Summary
Vedvarende aktivering af hæmmende G-protein-koblede receptorer resulterer i sensibilisering af adenylylcyclase signalering. At identificere de væsentlige molekylære veje, er det nødvendigt nonbiased tilgange, men denne strategi kræver udvikling af en skalerbar celle-baserede cAMP sensibilisering assay. Heri beskriver vi en sensibilisering assay for lille molekyle og siRNA screening.
Abstract
Sensibilisering af adenylylcyclase (AC) signalering har været impliceret i en række neuropsykiatriske og neurologiske lidelser, herunder stofmisbrug og Parkinsons sygdom. Akut aktivering af Gαi / O-bundet receptorer hæmmer AC aktivitet, mens vedvarende aktivering af disse receptorer resulterer i heterolog sensibilisering af AC og øgede niveauer af intracellulær cAMP. Tidligere undersøgelser har vist, at denne forøgelse af AC modtagelighed observeres både in vitro og in vivo efter kronisk aktivering af flere typer Gαi / O-koblede receptorer, herunder D2 dopamin og μ opioidreceptorer. Selv heterolog sensibilisering af AC blev først rapporteret fire årtier siden, den mekanisme (r), der ligger til grund for dette fænomen fortsat er stort set ukendte. Manglen på mekanistiske data formentlig afspejler kompleksiteten forbundet med denne adaptive respons, hvilket tyder på, at nonbiased tilgange kan støtte i at identificerening af de molekylære veje involveret i heterolog sensibilisering af AC. Tidligere undersøgelser har impliceret kinase og Gbγ signalering som overlappende komponenter, der regulerer det heterologe sensibilisering af AC. At identificere unikke og yderligere overlappende mål, der er forbundet med sensibilisering af AC, der er nødvendigt for at øge gennemløb udvikling og validering af en skalerbar cAMP sensibilisering assay. Tidligere fremgangsmåder til at studere overfølsomhed er generelt besværlige involverer kontinuerlig cellekultur vedligeholdelse samt en kompleks metode til måling af cAMP-akkumulering, der involverer flere vasketrin. Således vil udviklingen af en robust cellebaseret assay, der kan anvendes til screening med højt gennemløb (HTS) i en 384-brønds format lette fremtidige studier. Ved hjælp af to D 2 dopamin receptor cellulære modeller (dvs.. CHO-D 2L og HEK-AC6 / D 2L), har vi konverteret vores 48-godt sensibilisering assay (> 20 trin 4-5 dage) til en fem-stoe, enkelt dag assay i 384-brønds format. Denne nye format er modtagelig for lille molekyle screening, og vi vise, at dette assay design kan også let anvendes til omvendt transfektion af siRNA i forventning om målrettet siRNA bibliotek screening.
Introduction
En adaptiv adenylylcyklase (AC) signalering respons kendt som heterolog-eller super-sensibilisering blev først opdaget i laboratoriet af nobelprisvinder Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg foreslog, at den observerede øgede AC lydhørhed efter kronisk δ opioid receptor-aktivering var en mekanisme, der er involveret i opiat tolerance og afhængighed 1. Ud over den kroniske δ opioid receptor aktivering, denne neuroadaptive reaktion AC signalering forekommer også efter vedvarende aktivering af flere andre Gαi / o-koblede receptorer 2. Især er mange af disse receptorer er forbundet med smerter, neuropsykiatriske og neurologiske sygdomme, og omfatter μ / κ opioid, D 2/4 dopamin, 5HT 1A, og M 2/4 muscarinreceptorer 2. Ud over Dr. Nirenberg resultater, eksisterer en stor mængde beviser, der forbinder sensibilisering af AC signalering til kronisk opioid receptor-aktivering både
Disse undersøgelser giver rationalet for behandlingen af mekanismerne for sensibilisering af adenylylcyclase som en vigtig neurobiologiske mål. Ligeledes bør den fysiologiske relevans af AC signalering 8 og den betydning, at de enkelte AC isoformer holder i denne adaptive respons også anerkendes 2,9,10. I forbindelse med vores forskning, de generelle træk forbundet med heterolog sensibilisering af de rekombinante isoformer af AC parallelt disse kendetegn destilskrevet for at studere de endogene isoformer af AC. Konkret har tidligere forskning fundet, at aktiveringen af Gαi / o proteiner og efterfølgende frigivelse / omlejring βγ subunits er vigtige krav for receptor-induceret sensibilisering af alle AC-isoformer. Derudover tyder flere undersøgelser, der signalering fra protein kinaser og Gβγ underenheder er involveret i sensibilisering 2,11-13. Individuelle ACs vise også unikke og distinkte overfølsomhedsreaktioner mønstre 12. For eksempel er vedholdende eksponering af D 2-receptorer til agonister associeret med sensibilisering af AC1 og AC8 til Ca 2 + / calmodulin stimulation 14,15, mens den nært beslægtede AC3 ikke er sensibiliseret 2. AC2, AC4 og AC7 er nært beslægtede, er imidlertid kun PKC-stimuleret AC2 aktivitet håndfast sensibiliseret efter længere tids eksponering af D 2-receptorer til agonister 7,14,16,17. Derudover AC5 og AC6 en markant grad af heterologous sensibilisering til Gas-og forskolinstimuleret cAMP akkumulering efter aktivering af D 2-receptorer 14,18-20, men ser ud til at variere i deres krav om Gβγ subunit-AC interaktioner 21. Selv om de fleste undersøgelser af AC sensibilisering har brugt model cellelinjer (f.eks HEK293 celler, der udtrykker de enkelte AC isoformer), fremgår det, at disse resultater oversætte til indfødte neuronale cellemodeller 4,22. Mere for nylig, kan virkningerne af AC isoform selektive inhibitorer med små molekyler identificeret i HEK293-celler, der udtrykker AC isoformer også oversat til in vivo adfærdsmæssige undersøgelser 23.
Manglen på en identificeret molekylære mekanisme for heterologe sensibilisering sandsynligvis afspejler kompleksiteten af det adaptive respons samt de unikke regulerende egenskaber af den enkelte AC isoformer 12. Optrevling sådan kompleksitet kompliceres yderligere ved brug af besværlige metode that har begrænset akademiske efterforskere fra at ansætte upartiske tilgange. For eksempel er involveret vores tidligere mekanistiske undersøgelser brugen af løbende dyrkede cellulære modeller ved hjælp af 24 - og 48-godt vævskultur format 15. Dyrkede celler blev typisk dyrket i 48 timer og derefter udsat for agonist lægemiddelbehandling (2-18 timer), efterfulgt af en række cellevaske og inkubationer (Figur 1). AC-isoform specifik cAMP-akkumulering protokoller blev derefter anvendt efterfulgt af måling af cAMP-akkumulering ved anvendelse af en omstændelig og tidskrævende [3H] cAMP bindende metode 15,24. Varigheden fra start til slut for hvert assay, generelt i alt fire til fem dage fra celleudpladning dataanalyse (figur 1). Anvendelsen af nye teknologier og automatisering har ført til markante forbedringer for overfølsomhedsreaktioner studier i industri-og HTS center indstilling. For eksempel er en gruppe, der arbejder med National Center for Chemical Genomics rapporteret et todages HTS assay procedure til at identificere småmolekyleinhibitorer af μ opioid receptor inducerede sensibilisering i 1.536-godt format 25.
Nærværende artikel beskriver vores bestræbelser på at udvikle et HTS assay for studier af heterolog overfølsomhed ved hjælp af teknologier, der er tilgængelige på de fleste akademiske forskningsinstitutioner. Denne strategi blev udført ved at inkorporere anvendelsen af kryopræserverede celler fra cellemodeller heterologt udtrykker D2 dopaminreceptor i kombination med endogene eller individuelle rekombinante adenylylcyclase isoformer (CHO-D 2L eller HEK AC6 / D 2 L). For at forbedre vores gennemløb, vi redesignet vores 48 godt sensibilisering assay (ca.> 20 trin over 4-5 dage) til en fem-trins, enkelt dag assay i 384-godt format, der i det væsentlige var "mix og læse." Det nye format bruger en kommercielt tilgængelig homogen tid løst fluorescens (HTRF) assay til måling af cAMP accumulation i intakte celler med en multi-mode pladelæser. Assayet er robust og modtagelig for lille molekyle screening, og effektivt kan anvendes til at screene for inhibitorer af heterologe sensibilisering. Derudover leverer vi data, der tillader brug af dette assay med omvendt transfektion af siRNA for målrettet eller genom bred siRNA bibliotek screening med kun en mindre ændring i den generelle indstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udvidelse og Kryopræservering af Assay Ready Cells
- Kultur CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) celler på en 15 cm 2 celledyrkningsskål i Hams F12 medium suppleret med 1,0 uM L-glutamin, 800 pg / pl G418 300 pg / pl hygromycin, 100 U / pl penicillin, 100 pg / pl streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS).
- Inkuberes cellerne ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2, indtil cellerne er 90-95% sammenflydende. Vask cellerne med 10 pi phosphatpufret saltvand (PBS) og høste cellerne ved tilsætning af 3 pi celledissociering puffer i 5 minutter ved 37 ° C. Gensuspendér cellerne ved hjælp af 12 ul af kultur medier og tælle celler ved hjælp trypanblåteksklusion.
- Centrifugeres cellesuspensionen ved 500 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 pi indefrysning medier (10% dimethylsulfoxid, 90% FBS). Cellesuspensionen fortyndes til opnåelse af den ønskede cellekoncentration (fx 1-20 x 10 6 celler / ul).
- Aliquot 1.0 pi celle-opløsning til hver cryovial. Inkubér kryoglas i en celle frysning beholder ved -80 ° C natten over. Overfør kryoglas til et flydende N2 tank til langtidsopbevaring.
2. Plating Assay Ready Cells (og omvendt Transfection Option)
- Hurtigt tø en frossen cryovialet af celler i et 37 ° C vandbad. Når cellerne er optøet, overføre cellerne til et 15 pi konisk rør indeholdende 9 pi Opti-MEM, og der blandes ved at vende røret 3-5x.
- Centrifuger cellerne ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirere supernatanten og cellerne resuspenderes i 1 pi Opti-MEM.
- Tæl celler under anvendelse af trypanblåt-udelukkelse for at bestemme cellelevedygtighed og fortyndes de levedygtige celler som nødvendigt (f.eks. 3 x 10 5 celler / ul koncentration) iOpti-MEM. Plate 10 gl / brønd af celler i et vævskulturbehandlede 384-brønds plade under anvendelse af en multikanalpipette.
- Foretag serielle fortyndinger af cAMP i Opti-MEM til at generere en standardkurve til vurdering cAMP produktion af cellerne (ifølge fremstiller anbefalinger - se afsnit 7). Tilsæt 10 gl / brønd af lejren standarder til pladen Bemærk:. En enkelt standard kurve kan tilberedes på en separat plade eller tomme brønde på en af assaypladerne.
- Centrifugeres pladen ved 100 x g i 15 sekunder ved stuetemperatur og inkuberes ved 37 ° C i en befugtet inkubator med 5% CO2 i 1 time.
3. Omvendt siRNA Transfektion Option *
Dette afsnit er valgfri og relevant til figur 3.
- Forbered en opløsning af siRNA i RNase-fri ddH2O (fx 0,4 pmol / ul). Tilsæt 5 pi til individuelle brønde i 384-brønds plade og centrifugeres pladen ved 100 x g i 15 sec ved stuetemperatur.
- Fortynd Lipofectamine 2000 Opti-MEM med en faktor på 0,006 (f.eks tilføje 6 ul Lipofectamine 2000 til 1000 pi Opti-MEM), og der blandes ved at pipettere op og ned.
- Inkubér Lipofectamin 2000/Opti-MEM opløsningen i 5 minutter ved stuetemperatur. Der tilsættes 5 ul af den fortyndede Lipofectamin 2000/Opti-MEM løsning på individuelle brønde i 384-brønds plade, der allerede indeholder siRNA. Centrifugeres pladen ved 100 x g i 15 sekunder ved stuetemperatur.
- Inkubér pladen i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Pladebestemmelse klar celler som beskrevet ovenfor (afsnit 2). Centrifugeres pladen ved 100 x g i 15 sekunder ved stuetemperatur.
- Retur assayplade til befugtet inkubator ved 37 ° C (5% CO2) i 48-96 timer som bestemt for målrettede gen knock down (se diskussionen).
4.. Small Molecule Screening
- Fortynd stoffet af interesse (f.eks. Lille molekyle inhibitorer) i Opti-MEM til 6x de ønskede slutkoncentrationer. Seriefortyndinger kan udføres med håndholdte pipetter eller en væskehåndtering station.
- Tilsæt 2,5 gl / brønd af testforbindelsen eller puffer indeholdende køretøjet (f.eks DMSO) på siden af brøndene ved hjælp af en multikanalpipette.
- Centrifugeres pladen ved 100 x g i 15 sekunder ved stuetemperatur (inkubation er valgfrit).
5.. Vedvarende agonistbehandlingen
- Forbered en 600 nm (dvs.. 6 gange den ønskede slutkoncentration på 100 nM) opløsning af quinpirol i Opti-MEM.
- Tilsæt 2,5 ul / brønd af 600 nM quinpirol løsning på den side af brønde med en multikanalpipette.
- Centrifugeres pladen ved 100 x g i 15 sekunder ved stuetemperatur og inkuberes ved 37 ° C i en befugtet inkubator med 5% CO2 i 2 timer.
6.. Stimulering af cAMP-akkumulering
- Under 2 timers inkubation, forberede stimulatipå løsning i Opti-MEM. Stimulering opløsning består af 40 pM forskolin, 2 pM 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX) og 4 uM spiperon (alle koncentrationer i trin 6 er 4x den ønskede slutkoncentration).
- Tilsæt 5 gl / brønd af stimulering løsning på den side af brønde med en multikanalpipette.
- Centrifugeres pladen ved 100 x g i 15 sekunder ved stuetemperatur, og der inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
7.. Quenching og Estimering af cAMP Opsamling
- Produktionen af cAMP i cellerne måles ved anvendelse af cAMP dynamisk 2 kit ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt, rekonstitueres anti-cAMP-kryptat og cAMP-d2 i destilleret vand. Frys portioner ved -20 ° C til kortvarig opbevaring.
- Fortynd en portion af anti-cAMP-kryptat og en portion af cAMP-D2 separat i lyseringspuffer i henhold til producentens anvisninger, som gør arbejdet løsninger.
- Add 10 gl / brønd af anti-cAMP-kryptat brugsopløsning og 10 gl / brønd af den cAMP-d2 arbejdsgruppe løsning på 384-brønds plade ved hjælp af en multikanalpipette.
- Centrifugeres pladen ved 100 x g i 15 sekunder ved stuetemperatur, og der inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
- Læs pladen i et fluorescenspladelæser (auto skala indstilling for følsomhed) ved hjælp af en excitation af 337 nm, og måle emissioner ved 620 nm og 665 nm pr fabrikantens anvisninger.
- Anvende ratiometrisk analyse for at vurdere cAMP standardkurve pr fabrikantens anvisninger. Brug de resulterende værdier, ekstrapolere den anslåede cAMP akkumulation i testbrøndene ved hjælp af data analyse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Del I. Udvikling af en 384 godt heterolog sensibilisering assay til at identificere småmolekyleinhibitorer hjælp af en kommercielt tilgængelig celle model.
At studere heterolog sensibilisering i en celle model, vi foretaget en række forbedringer, som gjorde det muligt for os at strømline analysen i et "mix og læs" format. Flere af de vigtigste ændringer er fremhævet nedenfor og er beskrevet mere detaljeret i diskussionen. Det første afgørende skridt blev at ændre vores cellekultur fra kontinuerligt dyrkede celler til cryokonserverede celler 26. Vi har nu rutinemæssigt kultur partier af celler, som kan nedfryses ved koncentrationer mellem 1-20 x 10 6 celler / ul. For hver respektiv assay celle lagre optøet, fortyndet, talt og derefter udpladet direkte i 384-brønds plader. Eliminerer behovet for en dyrkningsperiode og øge bekvemmeligheden af assayet. Formatet af vores tidligere overfølsomhed assay udnyttede 48-brønds tissue kultur plader, og involverede en række vask dekanteres transfer trin, og en filtrering baseret [3 H] cAMP bindende assay (figur 1). Således dette format til sensibilisering var ikke egnede til high throughput applikationer. Derfor vi udøvede en betydelig indsats for at strømline analysen først til en 96-brønd og derefter en 384-brønds format amendable til high throughput screening. Optimeringen involverede eliminering af vasketrin og evaluering af flere typer af kultur / assaypladerne, varierende celletætheder, og forskellige inkubationsperioder. Vi udforskede også flere metoder til cAMP opdagelse og fandt, at det godt karakteriseret HTRF cAMP teknologi, der anvendes i den nuværende protokol var yderst reproducerbar, pålidelig og ekstremt stabil. Dette assay platform er baseret på immunocompetition mellem cAMP produceret af celler og mærket cAMP (dvs.. CAMP-d2) fra kittet. Vi har nu med succes udviklet og anvendt protokoller for heterolog SENSITning i 384-brønds format, der i det væsentlige er "mix and læse" (højre panel figur 1).
Vores oprindelige mål var at skabe en high-throughput D 2L-receptor sensibilisering under anvendelse af kommercielt tilgængelige CHO-D 2L-celler (human DRD 2L, Accessionsnummer: NM_000795), som endogent udtrykker AC6 og AC7 27.. Kryopræserverede CHO-D 2L-celler blev udpladet ved 3000 celler / brønd i en 384-brønds vævskulturplade og blev ækvilibreret i 1 time ved 37 ° C i en fugtig inkubator. Pladerne blev fjernet fra inkubatoren og stigende koncentrationer af D-2 agonist quinpirol blev tilsat ved stuetemperatur. Cellerne blev derefter inkuberet i 2 timer ved 37 ° C i en befugtet inkubator. Cyklisk AMP-akkumulering blev derefter initieret ved tilsætning af 10 uM forskolin (en direkte aktivator af AC). CAMP akkumuleringsbuffer indeholdt en phosphodiesterase-inhibitor, isobutylmethylxanthin (IBMX) Samt D2 antagonist, spiperon (1 uM Ki for D, 2L = 0,07 nM), for at udelukke resterende D2 receptor-aktivering i cAMP-akkumulering periode. Cellerne blev inkuberet ved stuetemperatur i 1 time. Assayet blev afsluttet ved tilsætning af en lyseringsbuffer, der indeholder de HTRF cAMP reagenser. Undersøgelserne viste, at en 2 timers forbehandling med quinpirol forbedret efterfølgende forskolin-stimuleret cAMP-akkumulering i en dosis-afhængig måde i overensstemmelse med heterologe sensibilisering (figur 2A). Resultaterne af dette forsøg viser, at overfølsomhedsreaktioner assays kan udføres i en 384-brønds format. Den nye assayformat reduceret antallet af skridt fra mere end 20-4 trin uden behov for vask eller dekanter trin gør det til en "mix og læse" assay (figur 1).
Den anden serie af eksperimenter undersøgte, om denne nye strømlinede assay kunne anvendes til enssess hæmmere af overfølsomhed i CHO-D 2L model. Kryopræserverede CHO-D 2-L-celler blev udpladet i en 384 brønds vævskulturplade i en tæthed på 3000 celler / brønd i Opti-MEM. Kendte D 2-antagonister blev tilsat for at blokere D 2-receptor-inducerede sensibilisering. Opti-MEM indeholdende 100 nM quinpirol (slutkoncentration) blev derefter tilsat til et totalt volumen på 15 ul, og cellerne blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C i en befugtet inkubator. Efter inkubation blev cAMP-akkumulering indledt ved direkte tilsætning af forskolin (10 pM slutkoncentration), og assayet blev standset og cAMP målt ved anvendelse HTRF. De første resultater viste, at forbehandling med spiperon eller haloperidol (prototypiske D 2-antagonister) fuldstændig forhindret quinpirol inducerede sensibilisering af forskolinstimuleret cAMP akkumulering (figur 2B). Disse resultater giver bekræftelse på, at denne fremgangsmåde kan anvendes til identifikation af småmolekyle inhibitorer af D2-receptor-induceret sensibilisering. I et andet forsøg har vi anvendt denne metode til at vurdere styrken af en serie af D-2-antagonister til at teste, hvorvidt disse forbindelser inhiberer sensibilisering. I lighed med tidligere resultater, disse undersøgelser viste, at D-2-antagonister inhiberede agonistinduceret sensibilisering på en dosisafhængig måde (figur 2C). Rangordenen af styrke for hæmning af overfølsomhed var i overensstemmelse med deres handlinger såsom D 2-receptor antagonister og deres tidligere beskrevet farmakologi ved D 2-receptorer 28.
Del II. Anvendelse af 384-brønds sensibilisering assay for reverse transfektion af siRNA i screening bestræbelser.
Vores næste mål var at udvikle en 384-brønds sensibilisering assay, der kan anvendes til at gennemføre skalerbar reverse transfektion siRNA bibliotek screening. Foreløbige undersøgelser varudføres med en HEK celle model, heterologt udtrykker både D 2L dopaminreceptorer (rotte DRD 2L, Accessionsnummer: NM_012547) og AC6 (rotte ADCY6 tiltrædelsen nummer: NC_005120) (dvs. HEK-AC6 / D 2L celler). De første eksperimenter vurderede evne til at vise agonist-induceret sensibilisering af AC i cellelinien. Kort fortalt blev kryopræserverede AC6 / D 2L celler udpladet (1.000 celler / brønd) i en 384-brønds vævskulturplade. Opti-MEM indeholdende 1 uM quinpirol (slutkoncentration) blev tilsat til et samlet volumen på 15 ul, og cellerne blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C i en befugtet inkubator. Efter inkubering blev cAMP-akkumulering initieres ved tilsætning af stigende koncentrationer af forskolin. Assayet blev afsluttet ved tilsætning af lysepuffer indeholdende HTRF reagenser. Resultaterne viste, at udsættelse af celler for agonisten quinpirol i 2 timer resulterede i en markant forøgelse af forskolinstimuleret camP akkumulering (figur 3A). Den øgede akkumulering af cAMP ved både 100 nm og 300 nm, af forskolin var større end 15-doblet i forhold til vehikelbehandlede celler (figur 3A).
Dernæst brugte vi offentliggjorde siRNA-metoder 29,30 at guide vores optimering indsats, som omfattede en vurdering af forskellige reverse transfektionsreagenser betingelser (f.eks transfektionsreagenser, transfektion effektivitet, celledensitet, inkubationstid, osv.). Foreløbige undersøgelser anvendes siGloRed, en indikator for transfektion i kombination med Lipofectamine 2000 bestemme optimale omvendt transfektion betingelser. Forsøgene viste, at 2-4 pmol siRNA / 5 pi H2O kombineret med 0,03 ul Lipofectamine 2000/5 pi Opti-MEM forudsat en næsten 95% transfektionseffektivitet på 72 timer uden nogen observerbar toksicitet i HEK-celler (data ikke vist). Vi derefter undersøgte effekten af Gαs siRNA på heterolog sensibiliseringaf forskolinstimuleret cAMP-akkumulering i AC6 / D 2L celler. Gas siRNA blev foreslået som en potentiel positiv kontrol, fordi Gαs er blevet identificeret som et centralt element i heterolog overfølsomhed for mange forskellige AC-isoformer (dvs. AC1, AC2, AC5, og AC6) 19-21. Endvidere 15 fold sensibilisering signal i vores AC6 / D 2L celle model (figur 3A) giver et stærkt signal til støj vinduet at vurdere effektiviteten af omvendt transfektion. Brug de ovenfor beskrevne betingelser, vi afsluttede indledende undersøgelser, der vurderer Gαs siRNA som en positiv kontrol, og vores resultater viste en robust blokade (> 90%) af sensibilisering (data ikke vist).
Den dramatiske siRNA-induceret reduktion i sensibilisering signal giver en passende positiv kontrol for siRNA screening proces. For at opnå en mere kvantitativ vurdering for siRNA screening af AC heterologt sensibilisering, vi genererede data, hvoren Z 'faktor blev beregnet for en række testforhold ved hjælp af AC6 / D 2L celler 31. I dette eksperiment vi kombinerede 2 pmol Gαs siRNA, eller uden målretning siRNA kontrol i 5 pi med 0,03 ul Lipofectamine 2000/5 pi Opti-MEM per brønd i en plade med 384 brønde (totalt volumen 10 ul). Kryopræserverede celler blev optøet, resuspenderet i Opti-MEM, og derefter tilsat til de individuelle brønde indeholdende siRNA / Lipofectamin blandingen ved flere celledensiteter (dvs.. 500-5.000 celler/10 pi / brønd). Varigheden af quinpirol behandling (2 timer versus 18 timer) samt den endelige koncentration af forskolin (100-300 nM), blev også undersøgt i vores AC6 / D 2L sensibilisering assay. Resultaterne af disse forsøg viste, at en robust Z 'faktor blev opnået i følgende betingelser: 750 celler / brønd, 72 timer transfektion varighed, 2 hr quinpirol behandling, og 300 nM forskolin til at stimulere cAMP akkumulation (figur 3B). Under disse cold, vi opnåede en 15 fold sensibilisering svar, der blev reduceret med 94% ved tilstedeværelse af Gαs siRNA (Z 'på 0,6 for Gαs siRNA vs. kontrol siRNA).
Fig. 1. I den traditionelle format cellerne udpladet i en 48-brønds format og dyrket til sammenflydning i løbet af 48 timer. Vækstmediet dekanteres, småmolekyleinhibitorer tilsat efterfulgt af tilsætning af D-2-agonist. Efter 2 timers inkubation assaymedier dekanteres, og cellerne udsættes for en serie af vaske / dekanteres trin. Dernæst AC stimuleres, og cellerne lyseres. Cyklisk AMP-akkumulering derefter vurderes ved anvendelse af [3H] cAMP-bindingsanalyse, som er en 2 dages assay kræver et filtreringstrin og scintillationstælling. Mens 96 brøndsformatet Eliminated mange af vaske-og dekanteres skridt, fandt vi, at dette format ikke var let modtagelig for HTS eller automatisering. HTS format bruger kryopræserverede celler, der er udpladet direkte i 384-brønds plader. Disse kryopræserverede celler er "assay klar" efter en 1 hr ligevægt. Efter denne indledende inkubationsperiode kan tilsættes små molekyle inhibitorer, efterfulgt af tilsætning af D-2 agonist for en 2 timers inkubation. AC stimuleres, og cellerne lyseres ved hjælp af HTRF påvisningsreagenser i assaypladen.
Figur 2. Kryopræserveret CHO-D 2L-celler blev udpladet direkte i 384 godt assayplader ved 3000 celler / brønd og ækvilibreret i 1 time. A.) stigende koncentrationer af D-2-agonist, quinpirole, blev tilsat, og cellerne blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C i en befugtet inkubator. Cyklisk AMP-akkumulering blev stimuleret med 10 pM forskolin (slutkoncentration) i nærværelse af spiperon og IBMX i 1 time ved stuetemperatur. Reaktionen blev standset ved hjælp af HTRF cAMP assayreagenser (n = 1, er repræsentative for mindst 3 forsøg). Data er udtrykt som en procent respons bærerbehandlede celler. B.) CHO-D 2L celler blev forbehandlet i fravær (kontrol) eller tilstedeværelsen af de angivne D 2-receptor-antagonister (dvs. Spiperon eller haloperidol). Quinpirol (100 nM) blev tilsat, og cellerne blev inkuberet i 2 timer for at fremkalde overfølsomhed. AC blev stimuleret med 10 pM forskolin (slutkoncentration) i 1 time ved stuetemperatur. Cyklisk AMP blev bestemt ved hjælp HTRF. Data er udtrykt som procent respons vehikelbehandlede celler. C.) CHO-D 2L-celler blev forbehandlet i fravær (kontrol =100%) eller tilstedeværelsen af stigende koncentration af angivne D 2-receptor-antagonister. Quinpirol (100 nM) blev tilsat, og cellerne blev inkuberet i 2 timer for at fremkalde overfølsomhed. AC blev stimuleret med 10 pM forskolin (slutkoncentration) i 1 time ved stuetemperatur. Cyklisk AMP blev bestemt ved hjælp HTRF. Data er udtrykt som en procent af quinpirol-inducerede sensibilisering respons. Klik her for at se større billede.
Figur 3. Kryopræserveret HEK AC6 / D 2L-celler blev udpladet ved 1000 celler / brønd og ækvilibreret i 1 time. A.) Celler blev inkuberet med køretøj eller 100 nM quinpirol i 2 timer i en befugtet inkubator. AC war stimuleret med stigende koncentrationer af forskolin i 1 time ved stuetemperatur. Cyklisk AMP blev bestemt ved hjælp HTRF. B.) Omvendt transfektion af Gαs siRNA blokke sensibilisering i AC6 / D 2L celler. Gαs siRNA eller nontargeting siRNA kontrol (2 pmol) blev kombineret med 0,03 pi Lipofectamine2000 (Lipo) i et samlet volumen på 10 ul, og opløsningen blev tilsat til individuelle brønde i en plade med 384 brønde. Kryopræserveret AC6 / D 2L celler blev derefter tilsat til den omvendte transfektion og inkuberes i 70 timer ved 37 ° C i en befugtet inkubator. D 2-receptor-agonist, quinpirol (1 uM endelig) eller vehikel blev tilsat efterfulgt af en 2 timers inkubation. Cyklisk AMP akkumulering blev stimuleret med 300 nM forskolin (slutkoncentration) i 1 time og måles ved hjælp HTRF. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I et forsøg på at lette undersøgelser af heterolog sensibilisering, har vi væsentligt ændret vores tidligere metode at opnå en strømlinet "mix og læs" format, der er amendable til high-throughput screening og virkningsmekanisme undersøgelse. De store ændringer i vores protokol kan sammenfattes som følger: 1) brug af kryopræserverede celler som "assay-ready" reagenser, 2) miniaturisering af analysen i 384-brønds format og 3) udnyttelse af HTRF måling af cAMP.
Vedtagelsen af kryopræservering for vores celle baserede assays har forbedret effektivitet og reproducerbarhed for vores daglige eksperimenter og screening bestræbelser. Denne tilgang er en industristandard, og kan let oversættes til den akademiske forskning indstilling 26. For at forbedre cellekultur effektivitet, er hætteglas med celler, der anvendes som "off the shelf reagenser" i den celle lagrene er optøet, fortyndet og derefter belagt direkte i 384-brønds plader for hvert assay. Vi har tidligere indarbejdet kryopræserverede celler i undersøgelser med henblik på at identificere antagonister af hvirvelløse G-protein koblede receptorer 32,33. Denne metode var fordelagtigt at det indledende arbejde ikke blev udført i vores laboratorium og nødvendiggjort transport dyrkede celler på tværs af campus, som præsenteres udfordringer og sandsynligvis indført variabilitet. Udnytte vores nye tilgang, frosne celler kan nu straks optøet og fortyndes på stedet forud for indledningen af analysen. Ud over at forbedre reproducerbarheden kryopræservering også elimineret 48 hr periode fra celleudpladning til assay udførelse (figur 1). Vi har med succes anvendt kryopræservering tilgang i stabile og forbigående transfektionsundersøgelser hjælp af en række rekombinante receptorer og undertyper af ACs med funktionelle udlæsning herunder cAMP ophobning og β-arrestin rekruttering (Brust, TF, Ejendal, KFK, og Watts, VJ upublicerede observationer) . DesPite vores positive erfaringer til dato, bør forskerne kontrollere, at deres receptor eller mål, og model celle system er foreneligt med kryopræservering før initiering nogen undersøgelser i stor skala.
En anden ændring, der var vigtigt for vores bestræbelser på at strømline overfølsomhed assay involverede fjernelse af dekanteres og vask trin (Figur 1). Disse ændringer var sideløbende med vores miniaturisering af assayet til en 96-brønds format (Conley og Watts, upublicerede observationer). Specifikt blev en modificeret sensibilisering protokol designet hvor cAMP akkumulering blev indledt ved direkte tilsætning af forskolin i assaypuffer efter D 2 agonist inkubation i mangel af vaske-eller dekanter trin (se midterste panel figur 1). Derudover cAMP-akkumulering bufferen indeholdt en relativt høj koncentration af spiperon (1 uM), en D-2-antagonist, som har en Ki-værdi på 0,07 nM for D2receptorer 15. Denne 100 fold overskydende koncentration af spiperon resulterer i fuldstændig D2-receptoren besættelse under cAMP-akkumulering fase, for derved at udelukke resterende D 2-receptor-aktivering med agonister (f.eks quinpirol) under forskolinstimuleret AC trin 15. Denne ændring elimineret tre dekanteres og tre vasketrin efter den oprindelige agonist inkubation. Som en del af formatet udvikling 96-godt, vi var også i stand til at fjerne det sidste decant skridt forud for afkølende og lysere cellerne. Denne modifikation blev udført ved at øge koncentrationen af vor lyseringsreagens (dvs. trichloreddikesyre. TCA) 3-9%, og tilsætning af reagenset direkte til cAMP-akkumulering buffer. De lovende resultater af den modificerede 96 brønde overfølsomhed assay ydet støtte til omdannelsen af overfølsomhed analysen til en 384-godt-format. Desværre vores tidligere metode til kvantificering af cAMP var en møjsommelig filtration-baserede [3H] cAMP-protein-bindingsassay (> 5 trin). For eksempel er analysen fuldføres generelt i løbet af to dage for at give mulighed for filter tørring og scintillationstælling 15,24. Disse ulemper gjort [3H] cAMP proteinbinding upraktisk at anvende et højt gennemløb 384-brønds format.
Den tredje vigtig udvikling kom gennem indarbejdelse af metoder til at måle og kvantificere cAMP på en måde, gøres til genstand for 384-brønds format. For eksempel har vi betydelig erfaring med at bruge en cAMP respons Element (CRE)-luciferase-baserede reporter for relative cAMP målinger i et 384-brønds format 32,33. Selv om denne fremgangsmåde er med succes blevet brugt af vores laboratorium for mange studier af Gαs-koblede receptorer, CRE-Luc journalister er underlagt en række falske positiver og negativer under screeningsassays 34. Derudover vores foreløbige D 2 overfølsomhedsreaktioner studier med denne appskalle ikke opmuntrende, at vi observerede tilsyneladende feedback inhibering af luciferasesignal (data ikke vist). Derfor har vi fokuseret vores indsats om gennemførelsen af GloSensor cAMP-teknologi ved at konstruere og karakterisere stabile cellelinjer ved hjælp af både deres "første" og "anden" generation GloSensor vektorer. Den GloSensor er en manipuleret luciferase reporter, der indeholder en cAMP-bindingssted i luciferase protein 35. Selv om systemet er meget nyttigt for kinetisk cAMP kvantificering fremgangsmåden ikke var effektiv til måling af agonist-induceret sensibilisering (Conley og Watts, upublicerede observationer). Vi udforskede også en BRET baseret cAMP biosensor 36 for vores studier som en omkostningseffektiv måde at vurdere cAMP akkumulering. Desværre baggrundsstøjen forbundet med transient transficeret biosensor begrænsede vores evne til at tilpasse denne fremgangsmåde til vores overfølsomhed assay. Endelig har vi vurderet flere kits ansætte homogen tid løst fluorescence (HTRF) som en metode til at måle cAMP i 384-brønds format. Vi fandt, at det etablerede metode var mest kompatible med akademiske laboratorier og screening faciliteter i, at de var robust, følsom, stabil og let at bruge. Den primære ulempe for akademiske forskere er omkostningerne af reagenser, dog samlet indkøb af reagenser og miniaturisering til 384 godt format gør prisen mere end konkurrencedygtig med andre kit, herunder ELISA baserede assays og vores tidligere "hjemmelavede" [3 H] cAMP protein bindingsassay 15.
Den repræsentative arbejde viser anvendeligheden af 384 brønde sensibilisering assay til undersøgelser af D2 dopaminreceptor induceret sensibilisering af AC signalering i rekombinante cellelinjer. I flere forundersøgelser, har vi brugt denne analyse med mindre modifikationer for at vurdere D 2 dopamin-receptoren og μ opioid receptor inducerede sensibilisering af mange forskellige AC-isoformer (Tabel 1). Disse undersøgelser fremhæve den generelle anvendelighed af den 384-brøndsassay til flere cellelinjer, receptorsubtyperne og AC isoformer. Der er interesseret i at udvikle lignende assayformater vil blive tilskyndet til at udforske variabler såsom celletæthed agonist forbehandling gange, AC aktivering protokoller / forhold, og HTRF cAMP detektionsmetoderne for deres cellulære modeller. Antagonisten heri viste data demonstrerer evnen af assayet til at identificere inhibitorer med små molekyler af sensibilisering. Styrken værdier er i overensstemmelse med dem, der bestemmes med andre funktionelle assays 28 samt affinitet (Ki) værdier opnået ved hjælp radioreceptor bindende assays (se: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php). Den nuværende assay design kan let rumme HTS indsats, hvor forbindelser er leveret via en pintool eller preplated i assay klar plader. Ud over de sensibilisering beskrevne assays, bør de metoder, der er anvendt her anvendes til andre annonceaptive assays hvor flere lægemidler / reagenser gjaldt forud for et slutpunkt foranstaltning i 384-brønds format.
Vi har forsøgt at fremhæve vigtige skridt for hele 384-brøndsassay udvikling, men også ønsker at bemærke, at udviklingen af de omvendte transfektion siRNA assays var særligt udfordrende. Vores langsigtede mål for disse analyser er at foretage et genom bred indsats for at identificere de overlappende og unikke gener involveret i heterolog sensibilisering af AC isoformer. Ved hjælp af vores indledende siRNA assay som en rettesnor, tilbyder vi følgende forkortede forslag for at udvikle en siRNA reverse transfektionsassays: (1) at undersøge transfektion effektivitet ved hjælp nøgletal for en indikator såsom Siglo og transfektionsreagens (. F.eks Lipofectamine 2000), (2) bestemme den optimale podningsdensitet (f.eks 500-5.000 celler / brønd), (3) udforske transfektion varighed (fx 48-96 timer) og (4) at vurdere egnede assaybetingelser (fx lægemiddel treatments, endepunkt foranstaltninger og omfattende kontrolforanstaltninger) for at opnå optimal signal (f.eks Z 'faktor analyse). Yderligere detaljer og mere generel information om brugen af siRNA i screening bestræbelser kan også findes i de tidligere refererede metoder artikler 29,30. De forskere, som er interesseret i HTS bestræbelser bør også undersøge tilpasningsevne deres analyser til automatisering (f.eks. Pintool og robotteknologi). Herudover kan andre faktorer eller styringer til screening bestræbelser omfatter formel assay validering, cellelevedygtighedsassays, og passende counter skærme. For yderligere vejledning, vil den interesserede læser opfordres til at undersøge NCGC Assay Vejledning kan fås via NCATS på: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/.
Vi har beskrevet vores tilgang til at strømline en møjsommelig multiday assay til et effektivt "mix og læse" analyse, der kan udføres på en enkelt dag. De her beskrevne metoder og ennylig undersøgelse af 1.280 forbindelser i μopioid receptor induceret sensibilisering i 1.536-brønds format 25 tyder på, at sensibilisering nu let kan spørges ved hjælp af HTS. Den her beskrevne assay er modtagelig for lille molekyle afprøvning og kan anvendes til genetiske tilgange såsom siRNA. Vores assayformat er fokuseret på den adaptive respons er kendt som heterolog sensibilisering af AC, men kan den generelle holdning og metoder i vid udstrækning anvendes på andre cellebaserede assays, der kræver flere narkotika-og reagenstilsætninger (f.eks desensibilisering og neuroprotektion.). Arbejdet rapporteret her er let at gennemføre inden for en akademisk indstilling ved hjælp multikanalpipetter og en multi-mode Pladelæser læse det ønskede endpoint i 384-brønds format.
Tabel 1. Cellulære modeller testes for agonist-induceret sensibilisering.
| Receptor | AC Isoform | Cellelinie | Sensibilisering signal |
| D 2L dopamin | Endogen (AC6 og AC7 27) | CHO-D 2L | 2-3 gange |
| D 2L dopamin | Rekombinant AC2, AC5 og AC6 | HEK 293 stabilt transficeret | AC2 = 2-3 gange AC5 = 50 fold AC6 = 15 gange |
| μ opioid | Rekombinant AC1, AC2, og AC5 | HEK 293 stabilt transficeret | AC1 = 6-7 fold AC2 = 2-3 gange AC5 = 10-15 gange |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Mr. Richard Zink og Todd Wiernicki for metodisk træning og assay vejledning. Vi takker også Johannes Paul Spence omhyggelig læsning og redaktionelle forslag. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health MH 060.397, Brain and Behavior Research Foundation, og Eli Lilly and Company gennem Lilly Research Award Program (LRAP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384-well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase- and RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Nontargeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J.
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
