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Bioengineering

Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado

Published: January 27, 2014 doi: 10.3791/51218
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

Summary

La activación persistente de inhibidores G acoplados a proteínas receptores da como resultado la sensibilización de la señalización de la adenilato ciclasa. Para identificar las vías moleculares esenciales, los enfoques no sesgada son necesarios, sin embargo, esta estrategia requiere el desarrollo de un ensayo de sensibilización cAMP basada en células escalable. Aquí se describe un ensayo para la sensibilización y la detección de moléculas pequeñas siRNA.

Abstract

Sensibilización de la adenilato ciclasa de señalización (CA) ha sido implicado en una variedad de trastornos neuropsiquiátricos y neurológicos, por ejemplo el abuso de sustancias y la enfermedad de Parkinson. La activación aguda de / receptores unidos a O Gai inhibe la actividad de CA, mientras que la activación persistente de estos receptores da como resultado la sensibilización heteróloga de CA y aumento de los niveles de AMPc intracelular. Estudios anteriores han demostrado que esta mejora de la capacidad de respuesta de CA se observa tanto in vitro como in vivo después de la activación crónica de varios tipos de receptores / O-ligados Gai incluyendo D 2 de la dopamina y los receptores opioides μ. Aunque la sensibilización heteróloga de AC se informó por primera vez hace cuatro décadas, el mecanismo (s) que subyacen a este fenómeno siguen siendo ampliamente desconocidas. La falta de datos mecanicistas presumiblemente refleja la complejidad implicada con esta respuesta adaptativa, lo que sugiere que los enfoques no sesgada podrían ayudar a identificarción de las vías moleculares implicadas en la sensibilización heteróloga de CA. Estudios previos han implicado a la quinasa y la señalización Gbγ como componentes que regulan la sensibilización heteróloga de AC superpuestos. Identificar objetivos superpuestos únicos y adicionales asociados con la sensibilización de la CA, se requiere el desarrollo y validación de un ensayo de sensibilización cAMP escalable para un mayor rendimiento. Los enfoques anteriores para estudiar la sensibilización son generalmente engorroso que implica el mantenimiento continuo de cultivo de células, así como una metodología compleja para la medición de la acumulación de AMPc que implica múltiples pasos de lavado. Por lo tanto, el desarrollo de un ensayo basado en células robusta que se puede utilizar para la selección de alto rendimiento (HTS) en un formato de 384 pocillos facilitaría los estudios futuros. El uso de dos modelos celulares receptor D2 de la dopamina (por ejemplo. CHO-D 2L y HEK-AC6 / D 2L), hemos convertido nuestro ensayo de sensibilización de 48 pocillos (> 20 pasos 4-5 días) para un período de cinco step, ensayo de un solo día en formato de 384 pocillos. Este nuevo formato es susceptible de cribado molécula pequeña, y demostramos que este diseño de ensayo también se puede utilizar fácilmente para la transfección inversa de ARNip en previsión de selección de la biblioteca siRNA dirigidos.

Introduction

Un adenililciclasa adaptativo (AC) de señalización de respuesta conocido como heterólogo o sensibilizantes fue descubierto en el laboratorio del premio Nobel, el Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg propuso que el aumento de la capacidad de respuesta de CA observado después de la activación del receptor opioide δ crónica era un mecanismo implicado en la tolerancia y dependencia de opiáceos 1. Además de la activación del receptor opioide δ crónica, esta respuesta neuroadaptativos de la señalización de AC también se produce tras la activación persistente de varios otros receptores / o acoplados a Gai 2. En particular, muchos de estos receptores se asocian con el dolor, los trastornos neuropsiquiátricos y neurológicos, e incluyen opioide μ / κ, D 2/4 de dopamina, 5HT 1A, y M 2/4 receptores muscarínicos 2. Además de los descubrimientos del Dr. Nirenberg, un gran cuerpo de evidencia existe vinculación de la sensibilización de la señalización de CA a la activación del receptor opioide crónica tanto in vivo 3-7. Sensibilización de CA también se ha asociado con una variedad de enfermedades que implican los receptores de dopamina D 2-como incluyendo la esquizofrenia y la enfermedad de Parkinson (para una revisión véase la referencia 2). A pesar de la importancia potencial de sensibilización, el mecanismo exacto (s) asociado con la activación persistente Gai / o-receptor acoplado a que conduce a un aumento de la capacidad de respuesta de CA permanece en gran medida desconocido.

Estos estudios proporcionan la justificación para el examen de los mecanismos para la sensibilización de la guanilato ciclasa como un objetivo importante neurobiológica. Igualmente, el relevancia fisiológico AC señalización 8 e importancia que isoformas AC individuales sostienen este respuesta adaptativa deberían reconocerse 2,9,10. En el contexto de nuestra investigación, las características generales asociados con la sensibilización heteróloga de las isoformas recombinantes de AC son paralelas a las características described para el estudio de las isoformas endógenas de CA. En concreto, la investigación anterior ha encontrado que la activación de las proteínas Gai / O y subunidades posterior liberación / reordenamiento βγ son requisitos importantes para la sensibilización del receptor inducida de todas las isoformas de CA. Además, varios estudios sugieren que la señalización de las proteínas quinasas y subunidades Gβγ están involucrados en la sensibilización 2,11-13. CCAA individuales también muestran patrones de sensibilización únicas y distintas 12. Por ejemplo, la exposición persistente de los receptores D2 de agonistas se asocia con la sensibilización de AC1 y AC8 a Ca 2 + estimulación / calmodulina 14,15, mientras que el AC3 estrechamente relacionada no está sensibilizado 2. AC2, AC4, y AC7 están estrechamente relacionados, sin embargo, sólo la actividad AC2 estimulado PKC-se sensibiliza con firmeza después de la exposición prolongada de los receptores D2 de agonistas 7,14,16,17. Además, AC5 y AC6 muestran un notable grado de hetersensibilización ologous a gas y la acumulación de AMPc estimulada por forskolina después de la activación de los receptores D 2 14,18-20, pero parecen diferir en su requisito para Gβγ subunidad-CA interacciones 21. Aunque la mayoría de los estudios de la sensibilización de CA han utilizado líneas celulares de modelo (por ejemplo, células HEK293 que expresan isoformas individuales AC), parece que estos resultados se traducen en modelos de células neuronales nativos 4,22. Más recientemente, los efectos de la selectivos inhibidores de moléculas pequeñas de isoformas de CA identificados en células HEK293 que expresan isoformas de CA también se pueden traducir in vivo para estudios de comportamiento 23.

La falta de un mecanismo molecular identificado para la sensibilización heteróloga probablemente refleja la complejidad de la respuesta adaptativa, así como las propiedades reguladoras únicas de la persona de CA isoformas 12. Desentrañar esta complejidad se complica aún más por el uso de engorrosos metodología tsombrero ha limitado los investigadores académicos de emplear imparciales enfoques. Por ejemplo, nuestros estudios mecanísticos anteriores implicaban el uso de modelos celulares cultivadas continuamente usando 24 - y 48-así formato de cultivo de tejidos 15. Las células cultivadas se cultivan normalmente durante 48 horas y después se sometieron a tratamiento farmacológico agonista (2-18 hr) seguido de una serie de lavados e incubaciones de células (Figura 1). Protocolos de la acumulación de AMPc específica de CA-isoforma fueron entonces emplea seguido de la medición de la acumulación de AMPc utilizando un laborioso y consume mucho tiempo [3 H] AMPc metodología 15,24 unión. La duración de principio a fin para cada ensayo general, se requiere un total de cuatro a cinco días a partir de planchas de células para el análisis de datos (Figura 1). La aplicación de nuevas tecnologías y la automatización ha llevado a mejoras notables para los estudios de sensibilización en el entorno industrial y el centro de HTS. Por ejemplo, un grupo de trabajo con el Centro Nacional de ChemiCal Genómica informó de un dos días HTS procedimiento de ensayo para identificar inhibidores de moléculas pequeñas de receptor opioide μ sensibilización inducida en formato de 1.536 pocillos 25.

El presente artículo describe nuestros esfuerzos para desarrollar un ensayo HTS para los estudios de sensibilización heteróloga utilizando tecnologías que están disponibles en la mayoría de las instituciones de investigación académica. Esta estrategia se llevó a cabo mediante la incorporación de la utilización de células criopreservadas de modelos celulares heteróloga que expresa el receptor de dopamina D 2 en combinación con isoformas de adenilato ciclasa recombinantes endógenos o individuales (CHO-D 2L o HEK-CA6 / D 2 L). Para mejorar nuestro rendimiento, hemos rediseñado nuestro ensayo de sensibilización de 48 pocillos (ca.> 20 pasos más de 4-5 días) a una de cinco pasos, ensayo de un solo día en formato de 384 pocillos que era esencialmente "mezclar y leer". El nuevo formato utiliza un disponible en el mercado el tiempo homogéneo de fluorescencia resuelta (HTRF) de ensayo para medir cAMP accumulation en células intactas con un lector de placa de modo multi. El ensayo es robusto y pueden someterse a cribado molécula pequeña, y se puede aplicar de manera efectiva para la detección de inhibidores de la sensibilización heteróloga. Además, se ofrecen datos que permiten la utilización de este ensayo con invertir transfección de siRNA para la selección de la biblioteca siRNA amplia dirigida o genomas con sólo una pequeña modificación del planteamiento general.

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Protocol

1. Expansión y Criopreservación de Células de Ensayo Ready

  1. Cultivo de CHO-K1-DRD 2L células (CHO-D 2L) en una célula plato de 15 cm 2 cultura en medio F12 de Ham suplementado con 1,0 mM de L-glutamina, 800 mg / l de G418, 300 mg / l de higromicina, 100 U / l penicilina, 100 mg / l de estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS).
  2. Se incuban las células a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 hasta que las células son 90-95% de confluencia. Lavar las células con 10 l tampón fosfato salino (PBS), y cosechar las células mediante la adición de 3 l de tampón de disociación celular durante 5 min a 37 ° C. Resuspender las células por medio de 12 l de los medios de cultivo y contar las células mediante exclusión con azul de tripano.
  3. Centrifugar la suspensión de células a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 5 l de medio de congelación (10% de sulfóxido de dimetilo, 90% de FBS). Diluir la suspensión de células para conseguir la concentración celular deseada (por ejemplo, 1-20 x 10 6 células / l).
  4. Alícuota de 1,0 l de solución de células a cada criovial. Incubar los crioviales en un recipiente de congelación de células a -80 ° C durante la noche. Transfiera los crioviales a un tanque de N2 líquido para almacenamiento a largo plazo.

2. Plating ensayo Células Ready (y Opción transfección inversa)

  1. Rápidamente descongelar un criovial congelado de las células en un 37 ° C baño de agua. Una vez que las células se descongelan, transferir las células a un tubo cónico de 15 l que contiene 9 l de Opti-MEM, y mezclar invirtiendo el tubo 3-5x.
  2. Centrifugar las células a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 l de Opti-MEM.
  3. Contar las células mediante exclusión con azul de tripano para determinar la viabilidad celular y diluir las células viables como sea necesario (por ejemplo,. 3 x 10 5 células / l de concentración) enOpti-MEM. Placa 10 l / pocillo de células en un cultivo de tejido tratado placa de 384 pocillos usando una pipeta multicanal.
  4. Hacer diluciones en serie de AMPc en Opti-MEM para generar una curva patrón para la estimación de la producción de AMPc por las células (de acuerdo con recomendaciones de los fabricantes - véase la Sección 7). Añadir 10 l / pocillo de los patrones de AMPc a la placa Nota:. Una sola curva estándar se puede preparar en una placa separada o pocillos de blanco en una de las placas de ensayo.
  5. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 durante 1 hora.

3. Invertir Opción transfección siRNA *

Esta sección es opcional y relevante a la figura 3.

  1. Preparar una solución de siRNA en ddH RNasa libre 2 O (por ejemplo, 0,4 pmol / l). Añadir 5 l a pocillos individuales de la placa de 384 pocillos, y centrifugar la placa a 100 g durante 15 síC a temperatura ambiente.
  2. Diluir Lipofectamine 2000 en Opti-MEM por un factor de 0.006 (por ejemplo, añadir 6 l de Lipofectamina 2000 a 1000 l de Opti-MEM), y mezclar pipeteando arriba y abajo.
  3. Incubar la solución de Lipofectamine 2000/Opti-MEM durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 5 l de la solución Lipofectamine 2000/Opti-MEM diluido a pocillos individuales de la placa de 384 pozos que ya contiene siRNA. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente.
  4. Incubar la placa durante 30 min a temperatura ambiente.
  5. Células listos ensayo de placa como se describe anteriormente (Sección 2). Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente.
  6. Vuelva placa de ensayo para humidificado incubadora a 37 ° C (5% de CO 2) por 48 a 96 horas según lo determinado por génica dirigida tumbar (véase el debate).

4. Screening de moléculas pequeñas

  1. Se diluye el fármaco de interés (por ejemplo, los inhibidores de la. Molécula pequeña) en Opti-MEM a 6x las concentraciones finales deseadas. Las diluciones en serie se puede completar utilizando pipetas de mano o una estación de tratamiento de líquidos.
  2. Añadir 2,5 l / pocillo del compuesto de ensayo o tampón que contiene vehículo (por ejemplo, DMSO) para el lado de los pocillos utilizando una pipeta multicanal.
  3. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente (de incubación es opcional).

5. Tratamiento Agonist persistente

  1. Preparar un 600 nM (es decir. 6 veces la concentración final deseada de 100 nM) solución de quinpirol en Opti-MEM.
  2. Añadir 2,5 l / pocillo de la solución quinpirol nM 600 para el lado de los pocillos utilizando una pipeta multicanal.
  3. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 durante 2 horas.

6. Estimulación de la acumulación de AMPc

  1. Durante la incubación de 2 horas, se preparan los stimulatien solución en Opti-MEM. La solución estimulación se compone de 40 forskolina M, 2 M 3-isobutil-1-methyxanthine (IBMX), y 4 M espiperona (todas las concentraciones en el paso 6 se 4x la concentración final deseada).
  2. Añadir 5 l / pocillo de la solución de estimulación para el lado de los pocillos utilizando una pipeta multicanal.
  3. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h.

7. Temple y Estimación de la acumulación de AMPc

  1. La producción de AMPc por las células se midió usando el kit de cAMP dinámica 2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, reconstituir anti-AMPc-criptato y cAMP-D2 en agua destilada. Congele alícuotas a -20 ° C para el almacenamiento a corto plazo.
  2. Diluir una alícuota de anti-AMPc-criptato y una alícuota de AMPc-D2 por separado en el tampón de lisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante para hacer soluciones de trabajo.
  3. Ladd 10 l / pocillo de la solución de trabajo anti-cAMP criptato y 10 l / pocillo de la solución de trabajo cAMP-d2 a la placa de 384 pocillos utilizando una pipeta multicanal.
  4. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h.
  5. Leer la placa en un lector de placas de fluorescencia (ajuste de escala automática de la sensibilidad), utilizando una excitación de 337 nm y medir las emisiones a 620 nm y 665 nm por las instrucciones del fabricante.
  6. Aplicar el análisis radiométrico para evaluar la curva patrón de AMPc por las instrucciones del fabricante. Utilizando los valores resultantes, extrapolar la acumulación de cAMP estimada en los pozos de prueba utilizando el software de análisis de datos.

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Representative Results

Parte I. Desarrollo de un ensayo de sensibilización bien heterólogo 384 para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas usando un modelo de células disponibles comercialmente.

Para el estudio de la sensibilización heteróloga en un modelo celular, hicimos una serie de mejoras que nos permitieron agilizar el ensayo en un formato "mezclar y leer". Varias de las modificaciones principales se destacan a continuación y se describen con más detalle en la discusión. El primer paso clave fue modificando nuestra cultura de células a partir de células cultivadas de forma continua a las células criopreservadas 26. Ahora rutinariamente los lotes de cultivo de células que se pueden criopreservar a concentraciones entre 1-20 x 10 6 células / l. Para cada ensayo respectivo, las poblaciones de células se descongelan, se diluyen, se contaron, y luego sembraron directamente en placas de 384 pocillos. La eliminación de la necesidad de un periodo de cultivo y el aumento de la comodidad del ensayo. El formato de nuestro ensayo sensibilización previa utilizada tiss 48 pocillosplacas de cultivo ue, y participan una serie de lavado, decantación, pasos de transferencia, y una basada en la filtración-[3H] cAMP vinculante de ensayo (Figura 1). Por lo tanto, este formato para la sensibilización no era susceptible de aplicaciones de alto rendimiento. Por lo tanto, hemos realizado esfuerzos considerables para racionalizar el ensayo primero en un 96 pocillos y luego un formato de 384 pocillos modificable para la selección de alto rendimiento. La optimización involucrados eliminación de etapas de lavado y evaluación de múltiples tipos de placas de cultivo / ensayo, diferentes densidades de células, y diferentes períodos de incubación. También exploramos varias metodologías para la detección de cAMP y encontramos que la tecnología cAMP HTRF caracterizado bien utilizado en el presente protocolo fue altamente reproducible, fiable y extremadamente estable. Esta plataforma de ensayo se basa en immunocompetition entre el AMPc producida por las células y AMPc marcado (es decir. AMPc-d2) proporcionado por el kit. Hemos desarrollado con éxito y protocolos solicitado SENSIT heterólogación en formato de 384 pocillos que son esencialmente "mezclar y leer" (panel derecho Figura 1).

Nuestro objetivo inicial era generar un alto rendimiento D 2L ensayo de sensibilización del receptor utilizando comercialmente disponibles células CHO-D 2D (humana DRD 2L, el número de acceso: NM_000795) que expresan endógenamente AC6 y AC7 27. Células CHO-D 2L criopreservadas se sembraron a 3000 células / pocillo en una placa de cultivo de tejido de 384 pocillos, y se equilibraron durante 1 hora a 37 ° C en un incubador humidificado. Las placas se retiraron de la incubadora y concentraciones crecientes del agonista D 2 quinpirol se añadieron a temperatura ambiente. Las células se incubaron entonces durante 2 horas a 37 ° C en un incubador humidificado. A continuación, la acumulación de AMP cíclico se inició por la adición de forskolina 10 mM (un activador directo de la CA). El buffer de acumulación de cAMP contenía un inhibidor de la fosfodiesterasa, isobutilmetilxantina (IBMX), Así como el antagonista D 2, espiperona (1 M, K i para D, 2L = 0,07 nM), con el fin de impedir la activación del receptor D 2 residual durante el período de acumulación de cAMP. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. El ensayo se terminó mediante la adición de un tampón de lisis que contiene los reactivos de AMPc de HTRF. Los estudios revelaron que un pretratamiento de 2 horas con quinpirol mejora la acumulación de AMPc estimulada por forskolina posterior de una manera dependiente de la dosis consistente con la sensibilización heteróloga (Figura 2A). Los resultados de este experimento demuestran que los ensayos de sensibilización se pueden realizar en un formato de 384 pocillos. El nuevo formato de ensayo reduce el número de pasos de más de 20 a 4 pasos sin necesidad de lavado o de decantación pasos por lo que es una "mezcla y leer" ensayo (Figura 1).

La segunda serie de experimentos exploró si este nuevo ensayo simplificado podría ser utilizado para unainhibidores E valuar de sensibilización en el modelo CHO-D 2L. Células L-CHO criopreservadas D 2 se sembraron en una placa de cultivo de tejido 384 a una densidad de 3000 células / pocillo en Opti-MEM. Se añadieron conocidos D 2 antagonistas para bloquear D2 sensibilización inducida por receptor. Opti-MEM que contiene 100 nM de quinpirol (concentración final) a continuación, se añadió a un volumen total de 15 l, y las células se incubaron durante 2 horas a 37 ° C en un incubador humidificado. Después de la incubación, la acumulación de cAMP se inició por la adición directa de forskolina (10 mM de concentración final), y el ensayo se terminó y AMPc midió usando HTRF. Los resultados iniciales revelaron que el pretratamiento con espiperona o haloperidol (D prototípico 2 antagonistas) completamente impedido la sensibilización inducida quinpirol de forskolina estimula la acumulación de cAMP (Figura 2B). Estos resultados proporcionan una validación de que este enfoque puede ser utilizado para identificar pequeñainhibidores de moléculas de D 2 inducida por la sensibilización del receptor-. En un segundo experimento, se utilizó este método para evaluar la potencia de una serie de antagonistas de D 2 para probar si estos compuestos inhiben la sensibilización. Similar a los resultados anteriores, estos estudios demostraron que los antagonistas de D 2 inhibieron agonista inducida por la sensibilización de una manera dependiente de la dosis (Figura 2C). El orden de potencia para la inhibición de la sensibilización fue consistente con su actuación como antagonistas del receptor D2 y su farmacología descrito anteriormente en los receptores D2 28.

Parte II. Aplicación del ensayo de sensibilización de 384 pocillos para la transfección inversa de ARNip en los esfuerzos de cribado.

Nuestro siguiente objetivo era desarrollar un ensayo de sensibilización de 384 pocillos que se puede utilizar para llevar a cabo la transfección inversa selección de la biblioteca de siRNA escalable. Los estudios preliminares fueronrealizado mediante un modelo de células HEK que expresa de forma heteróloga ambos receptores de dopamina D 2D (rata DRD 2L, el número de acceso: NM_012547) y AC6 (ADCY6 rata, el número de acceso: NC_005120) (es decir, células HEK-AC6 / D 2L). Los primeros experimentos se evaluó la capacidad de demostrar agonista inducida por la sensibilización de la CA en la línea celular. Brevemente, las células CA6 / D 2L criopreservados se sembraron (1000 células / pocillo) en una placa de cultivo de tejido de 384 pocillos. Opti-MEM que contiene 1 quinpirol mu M (concentración final) se añadió a un volumen total de 15 l, y las células se incubaron durante 2 horas a 37 ° C en un incubador humidificado. Después de la incubación, la acumulación de cAMP se inició por la adición de concentraciones crecientes de forskolina. El ensayo se terminó mediante la adición de tampón de lisis que contiene los reactivos HTRF. Los resultados revelaron que la exposición de las células a la quinpirol agonista durante 2 horas dio lugar a una marcada mejora de la leva estimulada por forskolinaLa acumulación de P (Figura 3A). El aumento de la acumulación de AMPc en tanto 100 nM y 300 nM de forskolina fue mayor de 15 veces en comparación con las células tratadas con vehículo (figura 3A).

A continuación, hemos utilizado publicamos siRNA Metodologías 29,30 para guiar nuestros esfuerzos de optimización que incluyeron una evaluación de las diversas condiciones de transfección inversa (por ejemplo, los reactivos de transfección, la eficacia de transfección, la densidad celular, el tiempo de incubación, etc.). Los estudios preliminares utilizan siGloRed, un indicador de la transfección, en combinación con Lipofectamine 2000 para determinar las condiciones óptimas de transfección inversa. Los experimentos indicaron que 2-4 pmol ARNsi / 5 l de H 2 O combinado con 0,03 l de Lipofectamine 2000/5 l de Opti-MEM proporcionó una eficacia de transfección de casi 95% a las 72 horas sin ninguna toxicidad observable en las células HEK (datos no mostrados). A continuación, examinó el efecto de Gαs siRNA en la sensibilización heterólogade forskolina estimulado la acumulación de AMPc en las células CA6 / D 2L. El siRNA Gas fue propuesto como un posible control positivo porque Gαs ha sido identificada como un componente clave de la sensibilización heteróloga durante varias isoformas de corriente alterna (es decir, AC1, AC2, AC5 y AC6) 19-21. Además, la señal de la sensibilización 15 pliegue en nuestra CA6 / D 2L modelo de células (Figura 3A) proporciona una señal robusta para ventana de ruido para evaluar la eficiencia de transfección inversa. Usando las condiciones descritas anteriormente, hemos completado los estudios preliminares que valoran Gαs ARNsi como control positivo, y nuestros resultados demostraron un bloqueo robusta (> 90%) de la sensibilización (datos no mostrados).

La reducción inducida siRNA-dramática en la señal de sensibilización proporciona un control positivo adecuado para el proceso de selección de siRNA. Para obtener una evaluación más cuantitativa para la detección de siRNA de CA sensibilización heteróloga, hemos generado datos en la queFactor Z 'se ha calculado para una serie de condiciones de prueba utilizando las células AC6 / D 2L 31. Para este experimento, se combinaron 2 pmol Gαs siRNA, o el control de siRNA no dirigido, en 5 l con 0,03 l Lipofectamine 2000/5 l de Opti-MEM por pocillo en una placa de 384 pocillos (volumen total de 10 l). Células crioconservadas se descongelaron, se resuspendieron en Opti-MEM y después se añadió a pocillos individuales que contienen mezcla de ARNsi / Lipofectamina utilizando varias densidades de células (es decir. 500-5.000 células/10 l / pocillo). La duración del tratamiento quinpirol (2 h frente a 18 h), así como la concentración final de forskolina (100-300 nM) también se exploró en nuestra CA6 / ensayo de sensibilización D 2L. Los resultados de estos experimentos revelaron que un factor de Z robusta 'se obtuvo en las siguientes condiciones: 750 células / pocillo, 72 horas de duración de la transfección, 2 hr tratamiento quinpirol, y 300 nM de forskolina para estimular la acumulación de AMPc (Figura 3B). Bajo estas conditions, se obtuvo una respuesta 15 veces de sensibilización que se redujo en un 94% en presencia de Gαs ARNsi (Z 'de 0,6 para Gαs ARNsi vs. control de siRNA).

Figura 1
Figura 1. En el formato tradicional, las células se colocaron en placas en un formato de 48 pocillos y se cultivaron hasta confluencia durante 48 h. El medio de crecimiento se decanta, inhibidores de moléculas pequeñas añadió, seguido de la adición del agonista D 2. Después de la incubación de 2 horas, medio de ensayo se decanta y las células se someten a una serie de pasos de lavado / decantación. Siguiente, AC es estimulada y las células se lisan. Acumulación de AMP cíclico se evaluó a continuación usando [3 H] ensayo de unión de AMPc, que es un ensayo de 2 días que requiere una etapa de filtración y recuento de centelleo. Mientras que el Elimin formato de 96 pocillosATED muchos de los pasos de lavado y decantación, se encontró que este formato no era fácilmente susceptible de HTS o automatización. El formato HTS utiliza células crioconservadas que se siembran directamente en placas de 384 pocillos. Estas células criopreservadas son "ensayar listo" a raíz de una equilibración 1 hr. Después de este período de incubación inicial, se pueden añadir inhibidores de moléculas pequeñas seguido de la adición de D 2 agonista para una incubación de 2 horas. AC es estimulada, y las células se lisan usando los reactivos de detección de HTRF en la placa de ensayo.

Figura 2
Figura 2. Células criopreservadas CHO-D 2L se sembraron directamente en placas de 384 pocillos de ensayo a 3000 células / pocillo y se equilibraron durante 1 hora. A.) concentraciones crecientes del agonista D 2, quinpirOLE, se añadieron y las células se incubaron durante 2 horas a 37 ° C en un incubador humidificado. Acumulación de AMP cíclico se estimuló con forskolina 10 mM (concentración final) en presencia de espiperona y IBMX durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se inactivó usando reactivos de ensayo de cAMP de HTRF (n = 1, representativas de por lo menos 3 experimentos). Los datos se expresan como un porcentaje de respuesta de las células tratadas con vehículo. Células B.) CHO-D 2L fueron pretratadas en ausencia (control) o la presencia de los antagonistas de los receptores D 2 indicados (es decir, espiperona o haloperidol). Quinpirol (100 nM) se añadió, y las células se incubaron durante 2 h para inducir la sensibilización. CA fue estimulado con forskolina 10 mM (concentración final) durante 1 hora a temperatura ambiente. El AMP cíclico se determinó utilizando HTRF. Los datos se expresan como un porcentaje de respuesta de las células tratadas con vehículo. C.) células CHO-D 2L fueron pretratadas en ausencia (control =100%) o la presencia de aumento de la concentración de antagonistas de los receptores D 2 indicados. Quinpirol (100 nM) se añadió, y las células se incubaron durante 2 h para inducir la sensibilización. CA fue estimulado con forskolina 10 mM (concentración final) durante 1 hora a temperatura ambiente. El AMP cíclico se determinó utilizando HTRF. Los datos se expresan como un porcentaje de la respuesta inducida por la sensibilización quinpirol-. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3
Células criopreservadas HEK-CA6 / D 2L se sembraron Figura 3. A 1.000 células / pocillo y se equilibraron durante 1 hora. A.) Las células fueron incubadas con vehículo o quinpirol 100 nM durante 2 horas en un incubador humidificado. Wa ACs estimulado con concentraciones crecientes de forskolina durante 1 hora a temperatura ambiente. El AMP cíclico se determinó utilizando HTRF. B.) transfección inversa de Gαs siRNA bloques de sensibilización en las células AC6 / D 2L. Gαs ARNsi o el control de siRNA nontargeting (2 pmol) se combinó con 0,03 l Lipofectamine2000 (Lipo) en un volumen total de 10 l, y la solución se añadió a pocillos individuales en una placa de 384 pocillos. AC6 Criopreservados / D 2L células se añadieron a continuación para la transfección inversa y se incubaron durante 70 horas a 37 ° C en un incubador humidificado. El agonista de los receptores D 2, se añadió quinpirol (1 mM final), o vehículo seguido por una incubación de 2 horas. La acumulación de AMP cíclico se estimuló con 300 nM forskolina (concentración final) durante 1 hora y se mide utilizando HTRF. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Discussion

En un esfuerzo para facilitar los estudios de sensibilización heteróloga, que ampliamente hemos modificado nuestro método anterior logrando un ágil "mezcla y leer" formato que es modificable a la detección y el mecanismo de examen de acción de alto rendimiento. Las principales modificaciones a nuestro protocolo se pueden resumir de la siguiente manera: 1) el uso de células crioconservadas como reactivos de ensayo "-listo"; 2) la miniaturización del ensayo en formato de 384 pocillos, y 3) la utilización de la medición de HTRF de AMPc.

La adopción de la criopreservación para nuestros ensayos basados ​​en células ha mejorado mucho la eficiencia y reproducibilidad para nuestro día a día experimentos y esfuerzos de detección. Este enfoque es un estándar de la industria, y puede ser traducido fácilmente a la investigación académica ajuste 26. Para mejorar la eficiencia del cultivo celular, los viales de células se utilizan como "fuera de los reactivos de la plataforma" en la que las poblaciones de células se descongelan, se diluye, y después se sembraron directamente en placas de 384 pocillos for cada ensayo. Previamente Incorporamos células criopreservadas en estudios dirigidos a identificar antagonistas de proteína G. invertebrados receptores acoplados a 32,33. Esta metodología fue la ventaja de que el trabajo inicial no se llevó a cabo en nuestro laboratorio y requirió el transporte de las células cultivadas a través del campus, que planteaban desafíos y probablemente variabilidad introducida. La utilización de nuestro nuevo enfoque, las células congeladas ahora se pueden descongelar inmediatamente y se diluyen en el lugar antes del inicio del ensayo. Además de mejorar la reproducibilidad, la criopreservación también eliminó el período de tiempo de 48 horas a partir de la célula de chapado a la ejecución de ensayo (Figura 1). Hemos aplicado con éxito el enfoque de la criopreservación en estudios de transfección estables y transitorias utilizando una variedad de receptores y subtipos de SCA recombinantes con lecturas funcionales que incluyen la acumulación de AMPc y el reclutamiento β-arrestina (Brust, TF, Ejendal, KFK, y Watts, VJ observaciones no publicadas) . DesPite nuestras experiencias positivas hasta la fecha, los investigadores deben verificar que su receptor o de destino, y el sistema de células modelo es compatible con la criopreservación antes de iniciar cualquier estudio a gran escala.

Una segunda modificación que era importante para nuestros esfuerzos por racionalizar el ensayo de sensibilización involucrados eliminación de decantación y lavar las etapas (Figura 1). Estos cambios fueron concurrente con nuestra miniaturización del ensayo a un formato de 96 pocillos (Conley y Watts, observaciones no publicadas). En concreto, un protocolo de sensibilización modificado fue diseñado donde la acumulación de cAMP fue iniciada por la adición directa de forskolina en tampón de ensayo siguiente D 2 agonista de incubación en ausencia de cualquier paso de lavado o de decantación (ver panel central Figura 1). Además, la memoria intermedia de acumulación de AMPc contenía una concentración relativamente alta de espiperona (1 M), un antagonista D 2 que tiene un valor de Ki de 0,07 nM para D 2receptores 15. Este 100 veces el exceso de concentración de resultados espiperona con total ocupación de receptores D 2 en la fase de acumulación de cAMP, impidiendo de ese modo la activación residual receptor D2 por agonistas (por ejemplo quinpirol) durante la forskolina estimula paso AC 15. Este cambio elimina los tres decantación y tres pasos de lavado después de la incubación inicial agonista. Como parte del desarrollo de formato de 96 pocillos, también hemos sido capaces de eliminar el paso de decantación final, antes de la inactivación y la lisis de las células. Esta modificación se llevó a cabo mediante el aumento de la concentración de nuestro reactivo de lisis (es decir, ácido tricloroacético;. TCA) 3-9% y la adición del reactivo directamente a la memoria intermedia de acumulación de cAMP. Los prometedores resultados del ensayo de 96 sensibilización así modificado proporcionaron apoyo para la conversión de la prueba de sensibilidad a un formato de 384 pocillos. Por desgracia, nuestra metodología anterior para cuantificar cAMP fue un laborioso filtratiobasado N-[3 H] ensayo de unión de la proteína de AMPc (> 5 pasos). Por ejemplo, el ensayo se completa generalmente en el curso de dos días para permitir el secado del filtro y recuento de centelleo 15,24. Estos inconvenientes hacen el [3H] AMPc proteína de unión a poco práctico de utilizar para un formato de 384 pocillos de alto rendimiento.

La tercera clave de desarrollo llegó a través de la incorporación de metodologías para la medición y cuantificación de cAMP de una manera susceptible de formato de 384 pocillos. Por ejemplo, tenemos una importante experiencia mediante un elemento de respuesta cAMP (CRE)-basado en la luciferasa sistema indicador para la medición de cAMP relativos en un formato de 384 pocillos 32,33. Aunque este enfoque ha sido utilizado con éxito por nuestro laboratorio para muchos estudios de receptores acoplados a Gαs, reporteros CRE-Luc están sujetas a un número de falsos positivos y negativos durante ensayos de selección 34. Además, nuestro D 2 estudios preliminares de sensibilización con esta aplicaciónRoach no fueron alentadores en que se observó la inhibición por retroalimentación aparente de la señal de luciferasa (datos no mostrados). Por lo tanto, nos hemos centrado nuestros esfuerzos en la implementación de tecnología GloSensor cAMP mediante la construcción y caracterización de líneas celulares estables que utilizan tanto su "primera" y "segunda" vectores GloSensor generación. El GloSensor es un indicador de la luciferasa ingeniería que contiene un sitio de unión de cAMP dentro de la proteína luciferasa 35. Aunque el sistema es muy útil para la cuantificación de cAMP cinética, el método no fue eficaz para la medición de la sensibilización inducida por el agonista (Conley y Watts, observaciones no publicadas). También exploramos un BRET basado cAMP biosensor 36 para nuestros estudios como un medio rentable para evaluar la acumulación de cAMP. Desafortunadamente, el ruido de fondo asociado con el biosensor transfectadas transitoriamente limitó la capacidad de adaptar este método para nuestro ensayo de sensibilización. Por último, se evaluaron varios kits que emplean el tiempo homogéneo fluor resueltoescence (HTRF) como un enfoque para medir cAMP en formato de 384 pocillos. Se encontró que esta metodología establecida era más compatible con laboratorios académicos e instalaciones de cribado en que eran robusto, sensible, estable y fácil de usar. La desventaja principal de los investigadores académicos es el costo de los reactivos, sin embargo la compra a granel de los reactivos y la miniaturización a 384 formato bien hace que el precio más que competitivo con otros kits, incluyendo ensayos basados ​​en ELISA y nuestra anterior "casera" de [3H] cAMP proteína ensayo de unión 15.

La obra representativa demuestra la aplicabilidad del ensayo de sensibilización de 384 pocillos a los estudios de receptor de dopamina D 2 inducida por la sensibilización de la señalización de AC en líneas celulares recombinantes. En varios estudios preliminares, se ha utilizado este ensayo con modificaciones menores para evaluar receptor D2 de dopamina y los receptores opioides μ inducida por la sensibilización de varias isoformas de CA (Tabla 1). Estos estudios ponen de relieve la aplicabilidad general del ensayo de 384 pocillos a múltiples líneas celulares, los subtipos de receptores, y las isoformas de CA. Las personas interesadas en el desarrollo de formatos de ensayo similares se animaría a explorar variables como la densidad de las células, los tiempos de pretratamiento agonistas, AC protocolos de activación / condiciones y metodología de detección HTRF cAMP por sus modelos de celulares. Los datos de antagonistas presentados en este documento demuestran la capacidad del ensayo para identificar inhibidores de molécula pequeña de la sensibilización. Los valores de potencia son coherentes con los determinados con otros ensayos funcionales 28, así como los valores de afinidad (Ki) obtenidos utilizando los ensayos de unión de radiorreceptor (ver: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php). El actual diseño del ensayo podría acomodar fácilmente HTS esfuerzos donde los compuestos se entregan a través de una pintool o se preplated en placas listas de ensayo. Además de los ensayos de sensibilización descritos, las metodologías aplicadas aquí deberían ser aplicables a otro anuncioensayos aptive donde se aplican múltiples fármacos / reactivos antes de un punto de medida final en el formato de 384 pocillos.

Hemos tratado de poner de relieve los pasos importantes de desarrollo para todo el ensayo de 384 pocillos, pero también quieren tener en cuenta que el desarrollo de los ensayos de siRNA transfección inversa fue especialmente difícil. Nuestro objetivo a largo plazo para estos ensayos es llevar a cabo un amplio esfuerzo de genoma para identificar los genes que se solapan y únicos implicados en la sensibilización heteróloga de isoformas de CA. Utilizando el ensayo inicial de siRNA como guía, le ofrecemos las siguientes sugerencias abreviados para el desarrollo de un siRNA ensayos de transfección inversas: (1) examinar la eficacia de transfección utilizando proporciones de un indicador como el Siglo y reactivo de transfección (por ej. Lipofectamine 2000), (2) determinar la densidad de siembra óptima (por ejemplo 500-5.000 células / pocillo); (3) explorar duración de la transfección (por ejemplo, 48-96 h), y (4) evaluar las condiciones de ensayo adecuadas (por ejemplo, TR de drogaseatments, medidas de punto final y los controles robustos) para lograr la óptima de la señal (por ejemplo, el análisis factorial Z '). Más información general para el uso de siRNA en los esfuerzos de detección adicional detalle y también se pueden encontrar en los métodos de artículos previamente referenciados 29,30. Aquellos investigadores que estén interesados ​​en los esfuerzos HTS también deberían estudiar la capacidad de adaptación de sus ensayos para la automatización (pintool por ejemplo. Y robótica). Además, otros factores o controles para los esfuerzos de detección incluyen la validación formal de ensayo, ensayos de viabilidad celular, y las pantallas de contador apropiadas. Para más ayuda, se animaría al lector interesado a examinar el Manual NCGC Ensayo Orientación disponible a través NCATS en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/.

Hemos descrito nuestro enfoque para racionalizar un ensayo de varios días laborioso en un eficiente "mezcla y leer" ensayo que se puede realizar en un solo día. Las metodologías descritas aquí y unaestudio reciente de 1.280 compuestos en μopioid receptor inducida por la sensibilización en formato 1536-25 bien sugiere que la sensibilización puede ahora ser interrogado fácilmente usando HTS. El ensayo descrito aquí es susceptible de pequeña molécula de prueba y se puede aplicar a los enfoques genéticos, tales como ARNsi. Nuestro formato de ensayo se centra en la respuesta adaptativa conocido como sensibilización heteróloga de CA, sin embargo, el enfoque general y los métodos se pueden aplicar extensamente a otros ensayos basados ​​en células requieren múltiples adiciones de drogas y de reactivos (por ejemplo de desensibilización y neuroprotección.). El trabajo que aquí se realiza fácilmente en el ámbito académico utilizando pipetas multicanal y un lector de placas modo multi capaz de leer el punto final deseado en formato de 384 pocillos.

Tabla 1. Los modelos celulares probados para la sensibilización inducida por el agonista.

Receptor AC Isoforma La línea celular Sensibilización
señal
D 2L dopamina Endógeno
(CA6 y AC7 27) 		CHO D 2L 2-3 veces
D 2L dopamina AC2 recombinante, AC5 y AC6 HEK 293 transfectadas establemente AC2 = 2-3 veces
AC5 = 50 veces
CA6 = 15 veces
μ opioides AC1 recombinante, AC2 y AC5 HEK 293 transfectadas establemente AC1 = 6-7 veces
AC2 = 2-3 veces
AC5 = 10 a 15 veces

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean dar las gracias al Sr. Richard Zink y Todd Wiernicki para la formación metodológica y orientación ensayo. También agradecemos a John Paul Spence para lectura cuidadosa y sugerencias editoriales. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, y Eli Lilly and Company a través del Programa de Premios de Investigación Lilly (LRAP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHO-K1-DRD2L cells DiscoveRx 930579C2
Ham’s F12 media VWR SH30026fs
Fetal Bovine Serum VWR SH3007003
G418 Sigma A1720
Hygromycin Fisher 50-230-5556
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15070063
15 cm dishes BD Falcon 353025
DMSO Sigma D2650
Cell dissociation buffer Life Technologies 13150016
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-049
Cryovials Fisher 976171
Opti-MEM Life Technologies 31985070
TC treated 384-well plates Perkin-Elmer 6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kit Cisbio Bioassays 62AM4PEB http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4 Biotek H4MLFPTAD
Prism 6 GraphPad Software NA
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
(±)Quinpirole Sigma Q111
Spiperone Sigma S7395
Clozapine Sigma C6305
Haloperidol Sigma H1512
S-(-)Sulpiride Sigma S112
Lipofectamine 2000 transfection reagent Invitrogen 11668019
Trypan blue Life Technologies T10282
Water, DNase- and RNase-free MP Biomedicals 821739
Gas siRNA Dharmacon custom siRNA
Nontargeting siRNA control Dharmacon D-001206-14-20
siGlo Red Dharmacon D-001630-02

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References

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