Summary
아데 닐릴 시클 라제 시그널링의 억제 감작있는 G 단백질 결합 수용체 결과의 지속적인 활성화. 필수 분자 경로를 식별하기 위해 nonbiased 접근이 필요하지만,이 전략은 확장 셀 기반 캠프 민감성 분석의 개발이 필요합니다. 여기서, 우리는 작은 분자 및 siRNA의 검사에 대한 민감성 분석을 설명합니다.
Abstract
아데 닐 레이트 사이 클라 제 (AC) 신호의 과민 반응은 약물 남용 및 파킨슨 병 등의 신경 정신 및 신경 질환의 종류에 연루되어있다. Gαi / O를 결합 수용체의 급성 활성화는 AC의 활성을 억제, AC의 이종 감작에있는이 수용체 결과의 지속적인 활성화 및 세포 내 cAMP의 수준 증가하는 반면. 이전 연구는 AC의 응답 성이 향상이 D 2 도파민을 포함하고 오피오이드 수용체를 μ Gαi / O를 결합 수용체의 여러 종류의 만성 활성화 다음 시험 관내 및 생체 내에서 모두 관찰되는 것을 증명하고있다. AC의 이종 감작이 처음 사십 년 전에보고했지만,이 현상을 기초 메커니즘 (들)은 크게 알려지지 않은 남아있다. 기계적인 데이터의 부족은 아마도 nonbiased 방법 식별에 도움을 수 있다고 제안,이 적응 응답과 관련된 복잡성을 반영AC의 이종 과민 반응에 관여하는 분자 경로를 보내고. 이전 연구는 AC의 이종 과민 반응을 조절하는 구성 요소를 중복으로 키나제 및 Gbγ 신호를 내포하고 있습니다. AC의 과민 반응과 관련된 독특하고 추가 중복 표적을 확인하기 위해, 확장 성 캠프 민감성 분석의 개발 및 검증은 처리량이 필요합니다. 과민 반응을 연구하는 이전 방식은 연속적인 세포 배양 유지 보수뿐만 아니라 다수의 세척 단계를 포함 cAMP의 축적을 측정하는 복잡한 방법을 포함 일반적으로 복잡하다. 따라서, 384 웰 포맷에서 높은 처리량 스크리닝 (HTS)에 사용할 수있는 강력한 세포 기반 분석의 발전은 미래 연구를 용이하게한다. 두 개의 D 2 도파민 수용체 세포 모델 (예. CHO-D 2L와 HEK-AC6 / D 2L)를 사용하여, 우리는 다섯의 우리의 48 잘 증감 분석 (> 20 단계 4 ~ 5 일) 변환 한TEP, 384 - 웰 형식으로 하루의 분석. 이 새로운 형식은 작은 분자 검사 의무이며, 우리는이 분석의 디자인도 쉽게 대상의 siRNA 라이브러리 심사의 기대에 siRNA를 역 형질 전환을 위해 사용될 수 있음을 보여줍니다.
Introduction
이종 또는 초 과민성으로 알려진 응답 신호 적응 아데 닐 레이트 사이 클라 제 (AC)를 첫 번째 노벨상 수상자, 마샬 박사 Nirenberg의 연구실에서 발견되었다. 박사 Nirenberg 만성 δ 아편 수용체 활성화 다음 관찰 증가 AC 응답이 아편 내성과 의존성 1에 관여하는 메커니즘이라고 제안했다. 만성 δ 아편 수용체 활성화뿐만 아니라, AC 신호의이 neuroadaptive 응답은 또한 여러 가지 다른 Gαi / O를 결합 수용체 2의 지속적인 활성화 다음 발생합니다. 특히,이 수용체의 대부분은 통증, 신경 정신 및 신경 장애와 연관 μ / κ 아편, D 2 / 4 도파민, 5HT 1A 및 M 2 / 4 무스 카린 수용체 2를 포함한다. 박사 Nirenberg의 발견에 더하여, 기록하는 큰 몸체의 양쪽 만성 오피오이드 수용체 활성화에 AC 신호의 감작을 연결 존재
이러한 연구는 중요한 신경 생물학적 대상으로 아데 닐 레이트 사이 클라 제의 민감성에 대한 메커니즘을 조사하기위한 이론적 근거를 제공한다. 마찬가지로, 개별 AC 아형이 적응 응답하여 홀드 8 시그널링 AC의 생리 학적 관련성 및 중요성도 2,9,10을 인식해야한다. 우리의 연구의 맥락에서, AC의 재조합 이소 형의 이종 감작과 관련된 일반적인 특징은 그 특성을 평행 데AC의 내생 이소을 공부 cribed. 특히, 이전의 연구는 Gαi / O 단백질 및 후속 릴리스 / 재 배열 βγ 서브 유닛의 활성화는 모든 AC 이소 형의 수용체에 의한 감작을위한 중요한 요구 사항입니다 것을 발견했습니다. 또한, 여러 연구는 단백질 키나아제 및 Gβγ 서브 유닛에서 신호가 과민성 2,11-13에 참여하는 것이 좋습니다. 개별 ACS는 또한 독특하고 뚜렷한 증감 패턴 (12)을 표시합니다. 밀접한 관련이 AC3는 2 민감하지 반면 예를 들어, 효능에 D 2 수용체의 지속적인 노출은, 칼슘 2 + / 칼 모듈 린의 자극 (14, 15)에 AC1 및 AC8의 과민 반응과 연관되어 있습니다. AC2, AC4, 및 AC7 밀접 단, PKC 자극 AC2 활동이 견고 7,14,16,17을 주작 동근하는 D 2 수용체의 장기간 노출 후 민감하고, 관련이 있습니다. 또한, AC5 및 AC6은 heter의 현저한 정도를 나타냅니다ologous D 2 수용체 14,18-20의 활성화에 다음과 같은 가스와 포스 콜린 자극 캠프 축적에 과민 반응하지만, Gβγ 서브 유닛 - AC에 대한 자신의 요구 사항에 차이가 나타납니다 (21)를 상호 작용. AC 감작의 대부분의 연구 모델 세포주 (예를 들어 HEK293 세포는 각각의 AC 이소 형을 표현하는)를 사용하고 있지만, 이러한 연구 결과는 원시 신경 세포 모델 4,22로 번역 것으로 보인다. 더 최근에, AC 아형을 발현하는 HEK293 세포에서 식별 AC 이소 선택적 소분자 억제제의 효과는 또한 생체 행동 연구 (23)로 변환 할 수있다.
이종 감작위한 식별 분자 메커니즘의 부족 가능성 적응 반응의 복잡성뿐만 아니라 AC가 12 이소 폼의 개별 고유 규제 특성을 반영한다. 그러한 복잡성을 이루는 것이 더욱 성가신 방법론 t의 사용에 의해 복잡모자 공정한 방법을 사용에서 학술 조사를 제한하고있다. 48 잘 조직 문화 형식 (15) - 예를 들어, 우리의 이전의 기계 론적 연구 (24)를 사용하여 지속적으로 배양 세포 모델을 사용하고있었습니다. 배양 된 세포는 일반적으로 48 시간 동안 성장하고 세포 세척 및 배양 일련의 (그림 1) 다음에 효능 약물 치료 (2-18 시간)을 실시 하였다. AC-이소 특정 캠프 축적 프로토콜 캠프 방법론 15,24 바인딩 노동력과 시간이 소요 [3 H]를 사용하여 캠프 축적 측정한다 사용 후했다. 각각의 분석을 위해 처음부터 끝까지 지속 기간은 일반적으로 세포 도금의 데이터 분석 (그림 1)에 4-5일 총이 필요합니다. 새로운 기술과 자동화의 응용 프로그램은 산업 및 HTS 센터 설정에 감작 연구에 표시된 향상되었다. 예를 들어, 케미을위한 국립 센터와 협력 그룹칼 유전체학은 2 하루 1,536 잘 형식 25 μ 오피오이드 수용체에 의한 감작의 작은 분자 억제제를 식별하기위한 분석 절차를 HTS 보도했다.
본 기사는 대부분의 학술 연구 기관에서 사용할 수있는 기술을 사용하여 이종 과민 반응의 연구를위한 HTS 분석을 개발하는 우리의 노력을 설명합니다. 이 전략은 heterologously 내인성 또는 개별 재조합 아데 닐릴 시클 라제 이소 폼 (CHO-D 2L 또는 HEK-AC6 / D 2 L)와 조합 D 2 도파민 수용체를 발현하는 세포 모델에서 냉동 보관 세포의 사용을 통합함으로써 달성되었다. 우리의 처리량을 개선하기 위해, 우리는 기본적으로 "혼합 읽기"이었다 384 - 웰 형식의 5 단계, 하루의 분석에 우리의 48 개 감작 분석 (4-5 일 동안 ca.> 20 단계)를 재 설계. 새로운 형식은 캠프 ACC를 측정하기 위해 시중에서 균일 한 시간 해결 형광 (HTRF) 분석을 사용하여멀티 모드 플레이트 리더와 손상 세포 umulation. 분석은 강력하고 작은 분자 검사 의무, 그리고 효과적으로 이종 과민 반응의 억제에 대한 화면으로 적용 할 수 있습니다. 또, 일반적인 방법으로 오직 사소한 수정을 가진 대상 또는 게놈 와이드 siRNA의 라이브러리 스크리닝 된 siRNA의 형질 감염과 역방향이 분석의 사용을 허용 데이터를 제공한다.
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Protocol
1. 분석 준비 세포의 확장과 냉동 보존
- 문화 CHO-K1-DRD 2L 1.0 μM의 L-글루타민, 800 ㎍ / μL의 G418, 300 ㎍ / ㎕의 하이 그로 마이신, 100 U / μL에게 보충 햄의 F12 미디어에서 15cm 2 세포 배양 접시에 (CHO-D 2L) 세포 페니실린, 100 개 / μL 스트렙토 μg, 10 % 소 태아 혈청 (FBS).
- 세포가 90 % -95 %의 합류 때까지 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. 10 ㎕의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 세포를 세척하고 37 ℃에서 5 분 동안 세포 분리 버퍼의 3 μl를 추가하여 세포를 수확 배양액 12 μl를 사용하여 세포를 재현 탁하고 트리 판 블루 배제를 이용하여 세포를 센다.
- 실온에서 5 분 동안 500 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 뜨는을 대기음 및 동결 미디어의 5 μL (10 % 디메틸 설폭 사이드, 90 % F에있는 세포 펠렛을 resuspendBS). 원하는 세포 농도 (예 1-20 × 106 세포 / μL)을 달성하기 위해 세포 현탁액을 희석.
- 각 cryovial에 셀 솔루션의 나누어지는 1.0 μL. -80 ° C 하룻밤에 셀 냉동 컨테이너에 cryovials을 품어. 장기 저장을위한 액체 N 2 탱크에 cryovials을 전송합니다.
2. 분석 준비 세포 (및 역 형질 옵션) 도금
- 빠른 속도로 37 ° C의 물을 욕조에있는 세포의 고정 cryovial을 해동. 세포를 해동되면, 옵티-MEM 15 μl를 함유하는 15 ㎕의 원뿔 튜브에 세포를 전송하고, 튜브 (3)-5X를 반전시켜 혼합한다.
- 실온에서 5 분 동안 500 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 1 ㎕의 옵티-MEM에있는 세포를 재현 탁.
- 세포 생존 능력을 결정하고 필요한 경우 (예. 3 × 105 세포 / μL 농도)에서 생존 세포를 희석하기 위하여 트리 판 블루 배제를 이용하여 세포를 세어OPTI-MEM. 플레이트는 조직 배양 세포의 10 μL / 잘은 멀티 채널 피펫을 사용하여 384 - 웰 플레이트를 처리.
- (권장 사항 제조에 따라 - 7 항 참조) 세포에 의해 캠프 생산을 추정하는 표준 곡선을 생성하는 옵티-MEM 캠프의 시리얼 희석합니다. 접시에 10 μL / 잘 캠프 표준의 추가 참고 :. 단일 표준 곡선 분석 플레이트 중 하나에 별도의 판 또는 빈 우물에 제조 할 수있다.
- 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기, 1 시간 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 알을 품다.
3. * siRNA의 형질 옵션 반전
이 섹션에서는 그림 3을 선택하고 관련이 있습니다.
- RNA 분해 효소가없는 DDH 2 O (예를 들어 0.4 pmol의 / μL)에서의 siRNA의 솔루션을 준비합니다. 384 - 웰 플레이트의 각각의 웰에 5 μl를 추가, 15 SE 100 XG에서 접시를 원심 분리실온에서 C.
- (예 : 옵티-MEM 1000 μL에 리포 펙 타민 2000 년 6 μl를 추가), 아래로 pipetting에 의해 혼합 0.006의 요인에 의해 옵티-MEM에서 리포 펙 타민 2000을 희석.
- 실온에서 5 분 동안 리포 펙 타민 2000/Opti-MEM 용액을 배양한다. 이미의 siRNA를 포함 384 - 웰 플레이트의 각각의 웰에 희석 리포 펙 타민 2000/Opti-MEM 솔루션의 5 μl를 추가합니다. 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기.
- 실온에서 30 분 동안 플레이트를 배양한다.
- (2 절) 전술 한 바와 같이 플레이트 분석 준비 세포. 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기.
- (토론 참조) 노크 타겟 유전자에 대한 결정에 따라 48 ~ 96 시간 동안 37 ° C (5 % CO 2)에 가습 인큐베이터 분석 플레이트를 돌려줍니다.
4. 작은 분자 스크리닝
- 옵티에 관심있는 약물 (예. 작은 분자 억제제)를 희석-MEM 원하는 최종 농도의 6 배. 시리얼 희석 휴대용 피펫 또는 액체 핸들링 스테이션을 이용하여 완료 될 수있다.
- 시험 화합물을 2.5 μL / 웰을 추가 또는 멀티 채널 피펫을 사용하여 웰의 측면에, 차량 (예 DMSO)을 함유하는 버퍼.
- 실내 온도 (배양는 선택 사항입니다)에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기.
5. 영구 작용제 치료
- 600 nm의 옵티-MEM에서 quinpirole 용액 (100 ㎚의 예. 6 번 원하는 최종 농도)를 준비합니다.
- 2.5 μL / 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 우물의 측에 600 nm의 quinpirole 솔루션을 추가합니다.
- 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기, 2 시간 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 알을 품다.
6. 캠프 축적의 자극
- 2 시간 배양시 stimulati 준비옵티-MEM 용액에. 자극 용액을 40 μM의 포스 콜린으로 구성되어 2 μM 3 - 이소 부틸 -1 - methyxanthine (IBMX) 및 4 μM 스피 페론의 (6 단계의 모든 농도는 원하는 최종 농도의 4 배된다).
- 5 μL / 웰의 멀티 채널 피펫을 사용하여 웰 측으로 자극 용액을 추가.
- 실온에서 15 초 동안 100 XG에 플레이트를 원심 분리하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
7. 캠프 축적의 냉각 및 추정
- 세포에 의해 cAMP의 생산은 제조업체의 지시에 따라 cAMP를 동적 2 키트를 사용하여 측정된다. 간단히, 증류수 안티 캠프 - 크립 테이트 및 캠프-D2를 재구성. 단기 저장을 위해 -20 ° C에서 분주 동결.
- 작업 솔루션을 만들 수있는 제조 업체의 지침에 따라 용해 버퍼에 방지 캠프 - 크립 테이트 중 하나가 나누어지는 개별적으로 캠프-D2 중 하나가 나누어지는을 희석.
- 체크인 yyyy 방지 캠프 - 크립 테이트 작업 용액 10 μL / 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 384 - 웰 플레이트에 캠프-D2의 작업 솔루션의 10 μL / 잘.
- 실온에서 15 초 동안 100 XG에 플레이트를 원심 분리하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
- 337 ㎚의 여기를 사용하여 형광 플레이트 리더 (감도 자동 스케일 설정)의 판을 읽고마다 620 ㎚, 665 ㎚에서 배출량을 측정 지침을 제조하고 있습니다.
- 당 평가하는 비율 계량 분석을 적용 캠프의 표준 곡선은 지침을 제조하고 있습니다. 결과 값을 사용하여 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 테스트 웰에서 추정 된 cAMP의 축적을 추정.
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Representative Results
시판 셀 모델을 사용하여 소분자 저해제를 식별하기 위해 384도 이종 감작 분석법 개발 부품 I..
세포 모델에서 이종 과민 반응을 연구하기 위해, 우리는 "혼합 읽기"형식으로 분석을 간소화 할 수있었습니다 개선의 번호를했다. 키의 여러 변형이 아래 강조되고 논의에서 더욱 상세히 설명된다. 첫 번째 중요한 단계는 냉동 보관 된 세포 (26)에 지속적으로 배양 된 세포에서 우리의 세포 배양을 수정했다. 우리는 지금 일상적 × 10 1-20 6 세포 / μL 사이의 농도에서 세포의 배양 배치 냉동 보존 할 수있다. 각각의 분석의 경우, 세포 주식은 해동 희석 계산 한 다음 384 - 웰 플레이트에 직접 도금되어있다. 배양 기간의 필요성을 제거하고 분석의 편리 성을 증가시킨다. 우리의 이전의 민감성 분석의 형식은 48 - 웰, 담배 마는 활용UE 배양 플레이트, 및 세척, 캔트, 전송 단계 (그림 1) 결합 분석법을 여과 기반의 [3 H] 캠프의 번호를 포함. 따라서, 과민성이 형식은 높은 처리량 응용 프로그램에 순종하지 않았다. 따라서, 우리는 96 - 웰과 높은 처리량 검사에 수정할 수있는 다음 384도 형식으로 먼저 분석을 간소화하기 위해 상당한 노력을 끼쳤다. 세척 단계와 문화 / 분석 플레이트의 여러 유형의 평가를 최적화 참여 제거, 다양한 세포 밀도 및 다른 배양 기간. 우리는 또한 캠프 검출을위한 몇 가지 방법을 살펴 본 프로토콜에 사용되는 잘 특징 HTRF 캠프 기술은 높은 재현성, 신뢰성, 매우 안정적인 것으로 나타났습니다. 이 분석 플랫폼은 키트에서 제공하는 세포에 의해 생산 및 캠프 (예. 캠프-D2)로 표시된 캠프 사이 immunocompetition을 기반으로합니다. 우리는 성공적으로 이종 sensit을위한 프로토콜을 개발하고 적용했습니다본질적으로 384도 형식의 화 (오른쪽 패널 그림 1) "혼합 읽기".
내생 AC6을 표현하고 AC7 27이 : 우리의 초기 목표는 상업적으로 이용 가능한 CHO-D 2L 세포 (NM_000795 인간 DRD 2L, 접근 번호)를 사용하여 높은 처리량 D 2L 수용체의 민감성 분석을 생성하는 것이 었습니다. 냉동 보관 된 CHO-D 2L 세포는 잘 384 - 웰 조직 배양 플레이트에 3,000 세포 / 팅하고, 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간 동안 평형화 하였다. 플레이트를 인큐베이터 실온에서 첨가 하였다 quinpirole D 2 작용제의 증가 농도에서 제거 하였다. 세포는 다음 배양기에서 37 ° C에서 2 시간 동안 배양 하였다. 사이 클릭 AMP 축적 후, 10 μM의 포스 콜린 (AC의 직접적인 활성화 제)의 첨가에 의해 개시 하였다. 캠프 누적 버퍼는 포스 포 디에스 테라 제 억제제, 이소 부틸 메틸 (IBMX 포함), 캠프 축적 기간 동안 잔류 D 2 수용체의 활성화를 방해하기 위해뿐만 아니라 D 2 길항제, 스피 페론 (1 μM, D, 2 L = 0.07 NM)에 대한 K I,. 세포를 실온에서 1 시간 동안 배양 하였다. 분석은 HTRF 캠프 시약을 함유하는 용해 버퍼를 첨가하여 종결시켰다. 연구 quinpirole와 2 시간의 전처리 이종 감작 (그림 2A)과 일치 용량 의존적으로 후속 포스 콜린 자극 캠프의 축적을 강화 것으로 나타났다. 이 실험의 결과는 과민성 분석법은 384 - 웰 포맷에서 수행 될 수 있다는 것을 보여준다. 새로운 분석 형식은 만들기 세척 또는 캔트 단계의 필요성 "혼합 읽기"분석 (그림 1)없이 더 이상 20-4 단계에서 단계의 수를 감소시켰다.
실험의 두 번째 시리즈는 새로운 능률적 인 분석이로 활용 될 수 있는지의 여부CHO-D 2L 모델에 대한 과민성 ssess 억제제. 냉동 보관 된 CHO-D 2 L 세포 / 웰 옵티-MEM에서 3000 세포의 밀도로 384 웰 조직 배양 플레이트에 플레이 팅 하였다. 알려진 D 2 길항제 D 2 수용체 유발 과민성을 차단 하였다. 100 nm의 quinpirole (최종 농도)를 함유 OPTI-MEM이어서 15 ㎕의 총 부피에 첨가하고, 세포를 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 2 시간 동안 배양 하였다. 배양 후, cAMP의 축적이 포스 콜린 (10 μM 최종 농도)의 직접 첨가에 의해 개시시키고, 분석 종료 및 캠프 HTRF를 사용하여 측정 하였다. 초기 결과는 스피 페론 또는 할로페리돌 (프로토 타입 D 2 길항제) 포스 콜린 완전히 방지 quinpirole 유도 민감성 전처리 캠프 축적 (그림 2B)를 자극 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는이 방법은 작은 식별하기 위해 이용 될 수 있다는 것을 검증을 제공한다D 2 수용체에 의한 과민 반응의 분자 억제제. 두 번째 실험에서, 우리는이 화합물이 과민 반응을 억제하는지 여부를 테스트하기 위해 D 2 길항제의 일련의 효능을 평가하기 위해이 방법을 사용했다. 이전의 결과와 유사하게,이 연구는 D 2 길항제 용량 의존적으로 (그림 2C)에서 작용제에 의한 과민 반응을 억제 것을 보여 주었다. 과민 반응의 억제를위한 힘의 순위는 D 2 수용체 길항제 및 D 2 수용체 28에서 자신의 이전에 기술 약리학과 같은 자신의 행동과 일치했다.
파트 II. 심사 노력의 siRNA를 역 형질에 대한 384도 민감성 분석의 응용 프로그램입니다.
우리의 다음 목표는 확장 성 역 형질의 siRNA 라이브러리 검사를 수행하는 데 사용할 수있는 384도 민감성 분석을 개발하는 것이 었습니다. 예비 연구했다및 AC6 (쥐 ADCY6, 기탁 번호 : NC_005120) (즉, HEK-AC6 / D 2 L 세포) : heterologously D 2L의 도파민 수용체 (NM_012547 쥐 DRD 2L, 접근 번호)을 모두 표현 HEK 세포 모델을 사용하여 수행. 첫 번째 실험은 세포주에서 AC의 작용제 유발 과민성을 입증하는 능력을 평가 하였다. 간단히, 냉동 보관 AC6 / D 2L 세포는 384 - 웰 조직 배양 플레이트 (1000 세포 / 웰) 플레이 팅 하였다. 1 μM의 quinpirole (최종 농도)를 함유 OPTI-MEM 15 ㎕의 총 부피에 첨가하고, 세포를 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 2 시간 동안 배양 하였다. 배양 후, 캠프 축적은 포스 콜린의 농도를 증가의 추가에 의해 시작되었다. 분석은 HTRF 시약을 함유하는 용해 버퍼를 첨가하여 종결시켰다. 결과는 2 시간 동안 작용제 quinpirole에 세포의 노출 포르 스 콜린 자극 캠의 현저한 향상을 주도 것으로 나타났다P 축적 (그림 3A). 100 nm의 포스 콜린의 300 nm의 모두에서 캠프의 축적이 증가는 차량 처리 된 세포 (그림 3A)에 비해보다 15 배이었다.
다음으로, 우리는 siRNA의 다양한 역 형질 전환 조건의 평가에 포함 우리의 최적화 노력 안내 (29, 30)를 방법론 (예를 들면 등 형질 전환 시약, 형질 전환 효율, 세포 밀도, 배양 시간을.) 발행에 사용됩니다. 예비 연구에서 최적의 역 형질 감염 조건을 결정하기 위해 리포 펙 타민 2000과 조합 siGloRed, 형질의 지표를 사용했다. 실험은 0.03 μL의 리포 펙 타민 5분의 2,000 ㎕의 옵티-MEM과 함께 2-4 pmol의 siRNA를 / 5 μL의 H 2 O (데이터는 제시하지 않음) HEK 세포에서 어떤 관찰 독성없이 72 시간에서 약 95 %의 형질 전환 효율을 제공하는 것으로 나타났다. 우리는 그 다음 이종 감작에 Gαs의 siRNA의 효과를 살펴 보았다의 포스 콜린 AC6 / D 2 L 세포에서 cAMP의 축적을 자극. Gαs 여러 AC 이소 형 (예 : AC1, AC2, AC5 및 AC6) 19 ~ 21에 이종 감작의 핵심 구성 요소로 확인 되었기 때문에 가스의 siRNA는 잠재적 인 긍정적 인 제어로 제안되었다. 더욱이, 우리 AC6 / D 2L 셀 모델 (도 3a)에서 15 배 증감 신호는 역 형질 감염의 효율을 평가하기 위해 노이즈 창으로 강력한 신호를 제공한다. 상술 한 조건을 사용하여, 우리는 양성 대조군으로서 Gαs의 siRNA를 평가 예비 연구를 완료하고, 우리의 결과는 과민성 (데이터 미도시)의 강력한 봉쇄 (> 90 %)를 보여 주었다.
과민성 신호의 극적인의 siRNA에 의한 감소는 siRNA의 심사 과정에 적절한 양의 제어를 제공합니다. AC 이종 감작의 siRNA의 심사에 대한 정량적 평가를 얻으려면, 우리는 자료를 생성Z '인자 AC6 / D 2L 셀 (31)을 사용하여 시험 조건의 시리즈에 대해 계산 하였다. 이 실험을 위해, 우리는 0.03 μL의 리포 펙 타민 5분의 2,000 ㎕의 옵티-MEM마다 잘 384 - 웰 플레이트 (총 부피 10 μL)과 5 μL에서, 2 pmol의 Gαs siRNA를, 또는 비 대상으로 siRNA의 제어를 결합했다. 동결 보존 균체 해동 옵티-MEM에 재현 탁하고 여러 세포 밀도를 사용 된 siRNA / 리포 펙 타민 혼합물을 함유하는 개별 웰에 첨가 하였다 (즉. 500 ~ 5,000 cells/10 μL / 웰). quinpirole 처리 (2 시간 대 18 시간)뿐만 아니라, 포르 스 콜린의 최종 농도 (100 ~ 300 NM)의 지속 시간은 또한 우리의 AC6 / D 2L 감작 분석에서 탐구했다. 750 세포 / 웰, 72 시간의 형질 전환 시간, 2 시간의 quinpirole 처리, 및 캠프 축적 (그림 3B)를 자극하는 300 nm의 포르 스 콜린 :.이 실험의 결과는 강력한 Z '요소는 다음과 같은 조건에서 얻어진 것으로 나타났다 이러한 협력에서nditions, 우리는 Gαs의 siRNA의 존재의 94 % 감소 된 15 배 과민 반응을 얻을 (대 Gαs siRNA의 0.6의 Z '를.의 siRNA를 제어).
도 1. 전통적인 형식에서, 세포는 48 - 웰 포맷으로 도금하고 48 시간 동안의 합류로 성장된다. 성장 배지는 경사 소분자 저해제를 첨가, D 2 작용제 첨가하여된다. 2 시간의 배양 후, 분석은 미디어 경사 분리하고 세포를 세척 / 상등액의 일련의 단계로 실시된다. 다음으로, AC는 자극하고 세포 용균. 사이 클릭 AMP 축적 후, 여과 공정 및 섬광 계수를 요구 이일 분석법이다 [3 H] cAMP의 결합 분석을 사용하여 평가된다. 동안 96 웰 형식 elimin세척 및 캔트 여러 단계 ated, 우리는이 형식은 HTS 또는 자동화에 쉽게 의무가없는 것으로 나타났습니다. HTS 형식은 384 - 웰 플레이트에 직접 도금되어 냉동 보관 된 세포를 사용합니다. 이 냉동 보관 된 세포는 1 시간 평형 다음 "준비 분석 실험"입니다. 초기 배양 기간 후, 소분자 억제제는 2 시간 배양을위한 D 2 작용제 첨가하여 첨가 할 수있다. AC는 자극되며, 세포 분석 플레이트에 HTRF 검출 시약을 사용하여 용해된다.
그림 2. 냉동 보관 CHO-D 2L 세포를 3000 세포 / 웰에 384 웰 분석 플레이트에 직접 도금 1 시간. A.에 대한 평형) D 2 작용제, quinpir의 농도가 증가 하였다OLE, 첨가하고, 세포 배양기에서 37 ° C에서 2 시간 동안 배양 하였다. 사이 클릭 AMP 축적을 실온에서 1 시간 동안 IBMX 및 스피 페론의 존재 하에서 10 μM의 포스 콜린 (최종 농도)로 자극 하였다. 반응물 HTRF 캠프 분석 시약 (N = 1, 적어도 세 실험의 대표)을 사용하여 급냉시켰다. 데이터가 차량 - 처리 세포의 백분율 반응으로 표현된다. B.) CHO-D 2L 세포 부재 (대조군) 또는 지시 D 2 수용체 길항제 (즉 스피 페론 또는 할로페리돌)의 존재하에 예비 처리 하였다. Quinpirole (는 100nM)을 첨가하고, 세포를 감작을 유도하기 위해 2 시간 동안 배양 하였다. AC 실온에서 1 시간 동안 10 μM의 포스 콜린 (최종 농도)로 자극 하였다. 환상 AMP가 HTRF를 사용하여 측정 하였다. 데이터는 =. C.) CHO-D 2L 세포 부재 (제어 전처리 된 차량 - 처리 세포의 백분율로서 표현되는 반응100 %) 또는 지시 D 2 수용체 길항제의 농도 증가의 존재. Quinpirole (는 100nM)을 첨가하고, 세포를 감작을 유도하기 위해 2 시간 동안 배양 하였다. AC 실온에서 1 시간 동안 10 μM의 포스 콜린 (최종 농도)로 자극 하였다. 환상 AMP가 HTRF를 사용하여 측정 하였다. 데이터가 quinpirole에 의한 과민성 반응의 백분율로 표현하면. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 냉동 보관 된 HEK-AC6 / D 2L 세포를 1000 세포 / 웰에서 도금과 1 시간 동안 평형을했다. A.) 세포는 차량이나 배양기에서 2 시간 동안 100 nm의 quinpirole으로 배양 하였다. AC 웨스턴 오스트 레일 리아실온에서 1 시간 동안의 포스 콜린 농도의 증가와 함께 자극의. 사이 클릭 AMP는 AC6 / D 2 L 세포에서 Gαs siRNA의 블록 감작 HTRF. B.) 역 형질을 사용하여 측정 하였다. Gαs의 siRNA 또는 siRNA를 nontargeting 제어 (2 pmol의)은 10 ㎕의 총 부피에서 0.03 μL Lipofectamine2000 (리포)와 결합시키고, 용액을 384 - 웰 플레이트의 개별 웰에 첨가 하였다. 냉동 보관 AC6 / D 2L 세포는 그 반대 형질에 대해 추가 및 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 70 시간 동안 배양 하였다. D 2 수용체 작용제는 quinpirole (1 최종 μM), 또는 차량은 2 시간 배양 한 다음에 추가되었습니다. 사이 클릭 AMP의 축적은 1 시간 동안 300 nm의 포르 스 콜린 (최종 농도)로 자극 및 HTRF를 사용하여 측정 하였다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이종 과민 반응의 연구를 촉진하기위한 노력의 일환으로, 우리는 광범위하게 우리의 이전 방법 효율적인 달성을 수정했습니다 "혼합 및 읽기"높은 처리량 검사 및 행동 검사의 메커니즘을 수정할 수있는입니다 형식. 다음과 같이 우리의 프로토콜에 큰 변형이 요약 될 수있다 : 1) "분석 준비"시약 등의 동결 보존 세포의 사용, 384 - 웰 포맷으로 분석의 2)의 소형화와, HTRF 둘레 3) 사용률 캠프.
우리의 세포 기반 분석을위한 냉동 보존의 채용이 크게 일 실험과 심사 노력에 우리가 하루에 대한 효율성과 재현성을 향상되었습니다. 이러한 접근 방식은 업계 표준으로, 용이 26 설정 학술 연구로 번역 될 수있다. 세포 배양 효율을 향상시키기 위해 세포의 바이알, 해동 희석하고 384 - 웰 플레이트 FO에 직접 도금되는 해당 셀 축적량 「선반 용 시약 off "로 사용각 분석 연구. 우리는 이전 무척추 G 단백질 결합 수용체 (32, 33)의 길항제를 식별하기위한 연구에서 냉동 보관 된 세포를 포함. 이 방법은 초기 작업이 우리의 실험실에서 수행 과제를 제시하고 가능성이 변동성을 도입 캠퍼스에서 배양 된 세포를 운반 할 필요하게되지 않았 음에 유리했다. 새로운 접근 방법을 이용하는, 동결 세포는 이제 직전 분석의 개시에 녹여서 사이트에 희석 될 수있다. 재현성을 향상시킬뿐 아니라, 또한 냉동 보존 분석 실행을 도금 셀로부터 48 시간의 시간주기 (도 1)를 제거. 우리는 성공적으로 캠프의 축적과 β-arrestin는 모집 (부르 스트, TF, Ejendal, KFK 및 와트, VJ되지 않은 관찰) 등의 기능 판독과 재조합 수용체 ACS 시스템의 하위 유형의 다양한 사용하여 안정적이고 일시적인 형질 전환 연구에서 냉동 보존 방식을 적용했습니다 . 데스지금까지 우리의 긍정적 인 경험을 피테, 연구자들이 수용체 또는 대상 및 모델 전지 시스템은 이전의 어떤 큰 규모의 연구를 시작으로 냉동 보존과 호환되는지 확인해야합니다.
캔트의 민감성 분석 관련 제거를 간소화하고 (그림 1)과 같이 세척하는 우리의 노력에 중요한 두 번째 수정. 이러한 변화는 96 - 웰 형식 (콘리 및 와트, 게시되지 않은 관찰)에 대한 분석의 우리의 소형화와 동시에했다. 구체적으로는, 개질 감작 프로토콜 (중간 패널도 1 참조)의 cAMP 축적이 어떠한 세척 또는 캔트 단계 부재시 D 2 작용제 인큐베이션 다음 분석 완충액에서 포스 콜린의 직접 첨가에 의해 개시 하였다 여기서 설계되었다. 또한, cAMP의 축적 버퍼 스피 페론의 비교적 높은 농도 (1 μM), D이 0.07 ㎚의의 Ki 값을 갖는 D 2 길항제를 포함15 수용체. 이 100 따라서 포르 스 콜린 동안 작용제에 의한 잔류 D 2 수용체 활성화 (예 : quinpirole)을 배제, 캠프 축적 단계에서 완전한 D 2 수용체의 직업에 스피 페론 결과를 초과하는 농도를 배 AC 단계 (15)는 자극. 이러한 변화는 초기 작용제 배양 다음과 같은 세 가지 캔트 세 세척 단계를 제거. 96 - 웰 형식 개발의 일환으로, 우리는 또한 담금질 이전과 세포를 용해하는 최종 캔트 단계를 제거 할 수 있었다. 3~9% 및 cAMP의 축적 버퍼에 직접 시약을 첨가하는 단계; (TCA. 즉, 트리클로로 아세트산)이 변형은 우리 용균 시약의 농도를 증가시킴으로써 달성되었다. 수정 된 96 웰 민감성 분석의 유망한 결과는 384도 형식으로 감작 분석의 전환에 대한 지원을 제공했다. 불행하게도, 캠프를 정량화를위한 우리의 이전 방법은 힘든 filtratio했다N-기반의 [3 H] 캠프 단백질 결합 분석 (> 5 단계). 예를 들어, 분석은 일반적 15,24 카운팅 필터 건조 및 섬광 있도록 이일의 과정을 통해 완성된다. 이러한 단점은 높은 처리량 384도 형식에 활용하는 실용적이지 바인딩 [3 H] 캠프 단백질을했다.
세 번째 주요 개발은 384도 형식에 순종하는 방식으로 캠프를 측정하고 정량화 방법의 결합을 통해 온. 예를 들어, 우리의 cAMP 반응 요소 (CRE) - 루시퍼 라제 계 384 - 웰 포맷 (32,33)에서 상대적 cAMP를 측정 리포터 시스템을 사용하여 상당한 경험. 이 방법은 성공적으로 Gαs 결합 수용체의 많은 연구를 위해 실험실에서 사용되었지만, CRE-루크 기자는 심사 분석 34시 오탐 (false positive)과 부정의 숫자 될 수 있습니다. 이 응용 프로그램과 또한 우리의 예비 D 2 과민성 연구바퀴벌레는 우리가 루시퍼 신호 (데이터 미도시)의 겉보기 피드백 억제를 관찰하는 것을 장려되지 않았다. 따라서, 우리는 모두 자신의 "처음"을 사용하여 안정적인 세포주와 "두 번째"세대 GloSensor 벡터를 구성하고 특성화하여 GloSensor 캠프 기술의 구현에 우리의 노력을 집중했다. GloSensor는 루시퍼 라제 단백질 35 내 cAMP의 결합 부위를 포함하는 설계 루시 페라 제 기자입니다. 시스템이 운동 캠프 정량화에 매우 유용하지만,이 방법은 작용제에 의한 감작 (콘리 및 와트, 게시되지 않은 관찰)을 측정하는 효과가 없었습니다. 우리는 또한 캠프의 축적을 평가하는 비용 효과적인 수단으로 우리의 연구를위한 BRET 기반 캠프 바이오 센서 (36)를 탐험했다. 불행하게도, 일시적으로 형질 전환 된 바이오 센서와 관련된 잡음은 우리의 민감성 분석에이 방법을 적용 할 수있는 능력을 제한했다. 마지막으로, 우리는 동질적인 시간 해결 불소를 이용한 여러 가지 키트를 평가384 - 웰 형식으로 캠프를 측정하는 방법으로 escence (HTRF). 우리는이 확립 된 방법론들이 강력한 민감한, 안정, 사용하기 쉬운 있다고 학술 연구소 및 검사 시설과 가장 호환 것으로 나타났습니다. 학술 연구자의 기본 단점은 시약의 비용, 시약 및 384 웰 형식으로 소형화 그러나 대량 구매 ELISA를 기반으로 분석하고 이전의 "수제"[3 H] 캠프 단백질 등의 다른 장비와 가격이 더 이상 경쟁력을 만드는 것입니다 분석 (15)를 결합.
대표적인 작품은 재조합 세포주의 AC 신호의 D 2 도파민 수용체에 의한 과민 반응의 연구에 384도 과민성 분석의 적용 가능성을 보여줍니다. 몇 가지 예비 연구에서, 우리는 D 2 도파민 수용체를 평가하기 위해 약간의 수정이 분석을 사용하고 (여러 AC 이소 형의 오피오이드 수용체에 의한 과민 반응을 μ표 1). 이러한 연구는 여러 세포주 수용체 서브 타입, 및 AC 이소 폼을 384 - 웰 분석의 일반적인 적용을 강조. 유사한 분석 포맷을 개발에 관심있는 사람은 세포 밀도, 효능 전처리 시간, AC 활성화 프로토콜 / 조건, 자신의 휴대 전화 모델에 대한 HTRF 캠프 검출 방법 등의 변수를 탐구하도록 격려 할 것입니다. 본원에 제시된 데이터는 길항제 감작 소분자 저해제를 식별하는 분석의 능력을 보여준다. 힘 값 (: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php 참조) 다른 기능 분석 (28)뿐만 아니라 결합 분석을 radioreceptor을 사용하여 얻은 친 화성 (기) 값을 결정하는과 일치한다. 본 분석의 디자인은 쉽게 화합물 pintool 통해 전달하거나 분석 준비가 접시에 예비 도금되는 HTS 노력을 수용 할 수 있습니다. 설명 감작 분석법 외에도, 여기서 적용된 방법론은 다른 광고에 적용되어야여러 약물 / 시약 384 - 웰 포맷으로 이전 종료점 측정에 적용 aptive 분석법.
우리는 전체 384도 분석을위한 중요한 발전 단계를 강조하기 위해 시도뿐만 아니라, 역 형질의 siRNA 분석의 개발이 특히 어려웠습니다주의 할있다. 이러한 분석에 대한 우리의 장기적인 목표는 AC 이소 형의 이종 감작에 참여 중복 및 고유 유전자를 식별 할 수있는 게놈 넓은 노력을 수행하는 것입니다. 지침으로 종전의 siRNA의 분석을 이용하여, 우리는 siRNA의 역방향 형질 분석법 개발을위한 다음의 약칭 제안을 제안한다 : (1) 예 시글 및 형질 감염 시약 (. 예 리포 펙 타민 2000) 등의 표시의 비를 이용하여 형질 전환 효율을 조사, (2) 최적의 시딩 밀도 (예를 들면 500 ~ 5,000 세포 / 웰)을 결정, (3) (예를 들어 48 ~ 96 시간)을 형질 전환 기간을 탐색하고, (4) (예를 들면 약물 TR에게 적절한 분석 조건을 평가할최적의 신호 (예를 들어 Z '요인 분석)을 달성하기위한 eatments, 엔드 포인트 조치, 강력한 컨트롤). 추가 세부 사항과 심사 노력에의 siRNA의 사용에 대한 일반적인 정보는 이전에 참조하는 방법 기사 (29, 30)에서 찾을 수 있습니다. HTS의 노력에 관심이있는 이들 조사는 또한 자동화 (예. pintool 및 로봇)에 자신의 분석의 적응성을 탐구한다. 또한, 심사의 노력에 대한 다른 요소 또는 컨트롤은 형식적인 분석 검증, 세포 생존 능력의 분석, 적절한 카운터 화면이 (가) 있습니다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/ 자세한 지침은 관심있는 독자는에서 NCATS를 통해 사용할 수있는 NCGC 분석 지침 설명서를 읽어 보시기 바랍니다 될 것입니다.
우리는 효율적으로 힘든 며칠에 걸친 분석을 합리화 "믹스와 읽기"하루에 수행 할 수있는 분석을위한 우리의 접근 방식을 설명했다. 여기에 설명 된 방법론과1,536 잘 형식 25 μopioid 수용체에 의한 과민성 1,280 화합물의 최근 연구는 과민성 지금 즉시 HTS를 사용하여 심문 할 수 있다는 것을 시사한다. 여기에 설명 된 분석은 저분자 테스트에 순종하며 이러한 siRNA와 같은 유전 적 접근법에 적용 할 수있다. 그러나, 일반적인 접근과 방법이 널리 여러 약물 및 시약 추가 (. 예를 들면 감도 저하 및 신경 보호)을 필요로하는 다른 세포 기반 분석에 적용 할 수있는, 우리의 분석의 형식은 AC의 이종 감작로 알려진 적응 반응에 초점을 맞추고 있습니다. 여기에보고 된 작업은 쉽게 멀티 채널 피펫 및 384 - 웰 포맷으로 원하는 엔드 포인트를 판독 할 수있는 멀티 모드 플레이트 리더를 사용하여 설정 학술 내에 달성된다.
표 1. 셀룰러 모델은 작용제에 의한 과민 반응에 대한 검사.
| 수용체 | AC 이소 | 세포주 | 과민성 신호 |
| D 2L 도파민 | 내생 (AC6 및 AC7 27) | CHO-D 2L | 2 ~ 3 배 |
| D 2L 도파민 | 재조합 AC2, AC5 및 AC6 | 안정적으로 형질 전환 된 HEK 293 | AC2 = 2 ~ 3 배 AC5 = 50 배 AC6 = 15 배 |
| μ 오피오이드 | 재조합 AC1, AC2 및 AC5 | 안정적으로 형질 전환 된 HEK 293 | AC1 = 6 ~ 7 배 AC2 = 2 ~ 3 배 AC5 = 10 ~ 15 배 |
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 방법론 교육 및 분석 지침 씨 리처드 아연 토드 Wiernicki을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한주의 읽기 및 편집 제안 요한 바오로 스펜스 감사합니다. 이 작품은 국민 건강 MH 060397, 두뇌와 행동 연구 재단과 일라이 릴리의 연구소와 릴리 연구 상 프로그램 (LRAP)를 통해 회사에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384-well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase- and RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Nontargeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
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