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Bioengineering

Farmaco-indotta Sensibilizzazione della ciclasi: L'ottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di siRNA e applicazioni di screening

Published: January 27, 2014 doi: 10.3791/51218
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

Summary

L'attivazione persistente del inibitori G recettori accoppiati alla proteina provoca sensibilizzazione della segnalazione ciclasi ciclasi. Per identificare le vie molecolari essenziali, sono necessari approcci nonbiased, tuttavia, questa strategia richiede lo sviluppo di una base cellulare scalabile saggio cAMP sensibilizzazione. Qui, descriviamo un test di sensibilizzazione per la piccola molecola e lo screening siRNA.

Abstract

Sensibilizzazione di adenilato ciclasi (AC) segnalazione è stata implicata in una varietà di disturbi neuropsichiatrici e neurologici compreso abuso di sostanze e il morbo di Parkinson. L'attivazione acuta di Gαi / recettori o-linked inibisce l'attività AC, mentre l'attivazione persistente di questi recettori provoca sensibilizzazione eterologa di AC e aumento dei livelli di cAMP intracellulare. Studi precedenti hanno dimostrato che questo miglioramento di reattività AC è osservato sia in vitro che in vivo in seguito all'attivazione cronica di diversi tipi di recettori / O-linked Gαi compresi D 2 della dopamina e recettori oppioidi μ. Sebbene sensibilizzazione eterologa di AC è stata segnalata per la prima di quattro decenni fa, il meccanismo (s) che sono alla base di questo fenomeno restano in gran parte sconosciute. La mancanza di dati meccanicistici presumibilmente riflette la complessità di questa risposta adattativa, suggerendo che gli approcci nonbiased potrebbero aiutare a identificarezione delle vie molecolari coinvolti nella sensibilizzazione eterologa di AC. Studi precedenti hanno implicato chinasi e segnalazione Gbγ come componenti che regolano la sensibilizzazione eterologa di AC sovrapposizione. Per identificare gli obiettivi sovrapposti unico e aggiuntivi connessi con la sensibilizzazione di AC, lo sviluppo e la validazione di una soluzione scalabile test cAMP sensibilizzazione è necessaria per una maggiore produttività. Approcci precedenti per studiare sensibilizzazione sono generalmente ingombranti coinvolge cellulare continua cultura manutenzione nonché una complessa metodologia per misurare l'accumulo di cAMP che coinvolge più fasi di lavaggio. Pertanto, lo sviluppo di un saggio basato su cellule robusto che può essere utilizzato per lo screening ad alto rendimento (HTS) in un formato ben 384 facilitare studi futuri. Utilizzando due modelli cellulari D 2 del recettore della dopamina (ad esempio. CHO-D 2L e HEK-AC6 / D 2L), abbiamo trasformato il nostro saggio di sensibilizzazione a 48 pozzetti (> 20 gradini 4-5 giorni) per un periodo di cinque-step, unico dosaggio giorno in formato 384-bene. Questo nuovo formato è suscettibile di proiezione piccola molecola, e ci dimostrano che questo motivo test può anche essere facilmente utilizzato per la trasfezione inversione di siRNA in previsione di uno screening della libreria siRNA mirati.

Introduction

Un ciclasi adattativo (AC) di segnalazione di risposta noto come-eterologo o super-sensibilizzazione è stato scoperto nel laboratorio del premio Nobel, il dottor Marshall Nirenberg. Il Dott. Nirenberg proposto che l'aumento della reattività AC osservata dopo l'attivazione dei recettori oppioidi δ cronica era un meccanismo coinvolto nella tolleranza e dipendenza da oppiacei 1. Oltre ai recettori oppioidi δ cronica, questa risposta neuroadaptive di segnalazione AC si verifica anche dopo l'attivazione persistente di diversi altri Gαi / o recettori accoppiati a 2. In particolare, molti di questi recettori sono associati con dolore, disturbi neuropsichiatrici e neurologici, e comprendono μ / κ oppioidi, D 2/4 dopamina, 5HT 1A, e M 2/4 recettori muscarinici 2. Oltre ai risultati del Dott. Nirenberg, un grande corpo di evidenze esiste collega sensibilizzazione della segnalazione AC all'attivazione cronica dei recettori oppioidi sia in vivo 3-7. Sensibilizzazione di AC è stata anche associata con una varietà di malattie che coinvolgono i recettori dopaminergici D 2-come compreso la schizofrenia e il morbo di Parkinson (per una rassegna vedi riferimento 2). Nonostante l'importanza potenziale di sensibilizzazione, il meccanismo preciso (s) associata a persistente / attivazione del recettore Gαi o accoppiato, che porta ad una maggiore reattività AC rimane in gran parte sconosciuta.

Questi studi forniscono il razionale per l'esame dei meccanismi di sensibilizzazione della ciclasi come un importante obiettivo neurobiologica. Analogamente, la rilevanza fisiologica di AC segnalazione 8 e l'importanza che le singole isoforme AC tengono in questa risposta adattativa dovrebbero essere riconosciuti 2,9,10. Nel contesto della nostra ricerca, le caratteristiche generali associati sensibilizzazione eterologa delle isoforme ricombinanti di AC paralleli tali caratteristiche described per studiare le isoforme endogeni di AC. In particolare, la ricerca precedente ha scoperto che l'attivazione di Gαi / o proteine ​​e subunità successivo rilascio / riassestamento βγ sono requisiti importanti per il recettore indotta sensibilizzazione di tutte le isoforme AC. Inoltre, diversi studi suggeriscono che la segnalazione di proteine ​​chinasi e subunità Gβγ sono coinvolti nella sensibilizzazione 2,11-13. AC individuali mostrano anche i modelli di sensibilizzazione uniche e distinte 12. Per esempio, l'esposizione persistente di D 2 recettori agonisti è associata con sensibilizzazione di AC1 e AC8 di Ca 2 + / calmodulina stimolazione 14,15, mentre la strettamente correlata AC3 non è sensibilizzata 2. AC2, AC4 e AC7 sono strettamente correlati, però, solo l'attività AC2 PKC-stimolata è robusto sensibilizzato dopo una prolungata esposizione di D 2 recettori agli agonisti 7,14,16,17. Inoltre, AC5 e AC6 mostrano una marcata grado di hetersensibilizzazione ologous a gas e forskolina stimolata cAMP accumulo a seguito di attivazione dei recettori D2 14,18-20, ma sembrano differire nella loro esigenza di Gβγ subunità-AC INTERAZIONI 21. Sebbene la maggior parte degli studi di sensibilizzazione AC hanno utilizzato linee cellulari modello (ad esempio cellule HEK293 che esprimono le singole isoforme di AC), sembra che questi risultati si traducono in modelli cellulari neuronali nativi 4,22. Più recentemente, gli effetti della isoforma AC selettivi piccole molecole inibitrici identificati in cellule HEK293 esprimenti isoforme CA possono anche essere tradotti in studi comportamentali in vivo 23.

La mancanza di un meccanismo molecolare identificato per la sensibilizzazione eterologa probabilmente riflette la complessità della risposta adattativa nonché le uniche proprietà regolazione individuale isoforme AC 12. Dipanare tale complessità è ulteriormente complicata dall'utilizzo di ingombrante metodologia tCappello ha limitato ricercatori accademici da impiegare approcci imparziali. Ad esempio, i nostri precedenti studi meccanicistici comportato l'utilizzo di modelli cellulari continuamente coltivate con 24 - e 48-ben formato coltura di tessuti 15. Cellule in coltura erano tipicamente coltivate per 48 ore e quindi sottoposti a trattamento farmacologico con agonisti (2-18 ore) seguito da una serie di lavaggi cellulari e incubazione (Figura 1). Protocolli accumulo di cAMP specifico AC-isoforma erano poi impiegato seguita dalla misurazione di accumulo di cAMP utilizzando un laborioso e richiede tempo [3 H] cAMP metodologia 15,24 vincolante. La durata dall'inizio alla fine di ciascun saggio generalmente richiesto un totale di quattro o cinque giorni da placcatura cella per l'analisi dei dati (Figura 1). L'applicazione di nuove tecnologie e l'automazione ha portato a miglioramenti marcati per gli studi di sensibilizzazione in ambiente industriale e HTS centro. Ad esempio, un gruppo di lavoro con il Centro Nazionale per Chemical Genomics ha riportato una due giorni HTS procedura di analisi per l'identificazione di piccole molecole inibitrici di μ recettori oppioidi sensibilizzazione indotta in formato 1.536-ben 25.

Il presente articolo descrive i nostri sforzi per sviluppare un test HTS per studi di sensibilizzazione eterologa utilizzando tecnologie che sono disponibili presso la maggior parte degli istituti di ricerca universitari. Questa strategia è stata realizzata incorporando l'uso di cellule crioconservati da modelli cellulari eterologhi che esprime il recettore dopaminergico D 2 in combinazione con endogeni o singoli ricombinanti isoforme ciclasi (CHO-D 2L o HEK-AC6 / D 2 L). Per migliorare il nostro rendimento, abbiamo ridisegnato la nostra sensibilizzazione test ben 48 (ca.> 20 passi oltre 4-5 giorni) per un periodo di cinque step, test solo giorno in formato 384-bene che era essenzialmente "mix e leggere". Il nuovo formato utilizza un tempo omogeneo disponibile in commercio fluorescenza risolta (HTRF) test per misurare cAMP accumulation in cellule intatte con un lettore di piastra a più modalità. Il test è robusto e suscettibili di proiezione piccola molecola, e può essere efficacemente applicata a screening per inibitori di sensibilizzazione eterologa. Inoltre, forniamo i dati che permettono l'uso di questo test con trasfezione inversione di siRNA a una vasta libreria di siRNA lo screening mirati o del genoma con solo una piccola modifica per l'impostazione generale.

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Protocol

1. Espansione e crioconservazione delle cellule Assay pronti

  1. Cultura CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) le cellule su una cella piatto 15 centimetri 2 cultura dei media F12 di Ham integrato con 1.0 mM L-glutammina, 800 mg / mL G418, 300 mg / igromicina ml, 100 U / ml penicillina, 100 pg / ml streptomicina, e siero bovino fetale al 10% (FBS).
  2. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 fino a quando le cellule sono 90-95% confluenti. Lavare le cellule con 10 microlitri tampone fosfato isotonico (PBS), e raccogliere le cellule aggiungendo 3 ml di tampone di dissociazione cellulare per 5 min a 37 ° C. Risospendere le cellule con 12 ml di media cultura e contare le celle utilizzando trypan blu.
  3. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 xg per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzi di congelamento (10% dimetilsolfossido, 90% FBS). Diluire la sospensione cellulare per raggiungere la concentrazione cellulare desiderata (ad esempio 1-20 x 10 6 cellule / ml).
  4. Aliquota 1,0 ml di soluzione di cella per ogni esageratamente. Incubare le cryovials in un contenitore cella di congelamento a -80 ° C per una notte. Trasferire le cryovials ad un serbatoio di liquido N 2 per conservazione a lungo termine.

2. Placcatura del saggio Cellule pronte (e Reverse Transfezione Option)

  1. Rapidamente scongelare un esageratamente congelata di cellule in un bagno d'acqua a 37 °. Una volta che le cellule vengono scongelate, trasferire le cellule in una provetta da 15 ml contenente 9 ml di Opti-MEM, e mescolare per inversione 3-5x.
  2. Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e sospendere nuovamente le cellule in 1 ml Opti-MEM.
  3. Contare le cellule utilizzando trypan blu per determinare la vitalità cellulare e diluire le cellule vitali, se necessario (ad es. 3 x 10 5 cellule / ml concentrazione) inOpti-MEM. La tavola 10 microlitri / pozzetto di cellule di una coltura tissutale trattata piastra a 384 pozzetti usando una pipetta multicanale.
  4. Effettuare diluizioni seriali di cAMP in Opti-MEM per generare una curva standard per stimare la produzione di cAMP da parte delle cellule (secondo le manifatture raccomandazioni - vedere la sezione 7). Aggiungere 10 microlitri / pozzetto delle norme cAMP alla piastra Nota:. Un'unica curva standard può essere preparato su una piastra separata o pozzi in bianco su una delle piastre di saggio.
  5. Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 1 ora.

3. Invertire la trasfezione di siRNA Opzione *

Questa sezione è facoltativa e pertinente alla figura 3.

  1. Preparare una soluzione di siRNA in DDH RNase-free 2 O (ad esempio 0,4 pmol / ml). Aggiungere 5 microlitri a singoli pozzetti della piastra a 384 pozzetti, e centrifugare la piastra a 100 xg per 15 SEc a temperatura ambiente.
  2. Diluire Lipofectamine 2000 Opti-MEM di un fattore 0.006 (es aggiungere 6 ml di Lipofectamine 2000 a 1000 ml di Opti-MEM), e mescolare pipettando su e giù.
  3. Incubare la soluzione Lipofectamine 2000/Opti-MEM per 5 min a temperatura ambiente. Aggiungere 5 ml di soluzione diluita Lipofectamine 2000/Opti-MEM a singoli pozzetti della piastra a 384 pozzetti che contiene già siRNA. Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente.
  4. Incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Saggio Piatto cellule pronte come descritto in precedenza (sezione 2). Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente.
  6. Ritorno piastra di saggio di incubatore umidificato a 37 ° (CO 5% 2) C per 48-96 ore, come determinato per il gene targeting abbattere (vedi la discussione).

4. Piccolo Screening Molecola

  1. Diluire il farmaco di interesse (es. inibitori. Piccole molecole) in Opti-MEM a 6x le concentrazioni finali desiderati. Diluizioni seriali possono essere completate con pipette a mano o una stazione di gestione dei liquidi.
  2. Aggiungere 2,5 ml / pozzetto di composto di prova o tampone contenente veicolo (ad es DMSO) al lato dei pozzetti usando una pipetta multicanale.
  3. Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente (incubazione è opzionale).

5. Persistente Agonista Trattamento

  1. Preparare una 600 nm (per esempio. 6 volte la concentrazione finale desiderata di 100 nm) soluzione quinpirole in Opti-MEM.
  2. Aggiungere 2,5 ml / pozzetto di soluzione quinpirole 600 nM al lato dei pozzetti usando una pipetta multicanale.
  3. Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 2 h.

6. La stimolazione di cAMP Accumulation

  1. Durante l'incubazione 2 ore, prepara le stimulatisulla soluzione Opti-MEM. La soluzione di stimolazione è composto da 40 mM forskolina, 2 mM 3-isobutil-1-methyxanthine (IBMX), e 4 mM spiperone (tutte le concentrazioni nel passaggio 6 sono 4x la concentrazione finale desiderata).
  2. Aggiungere 5 microlitri / pozzetto della soluzione stimolazione al lato dei pozzetti usando una pipetta multicanale.
  3. Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente, e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.

7. Tempra e stima di cAMP Accumulation

  1. Produzione di cAMP da parte delle cellule è misurata utilizzando il kit dinamico 2 cAMP secondo le istruzioni del produttore. In breve, ricostituire anti-cAMP-criptato e cAMP-d2 in acqua distillata. Congelare aliquote a -20 ° C per la conservazione a breve termine.
  2. Diluire un'aliquota di anti-cAMP-criptato e un'aliquota di cAMP-d2 separatamente nel tampone di lisi secondo le istruzioni del produttore per rendere soluzioni di lavoro.
  3. Lagg 10 microlitri / pozzetto della soluzione di lavoro anti-cAMP-criptato e 10 microlitri / pozzetto della soluzione di lavoro cAMP-d2 alla piastra a 384 pozzetti usando una pipetta multicanale.
  4. Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente, e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
  5. Leggere la piastra in un lettore di piastre a fluorescenza (impostazione scala automatica della sensibilità), utilizzando una eccitazione di 337 nm, e misurare le emissioni a 620 nm e 665 nm per manufatti istruzioni.
  6. Applicare analisi raziometrica per valutare curva standard cAMP produce per le istruzioni. Utilizzando i valori risultanti, estrapolare l'accumulo di cAMP stima nei pozzetti utilizzando il software di analisi dei dati.

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Representative Results

Parte I. Lo sviluppo di una 384 ben eterologa saggio di sensibilizzazione per l'identificazione di piccole molecole inibitrici utilizzando un modello cellulare disponibile in commercio.

Per studiare sensibilizzazione eterologa in un modello cellulare, abbiamo fatto una serie di miglioramenti che ci hanno permesso di snellire l'analisi in un formato "mix e leggere". Varie modifiche chiave sono evidenziati di seguito, e sono descritti in maggior dettaglio nella discussione. Il primo passo fondamentale è stato modificando la nostra cultura di cellule da cellule coltivate continuamente alle cellule crioconservati 26. Siamo ormai di routine lotti di cultura di cellule che possono essere crioconservati a concentrazioni tra 1-20 x 10 6 cellule / ml. Per ciascuna rispettiva analisi, le scorte cellulari sono scongelati, diluiti, contati, e poi seminati direttamente in piastre da 384 pozzetti. Eliminando la necessità di un periodo di coltura e aumentando la convenienza del dosaggio. Il formato del nostro precedente test di sensibilizzazione utilizzato tiss 48 pozzettipiastre di coltura ue, e ha coinvolto un numero di lavaggio, decantare, fasi di trasferimento, e una base di filtrazione-[3 H] saggio di legame (Figura 1) cAMP. Così, questo formato per la sensibilizzazione non era suscettibile di applicazioni ad elevato throughput. Pertanto, abbiamo esercitato notevoli sforzi per razionalizzare il test prima di un 96-bene e poi un formato di 384 pozzetti modificabili a screening ad alto rendimento. L'ottimizzazione coinvolti eliminazione delle fasi di lavaggio e la valutazione dei diversi tipi di lastre cultura / saggio, diverse densità cellulari, e diversi periodi di incubazione. Abbiamo anche esplorato diverse metodologie per il rilevamento cAMP e abbiamo trovato che la tecnologia HTRF cAMP ben caratterizzato utilizzata nel presente protocollo era altamente riproducibile, affidabile ed estremamente stabile. Questa piattaforma dosaggio si basa sulla immunocompetition tra il cAMP prodotta dalle cellule ed etichettato cAMP (es. CAMP-d2) fornito dal kit. Ora abbiamo sviluppato con successo ed i protocolli richiesti SENsit eterologazione in formato 384-bene che sono essenzialmente "mix e leggere" (pannello di destra Figura 1).

Il nostro obiettivo iniziale era quello di generare un high-throughput D 2L sensibilizzazione del recettore test utilizzando disponibili in commercio cellule CHO-D 2L (DRD 2L umana, numero di registrazione: NM_000795) che endogena esprimono AC6 e AC7 27. Cellule CHO-D 2L crioconservati sono state piastrate a 3000 cellule / pozzetto in una piastra di coltura tissutale da 384 pozzetti, e sono state equilibrate per 1 ora a 37 ° C in un incubatore umidificato. Le piastre sono state rimosse dall'incubatore e concentrazioni crescenti di agonista D 2 quinpirole sono stati aggiunti a temperatura ambiente. Le cellule sono state poi incubate per 2 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato. Ciclico accumulo AMP è stata poi iniziata mediante l'aggiunta di 10 mM forskolina (un attivatore diretta di AC). Il buffer di accumulo di cAMP conteneva un inibitore della fosfodiesterasi, isobutylmethylxanthine (IBMX), Così come il D 2 antagonista, spiperone (1 pM, K i di D, 2L = 0,07 nM), per escludere residuo D 2 attivazione del recettore nel periodo di accumulo di cAMP. Le cellule sono state incubate a temperatura ambiente per 1 ora. Il saggio è stato interrotto tramite l'aggiunta di un tampone di lisi contenente i reagenti HTRF cAMP. Gli studi hanno rivelato che un pretrattamento 2 ore con quinpirole migliorata conseguente accumulo di cAMP forskolina stimolata in modo dose-dipendente coerente con sensibilizzazione eterologo (Figura 2A). I risultati di questo esperimento dimostrano che saggi di sensibilizzazione possono essere eseguite in un formato 384 pozzetti. Il nuovo formato di saggio ridotto il numero di passaggi da più di 20 a 4 passi senza la necessità di lavaggio o decantare passi rendendolo un "mix e leggere" test (Figura 1).

La seconda serie di esperimenti esplorato se questo nuovo saggio razionalizzato potrebbe essere utilizzato per uninibitori ssess di sensibilizzazione nel modello CHO-D 2L. Crioconservati CHO-D 2 L cellule sono state piastrate in una piastra di coltura ben 384 tessuto ad una densità di 3000 cellule / pozzetto in Opti-MEM. Conosciuti D 2 antagonisti sono stati aggiunti per bloccare D 2 sensibilizzazione recettore indotta. Opti-MEM contenente 100 nM quinpirole (concentrazione finale) è stato quindi aggiunto un volume totale di 15 microlitri, e le cellule sono state incubate per 2 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato. Dopo l'incubazione, l'accumulo di cAMP è stato avviato con l'aggiunta diretta di forskolina (10 micron concentrazione finale), e il test è stato chiuso e cAMP misurata con HTRF. I primi risultati hanno rivelato che il pretrattamento con spiperone o aloperidolo (D prototipico 2 antagonisti) completamente impedito sensibilizzazione quinpirole indotta di forskolina stimola l'accumulo di cAMP (Figura 2B). Questi risultati forniscono convalida che questo approccio può essere utilizzato per identificare piccoleinibitori della molecola di recettore D 2 sensibilizzazione indotta. In un secondo esperimento, abbiamo usato questo metodo per valutare la potenza di una serie di D 2 antagonisti per verificare se questi composti inibiscono sensibilizzazione. Simili risultati precedenti, questi studi hanno dimostrato che gli antagonisti D 2 inibiti agonista sensibilizzazione indotta in modo dose-dipendente (Figura 2C). L'ordine di rango di potenza per l'inibizione di sensibilizzazione era coerente con le loro azioni come D 2 antagonisti del recettore e la loro farmacologia precedentemente descritto in D 2 recettori 28.

Parte II. Applicazione del 384 e sensibilizzazione test per la trasfezione inversione di siRNA in sforzi di screening.

Il nostro prossimo obiettivo era di sviluppare un 384 pozzetti saggio sensibilizzazione che può essere utilizzato per condurre trasfezione inverso screening di librerie siRNA scalabile. Studi preliminari sono statieseguita utilizzando un modello cellulare HEK che esprime eterologamente entrambi i recettori della dopamina D 2L (ratto DRD 2L, numero di registrazione: NM_012547) e AC6 (ratto ADCY6, numero di accesso: NC_005120) (cioè le cellule HEK-AC6 / D 2L). I primi esperimenti hanno valutato la capacità di dimostrare agonista indotta sensibilizzazione di AC nella linea cellulare. Brevemente, le cellule AC6 / D 2L crioconservati sono state piastrate (1000 cellule / pozzetto) in una piastra di coltura tissutale da 384 pozzetti. Opti-MEM contenente 1 mM quinpirole (concentrazione finale) è stato aggiunto ad un volume totale di 15 microlitri, e le cellule sono state incubate per 2 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato. Seguendo l'incubazione, accumulo di cAMP è stato avviato con l'aggiunta di concentrazioni crescenti di forskolina. Il saggio è stato interrotto tramite l'aggiunta di tampone di lisi contenente i reagenti HTRF. I risultati hanno rivelato che l'esposizione delle cellule alla quinpirole agonista per 2 ore ha portato ad un notevole miglioramento della CAM forskolina stimolataP accumulo (Figura 3A). La maggiore accumulo di cAMP sia a 100 nM e 300 nM di forskolina era maggiore di 15 volte rispetto alle cellule trattati con veicolo (Figura 3A).

Successivamente, abbiamo usato pubblicato siRNA metodologie 29,30 per guidare i nostri sforzi di ottimizzazione che includeva una valutazione delle varie condizioni inversa trasfezione (ad es reagenti di trasfezione, efficienza di trasfezione, densità cellulare, tempo di incubazione, ecc.). Studi preliminari utilizzati siGloRed, un indicatore di trasfezione, in combinazione con Lipofectamine 2000 a determinare condizioni ottimali inverso trasfezione. Gli esperimenti hanno indicato che 2-4 pmol siRNA / 5 ml H 2 O combinato con 0,03 microlitri Lipofectamine 2000/5 microlitri Opti-MEM disponibile una efficienza di trasfezione quasi il 95% in 72 ore, senza alcuna tossicità osservabile in cellule HEK (dati non mostrati). Abbiamo poi esaminato l'effetto di Gαs siRNA sulla sensibilizzazione eterologadi forskolina stimolato accumulo di cAMP in cellule AC6 / D 2L. La siRNA Gas è stata proposta come un potenziale controllo positivo perché Gαs è stato identificato come una componente fondamentale di sensibilizzazione eterologa per diverse isoforme di AC (cioè AC1, AC2, AC5, e AC6) 19-21. Inoltre, il segnale di sensibilizzazione 15 volte nella nostra AC6 / D 2L modello cellulare (Figura 3A) fornisce un segnale robusto per finestra rumore per valutare l'efficienza di trasfezione inversa. Utilizzando le condizioni sopra descritte, abbiamo completato gli studi preliminari di valutazione Gαs siRNA come controllo positivo, ed i nostri risultati hanno dimostrato un blocco robusto (> 90%) di sensibilizzazione (dati non riportati).

La drastica riduzione siRNA-indotta nel segnale di sensibilizzazione prevede un controllo positivo per il processo di screening siRNA. Per ottenere una valutazione più quantitativa per siRNA proiezione di AC sensibilizzazione eterologa, abbiamo generato i dati in cuiun fattore Z 'stato calcolato per una serie di condizioni di prova utilizzando le cellule AC6 / D 2L 31. Per questo esperimento, abbiamo combinato 2 pmol Gαs siRNA o il controllo siRNA non mira, in 5 ml con 0,03 ml Lipofectamine 2000/5 microlitri Opti-MEM per pozzetto in una piastra da 384 pozzetti (volume totale 10 microlitri). Cellule crioconservati sono stati scongelati, risospese in Opti-MEM e poi aggiunti a singoli pozzetti contenenti miscela siRNA / Lipofectamine usando diverse densità cellulari (es. 500-5,000 cells/10 microlitri / pozzetto). La durata del trattamento quinpirole (2 ore contro 18 ore) nonché la concentrazione finale di forskolina (100-300 nM) sono state esplorate nel nostro AC6 / D 2L dosaggio sensibilizzazione. I risultati di questi esperimenti hanno rivelato che un fattore robusto Z 'stata ottenuta nelle seguenti condizioni: 750 cellule / pozzetto, durata 72 hr trasfezione, 2 hr trattamento quinpirole, e 300 nM forskolina per stimolare l'accumulo di cAMP (Figura 3B). In queste conditions, abbiamo ottenuto una risposta di 15 sensibilizzazione volte che è stato ridotto del 94% in presenza di Gαs siRNA (Z 'di 0.6 per Gαs siRNA vs. controllo siRNA).

Figura 1
Figura 1. Nel formato tradizionale, le cellule vengono piastrate in un formato a 48 pozzetti e coltivate a confluenza oltre 48 ore. L'mezzi di crescita viene decantato, piccole molecole inibitrici aggiunto, seguito da aggiunta di D 2 agonista. Dopo l'incubazione 2 hr, mezzi di dosaggio viene decantato e le cellule vengono sottoposte ad una serie di fasi di lavaggio / decantare. Successivamente, AC è stimolata e le cellule vengono lisate. Ciclico AMP accumulo viene poi valutata con [3 H] cAMP saggio di legame che è un saggio 2 giorni richiede una fase di filtrazione e conteggio a scintillazione. Mentre il formato elimin 96 benated molte delle fasi di lavaggio e decantare, abbiamo scoperto che questo formato non era facilmente suscettibili di HTS o di automazione. Il formato HTS utilizza cellule crioconservati che sono placcati direttamente in piastre a 384 pozzetti. Queste cellule crioconservati sono "saggio pronta" a seguito di una equilibratura 1 ora. Dopo questo periodo di incubazione iniziale, piccole molecole inibitrici possono essere aggiunti seguita dall'aggiunta di D 2 agonista di incubazione 2 hr. AC è stimolata, e le cellule vengono lisate usando i reagenti di rivelazione HTRF nella piastra di saggio.

Figura 2
Cellule Figura 2. Crioconservati CHO-D 2L sono stati seminati direttamente in 384 piastre e test in cellule 3000 / pozzetti e equilibrati per 1 ora. A.) crescenti concentrazioni di D 2 agonista, quinpirole, sono stati aggiunti e le cellule sono state incubate per 2 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato. Ciclico AMP accumulo è stato stimolato con 10 pM forskolina (concentrazione finale) in presenza di spiperone e IBMX per 1 ora a temperatura ambiente. La reazione è stata spenta utilizzando reagenti del saggio HTRF cAMP (n = 1, rappresentativi di almeno 3 esperimenti). I dati sono espressi come risposta cento delle cellule trattati con veicolo. Cellule B.) CHO D-2L sono stati pretrattati in assenza (controllo) o la presenza degli antagonisti dei recettori D2 indicati (cioè spiperone o aloperidolo). Quinpirole (100 nM) è stato aggiunto, e le cellule sono state incubate per 2 ore per indurre sensibilizzazione. AC è stato stimolato con 10 pM forskolina (concentrazione finale) per 1 ora a temperatura ambiente. Ciclico AMP è stata determinata utilizzando HTRF. I dati sono espressi come risposta cento delle cellule trattati con veicolo C.). Cellule CHO-D 2L sono stati pretrattati in assenza (controllo =100%) o la presenza di concentrazioni crescenti di indicati antagonisti dei recettori D2. Quinpirole (100 nM) è stato aggiunto, e le cellule sono state incubate per 2 ore per indurre sensibilizzazione. AC è stato stimolato con 10 pM forskolina (concentrazione finale) per 1 ora a temperatura ambiente. Ciclico AMP è stata determinata utilizzando HTRF. I dati sono espressi come percentuale della risposta sensibilizzazione quinpirole-indotta. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 3
Figura 3. Cellule crioconservati HEK-AC6 / D 2L sono state placcate a 1000 cellule / pozzetto ed equilibrati per 1 ora. A.) Le cellule sono state incubate con veicolo o 100 quinpirole nM per 2 ore in un incubatore umidificato. Wa ACs stimolate con concentrazioni crescenti di forskolina per 1 ora a temperatura ambiente. AMP ciclico è stato determinato utilizzando HTRF. B.) trasfezione inversione di Gαs siRNA blocchi di sensibilizzazione nelle cellule AC6 / D 2L. Gαs siRNA o il controllo siRNA nontargeting (2 pmol) è stato combinato con 0,03 microlitri Lipofectamine2000 (Lipo) in un volume totale di 10 microlitri, e la soluzione è stata addizionata a singoli pozzetti in una piastra a 384 pozzetti. AC6 crioconservati / D 2L cellule sono state poi aggiunte per la trasfezione inversa e incubate per 70 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato. L'agonista del recettore D 2, è stato aggiunto quinpirole (1 mM finale), o veicolo seguito da un'incubazione di 2 ore. Ciclico accumulo di AMP è stato stimolato con 300 nM forskolina (concentrazione finale) per 1 ora e misurata utilizzando HTRF. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Discussion

Nel tentativo di facilitare gli studi di sensibilizzazione eterologa, abbiamo ampiamente modificato il nostro metodo precedente realizzare una struttura snella "mix e leggere" formato che è modificabile a high-throughput screening e il meccanismo di esame azione. Le principali modifiche al nostro protocollo possono essere riassunti come segue: 1) l'uso di cellule crioconservate come reagenti di saggio "pronto", 2) la miniaturizzazione del dosaggio in 384 pozzetti, e 3) l'utilizzazione della misurazione del HTRF cAMP.

L'adozione di crioconservazione per i nostri saggi cellulari ha notevolmente migliorato l'efficienza e riproducibilità per il nostro giorno per esperimenti di giorno e di screening sforzi. Questo approccio è uno standard industriale, e può essere facilmente tradotto l'impostazione 26 ricerca accademica. Per migliorare l'efficienza delle cellule cultura, fiale di cellule sono utilizzate come "fuori i reagenti scaffale" nel senso che le scorte di cellule vengono scongelati, diluito e poi placcato direttamente in piastre da 384 pozzetti for ogni test. Abbiamo già incorporato cellule crioconservati in studi volti a individuare antagonisti di proteine ​​G invertebrati recettori accoppiati 32,33. Questa metodologia è vantaggioso che l'opera iniziale non è stata eseguita nel nostro laboratorio e reso necessario il trasporto di cellule in coltura attraverso campus che ha presentato le sfide e probabilmente introdotte variabilità. Utilizzando il nostro nuovo approccio, le cellule congelate possono ora essere immediatamente scongelati e diluiti in loco prima dell'inizio del test. Oltre a migliorare la riproducibilità, la crioconservazione anche eliminato il periodo di 48 ore da placcatura cellule all'esecuzione del test (Figura 1). Abbiamo applicato con successo il metodo di crioconservazione in studi stabili e transitori transfezione utilizzando una varietà di recettori ricombinanti e sottotipi di ACS con letture funzionali, tra cui l'accumulo di cAMP e β-arrestina reclutamento (Brust, TF, Ejendal, KFK, e Watts, VJ osservazioni non pubblicate) . DesPite nostre esperienze positive fino ad oggi, i ricercatori dovrebbero verificare che il loro recettore o la destinazione, e il sistema cellulare modello è compatibile con crioconservazione prima di iniziare gli studi su larga scala.

Una seconda modifica che era importante per i nostri sforzi per razionalizzare il saggio sensibilizzazione eliminazione coinvolti di decantare e lavare i passaggi (Figura 1). Questi cambiamenti erano concomitante con la nostra miniaturizzazione del test in un formato a 96 pozzetti (Conley e Watts, osservazioni non pubblicate). In particolare, un protocollo di sensibilizzazione modificato è stato progettato in cui l'accumulo di cAMP è stato avviato con l'aggiunta diretta di forskolina in tampone seguente D 2 agonista incubazione in assenza di fasi di lavaggio o decantare (vedi pannello centrale Figura 1). Inoltre, il buffer di accumulo di cAMP conteneva una concentrazione relativamente elevata di spiperone (1 mM), un antagonista D 2 che ha un valore Ki di 0,07 nM per D 2recettori 15. Questo 100 volte l'eccessiva concentrazione dei risultati spiperone in completa D 2 occupazione dei recettori durante la fase di accumulo cAMP, precludendo in tal modo residuale D 2 attivazione del recettore per gli agonisti (ad esempio quinpirole) durante la forskolina stimolato passo AC 15. Questa modifica ha eliminato i tre decantare e tre le fasi di lavaggio seguendo l'agonista incubazione iniziale. Come parte dello sviluppo formato a 96 pozzetti, siamo stati anche in grado di eliminare il passaggio decantare finale prima della tempra e la lisi delle cellule. Questa modifica è stata effettuata aumentando la concentrazione del nostro reagente di lisi (acido tricloroacetico;. TCA) 3-9% e aggiungendo il reagente direttamente al buffer di accumulo di cAMP. I risultati promettenti del saggio modificato 96 ben sensibilizzazione fornito supporto per la conversione del test sensibilizzazione in un formato 384 pozzetti. Purtroppo, la nostra precedente metodologia per quantificare cAMP è stato un filtratio laboriosaa base di n [3 H] proteina cAMP saggio di legame (> 5 passi). Ad esempio, il saggio è generalmente completa nel corso di due giorni per consentire filtro essiccatore e scintillazione contando 15,24. Questi inconvenienti messi proteina cAMP [3 H] vincolante poco pratico da utilizzare per un alto rendimento 384 pozzetti.

La terza chiave di sviluppo è venuto attraverso l'incorporazione di metodologie per misurare e quantificare cAMP in maniera suscettibili di 384 pozzetti. Ad esempio, abbiamo esperienza significativa con un elemento di cAMP Response (CRE) a base di luciferasi sistema giornalista per misure di cAMP relative in un formato da 384 pozzetti 32,33. Anche se questo approccio è stato utilizzato con successo dal nostro laboratorio per molti studi di recettori Gαs-accoppiati, i giornalisti CRE-luc sono soggette a una serie di falsi positivi e negativi durante il test di screening 34. Inoltre, i nostri preliminari D 2 studi di sensibilizzazione con questa appscarafaggio non erano incoraggianti dal fatto che abbiamo osservato risposte inibizione apparente del segnale luciferasi (dati non mostrati). Pertanto, abbiamo concentrato i nostri sforzi sulla implementazione della tecnologia GloSensor cAMP con la costruzione e la caratterizzazione linee cellulari stabili utilizzando sia la loro "prima" e "seconda" vettori GloSensor generazione. Il GloSensor è un reporter luciferasi ingegnerizzato contenente un sito di legame cAMP all'interno della proteina luciferasi 35. Anche se il sistema è molto utile per cinetica cAMP quantificazione, il metodo non è efficace per misurare agonista-indotta sensibilizzazione (Conley e Watts, osservazioni non pubblicate). Abbiamo anche esplorato un BRET basato cAMP biosensore 36 per i nostri studi come un costo efficace mezzo per valutare l'accumulo di cAMP. Purtroppo, il rumore di fondo associato al biosensore transitoriamente trasfettate limita la nostra capacità di adattare questo metodo per il dosaggio sensibilizzazione. Infine, abbiamo valutato diversi kit che impiegano tempo omogeneo fluor risoltoescence (HTRF) come un approccio per misurare cAMP in 384 pozzetti. Abbiamo trovato che questa metodologia stabilita era più compatibile con laboratori accademici e strutture di screening, essendo state robusto, sensibile, stabile e facile da usare. Lo svantaggio principale per i ricercatori accademici è il costo dei reagenti, tuttavia l'acquisto all'ingrosso di reagenti e miniaturizzazione a 384 formato ben rende il prezzo più che competitivo con altri kit, tra cui saggi basati ELISA e il nostro precedente [3 H] proteina cAMP "fatto in casa" saggio di 15 vincolante.

Il lavoro rappresentativo dimostra l'applicabilità del 384 pozzetti sensibilizzazione saggio di studi di D 2 recettore della dopamina sensibilizzazione indotta di segnalazione AC in linee cellulari ricombinanti. In diversi studi preliminari, abbiamo usato questo test con piccole modifiche per valutare D 2 recettore della dopamina e μ recettori oppioidi sensibilizzazione indotta di varie isoforme AC (Tabella 1). Questi studi evidenziano l'applicabilità generale del saggio 384 pozzetti di linee multiple di cellule, sottotipi recettoriali e isoforme AC. Coloro che sono interessati a sviluppare formati di saggio simili sarebbero incoraggiati a esplorare le variabili quali la densità cellulare, i tempi di pretrattamento agonisti, AC protocolli di attivazione / condizioni, e una metodologia di rilevazione HTRF cAMP per i loro modelli cellulari. I dati antagonisti qui presentati dimostrano la capacità del test per identificare piccole molecole inibitrici di sensibilizzazione. I valori di potenza sono in linea con quelli determinati con altri test funzionali 28 così come i valori di affinità (Ki) ottenuti mediante saggi di legame radiorecettoriale (vedi: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php). L'attuale disegno dosaggio potrebbe facilmente ospitare HTS sforzi cui composti sono consegnati tramite un pintool o sono PRONTI nel saggio piatti pronti. Oltre ai saggi di sensibilizzazione descritte, le metodologie applicate qui dovrebbero essere applicabili ad altri annuncisaggi aptive cui più farmaci / i reagenti sono applicati prima di una misura di punto finale in formato da 384 pozzetti.

Abbiamo cercato di evidenziare importanti fasi di sviluppo per l'intero test 384-bene, ma vogliono anche sottolineare che lo sviluppo dei saggi di trasfezione siRNA inversa è stato particolarmente impegnativo. Il nostro obiettivo a lungo termine di questi test è quello di condurre uno sforzo ampio genoma per identificare i geni sovrapposti e unici coinvolti nella sensibilizzazione eterologa delle isoforme di AC. Utilizzando il nostro test siRNA iniziale come linea guida, vi offriamo i seguenti suggerimenti abbreviati per lo sviluppo di un siRNA saggi di trasfezione inversa: (1) esamina l'efficienza di trasfezione utilizzando rapporti di un indicatore come il Siglo e reagente di trasfezione (. Es. Lipofectamine 2000), (2) determinare la densità di semina ottimale (ad esempio 500-5,000 cellule / pozzetto), (3) esplorare durata trasfezione (es. 48-96 hr) e (4) valutare adeguate condizioni di saggio (es tr farmacoeatments, misure punto finale, e controlli robusti) per il raggiungimento ottimale del segnale (analisi fattoriale ad esempio Z '). Per ulteriori dettagli e informazioni più generali per l'uso di siRNA in sforzi di screening si possono trovare anche nei metodi precedentemente referenziati articoli 29,30. Quei ricercatori che sono interessati a sforzi HTS dovrebbero anche esplorare la capacità di adattamento dei loro saggi di automazione (ad es. Pintool e robotica). Inoltre, altri fattori o controlli per gli sforzi di screening includono la convalida formale saggio, saggi di vitalità cellulare, e adeguati schermi contatore. Per ulteriori indicazioni, il lettore interessato dovrebbe essere incoraggiato a esaminare il manuale disponibile attraverso NCATS NCGC test di orientamento a: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/.

Abbiamo descritto il nostro approccio per razionalizzare un saggio più giorni laboriosa in un efficiente "mix e leggere" analisi che possono essere eseguite in un solo giorno. Le metodologie qui descritte ed unrecente studio di 1.280 composti in μopioid recettore sensibilizzazione indotta in formato 1.536, ben 25 suggerisce che la sensibilizzazione può ora essere facilmente interrogato con HTS. Il saggio qui descritto è suscettibile di piccolo test molecola e può essere applicata ad approcci genetici come siRNA. Il nostro formato di saggio è incentrato sulla risposta adattativa conosciuta come la sensibilizzazione eterologa di AC, tuttavia, l'approccio ei metodi generale possono essere ampiamente applicati ad altri test cellulari che richiedono più di farmaci e reagenti aggiunte (ad esempio, desensibilizzazione e neuroprotezione.). Il lavoro qui riportato è facilmente realizzabile all'interno di un ambiente accademico con pipette multicanale e di un lettore di schede multi piatto modalità in grado di leggere l'endpoint desiderato in formato 384-bene.

Tabella 1. Modelli cellulari testati per la sensibilizzazione agonista-indotta.

Recettore AC Isoform Linea cellulare Sensibilizzazione
segnale
D 2L dopamina Endogeno
(AC6 e AC7 27) 		CHO-D 2L 2-3 volte
D 2L dopamina AC2 ricombinante, AC5, e AC6 HEK 293 trasfettate stabilmente AC2 = 2-3 volte
AC5 = 50 volte
AC6 = 15 volte
μ oppioidi AC1 ricombinante, AC2, e AC5 HEK 293 trasfettate stabilmente AC1 = 6-7 volte
AC2 = 2-3 volte
AC5 = 10-15 volte

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare il signor Richard Zink e Todd Wiernicki per la formazione metodologica e di orientamento dosaggio. Ringraziamo anche Giovanni Paolo Spence un'attenta lettura e proposte editoriali. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health MH 060.397, Brain and Behavior Research Foundation, e Eli Lilly and Company attraverso il Research Award Program Lilly (LRAP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHO-K1-DRD2L cells DiscoveRx 930579C2
Ham’s F12 media VWR SH30026fs
Fetal Bovine Serum VWR SH3007003
G418 Sigma A1720
Hygromycin Fisher 50-230-5556
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15070063
15 cm dishes BD Falcon 353025
DMSO Sigma D2650
Cell dissociation buffer Life Technologies 13150016
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-049
Cryovials Fisher 976171
Opti-MEM Life Technologies 31985070
TC treated 384-well plates Perkin-Elmer 6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kit Cisbio Bioassays 62AM4PEB http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4 Biotek H4MLFPTAD
Prism 6 GraphPad Software NA
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
(±)Quinpirole Sigma Q111
Spiperone Sigma S7395
Clozapine Sigma C6305
Haloperidol Sigma H1512
S-(-)Sulpiride Sigma S112
Lipofectamine 2000 transfection reagent Invitrogen 11668019
Trypan blue Life Technologies T10282
Water, DNase- and RNase-free MP Biomedicals 821739
Gas siRNA Dharmacon custom siRNA
Nontargeting siRNA control Dharmacon D-001206-14-20
siGlo Red Dharmacon D-001630-02

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References

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Bioingegneria Numero 83 ciclasi cAMP sensibilizzazione eterologa superactivation D2 della dopamina μ degli oppioidi siRNA
Farmaco-indotta Sensibilizzazione della ciclasi: L'ottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di siRNA e applicazioni di screening
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