisten (bijv. quinpirole) zich verzet tegen tijdens de forskolin gestimuleerd AC stap 15. Deze verandering elimineerde de drie decanteren en drie wassen stappen na de eerste agonist incubatie. Als onderdeel van de 96-well formaat ontwikkelen, hebben we ook de definitieve hevel stap voor doven en het lyseren van de cellen te elimineren. Deze modificatie werd uitgevoerd door de concentratie van onze lyserende reagens (bijvoorbeeld trichloorazijnzuur;. TCA) 3-9% en het reagens direct toevoegen aan de cAMP accumulatie buffer. De veelbelovende resultaten van de gemodificeerde 96 en overgevoeligheid assay ondersteunden de omzetting van de sensibilisatie assay een 384 putjes. Helaas, onze vorige methode voor het kwantificeren van cAMP was een moeizaam filtration-based [3H] cAMP eiwitbindingassay (> 5 stappen). Zo wordt de test meestal vervuld in de loop van twee dagen om voor filter drogen en scintillatietelling 15,24. Deze nadelen die de [3H] cAMP eiwitbinding onpraktisch te gebruiken voor een high throughput 384 putjes.
De derde belangrijke ontwikkeling kwam door incorporatie van methoden voor het meten en kwantificeren van cAMP op een wijze die vatbaar is voor 384-well formaat. Bijvoorbeeld, we hebben veel ervaring met behulp van een cAMP Response Element (CRE)-luciferase reporter gebaseerde systeem voor relatieve cAMP metingen in een 384-well formaat 32,33. Hoewel deze aanpak is met succes gebruikt door onze laboratorium voor vele studies van Gαs-gekoppelde receptoren, CRE-luc reporters zijn onderhevig aan een aantal valse positieven en negatieven bij screening assays 34. Bovendien, onze voorlopige D 2 overgevoeligheid studies met deze appvoorn niet bemoedigend dat we waargenomen klaarblijkelijke feedback inhibitie van het luciferase-signaal (gegevens niet getoond). Daarom hebben we onze inspanningen gericht op de uitvoering van GloSensor cAMP technologie door de bouw en karakteriseren van stabiele cellijnen met behulp van zowel hun "eerste" en "tweede" generatie GloSensor vectoren. De GloSensor is een aangelegde luciferase reporter die een cAMP bindende plaats in het luciferase-eiwit 35. Hoewel het systeem is zeer nuttig voor kinetische cAMP kwantificering was de werkwijze niet effectief voor het meten van door agonist veroorzaakte sensibilisatie (Conley en Watts, ongepubliceerde waarnemingen). We onderzochten ook een BRET gebaseerd cAMP biosensor 36 voor onze studies als een kosteneffectieve manier om cAMP te beoordelen. Helaas, de achtergrondruis gekoppeld aan de tijdelijk getransfecteerde biosensor beperkt mogelijk om deze methode aan de onze sensibilisatie assay. Ten slotte hebben we geëvalueerd verschillende kits gebruik homogene tijd opgelost fluorEscence (HTRF) als een benadering van cAMP meten 384 putjes. We vonden dat dit geaccepteerde methodiek was het meest compatibel met academische laboratoria en screening faciliteiten in dat ze robuust, gevoelig, stabiel en makkelijk te gebruiken. Het voornaamste nadeel academische onderzoekers is de kosten van de reagentia, maar bulk aankoop van reagentia en miniaturisatie 384 putjes maakt de prijs meer dan concurrerende andere kits, zoals ELISA-gebaseerde testen en onze eerdere "zelfgemaakte" [3H] cAMP eiwit bindingstest 15.
De vertegenwoordiger werk toont de toepasselijkheid van de 384-wells sensibilisatie assay studies van D2 dopamine receptor geïnduceerde overgevoeligheid van AC signalering in recombinant cellijnen. In verschillende voorbereidende studies, hebben we deze test met kleine aanpassingen aan D2 dopamine receptor evalueren gebruikt en μ opioïde receptor geïnduceerde overgevoeligheid van verscheidene AC-isovormen (Tabel 1). Deze studies wijzen op de algemene toepasbaarheid van de 384-well assay om meerdere cellijnen, receptor subtypes, en AC-isovormen. Wie geïnteresseerd is in het ontwikkelen van soortgelijke testformaten zou worden aangemoedigd om variabelen zoals celdichtheid, agonist voorbehandeling tijden, AC activering protocollen / omstandigheden en HTRF cAMP detectiemethode voor hun cellulaire modellen te verkennen. De antagonist gegevens die hierin tonen het vermogen van de test om kleine molecule inhibitoren van sensitisatie. De potentie waarden komen overeen met die welke zijn vastgesteld met andere functionele assays 28 evenals affiniteit (Ki) waarden verkregen via radioreceptor bindingsbepalingen (zie: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php). De huidige test ontwerp zou gemakkelijk geschikt HTS inspanningen waar verbindingen via een pintool worden geleverd of worden preplated in assay klaar platen. Naast de sensibilisatie assays beschreven, moet de hier toegepaste methoden voor andere advertentie wordenaptive assays waar meerdere drugs / reagentia worden toegepast voorafgaand aan een eindpunt maatregel 384-well formaat.
We hebben geprobeerd om belangrijke stappen voor de volledige 384-well assay ontwikkeling benadrukken, maar willen ook op te merken dat de ontwikkeling van de omgekeerde transfectie siRNA assays was bijzonder uitdagend. Ons doel op lange termijn voor deze testen is om een genoom brede inspanning om de overlappende en unieke genen betrokken bij heterologe sensibilisatie van AC-isovormen identificeren voeren. Met behulp van onze eerste siRNA test als leidraad, bieden wij de volgende verkorte suggesties voor het ontwikkelen van een siRNA omgekeerde transfectie assays: (1) nagaan transfectie-efficiëntie met behulp van ratio's van een indicator zoals Siglo en transfectiereagens (. Bv Lipofectamine 2000), (2) bepalen van de optimale zaaidichtheid (bijv. 500-5000 cellen / putje), (3) staand transfectie duur (bijv. 48-96 uur), en (4) een evaluatie passende testcondities (bv. geneesmiddelen treatments, eindpunt maatregelen, en robuuste controles) voor het bereiken van een optimale signaal (bv Z 'factoranalyse). Extra detail en meer algemene informatie voor het gebruik van siRNA screening inspanningen zijn ook te vinden in de eerder verwezen methoden artikelen 29,30. Die onderzoekers die geïnteresseerd zijn in HTS inspanningen moeten ook het aanpassingsvermogen van hun analyses te verkennen om automatisering (bijv.. Pintool en robotica). Daarnaast zijn er andere factoren of besturingen voor screening inspanningen omvatten formele assay validatie, cellevensvatbaarheidsassays en passende tegenmaatregelen schermen. Voor extra begeleiding, zou de geïnteresseerde lezer wordt aangemoedigd om de NCGC Assay Guidance Manual beschikbaar via NCATS bij onderzoeken: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/.
Wij hebben onze aanpak beschreven voor het stroomlijnen moeizaam meerdaagse assay in een efficiënte "mix en door" test die in een dag kunnen worden uitgevoerd. De hier beschreven methoden en eenrecente studie van 1280 verbindingen in μopioid receptor geïnduceerde sensibilisatie in 1536-well formaat 25 suggereert dat sensibilisatie nu gemakkelijk kunnen worden opgevraagd met behulp van HTS. De beschreven test is ontvankelijk voor kleine molecule testen en kan op genetische benaderingen zoals siRNA. Onze test-formaat is gericht op de adaptieve respons bekend als heterologe sensibilisatie van AC, maar kan de algemene aanpak en methoden op grote schaal worden toegepast op andere cel-gebaseerde testen die meerdere drugs-en reagens toevoegingen (bv. desensibilisatie en neuroprotection.). Het werk hier gemeld is eenvoudig te realiseren binnen een academische instelling met meerkanaalspipetten en een multi mode plaatafleesinrichting staat is de gewenste eindpunt in 384-well formaat.
Tabel 1. Cellulaire modellen getest door agonist veroorzaakte sensibilisatie.
| Receptor | AC Isoform | Cellijn | Overgevoeligheid signaal |
| D 2L dopamine | Endogene (AC6 en AC7 27) | CHO-D 2L | 2-3 maal |
| D 2L dopamine | Recombinant AC2, AC5, en AC6 | HEK 293 stabiel getransfecteerde | AC2 = 2-3 maal AC5 = 50 voudig AC6 = 15-voudig |
| μ opioïd | Recombinant AC1, AC2 en AC5 | HEK 293 stabiel getransfecteerde | AC1 = 6-7 voudig AC2 = 2-3 maal AC5 = 10-15 voudig |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag aan de heer Richard Zink en Todd Wiernicki erkennen voor methodologische training en test begeleiding. We danken ook John Paul Spence voor zorgvuldige lezing en redactionele suggesties. Dit werk werd ondersteund door de National Institute of Health MH 060.397, Brain and Behavior Research Foundation, en Eli Lilly and Company door de Lilly Research Award Program (LRAP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384-well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase- and RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Nontargeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J.
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
