Summary
Ihållande aktivering av hämmande G-proteinkopplade receptorerna ger sensibilisering av adenylylcyklas signalering. För att identifiera de grundläggande molekylära vägar, nonbiased metoder är nödvändiga, men kräver denna strategi att utveckla en skalbar cellbaserade cAMP allergi analys. Häri beskriver vi en allergi test för små molekyler och siRNA screening.
Abstract
Sensibilisering av adenylylcyklas (AC)-signalering har varit inblandad i en mängd olika neuropsykiatriska och neurologiska störningar inklusive drogmissbruk och Parkinsons sjukdom. Akut aktivering av Gαi / o-kopplade receptorer hämmar AC-aktivitet, medan ihållande aktivering av dessa receptorerna ger heterologa sensibilisering av AC och ökade nivåer av intracellulär cAMP. Tidigare studier har visat att denna ökning av AC respons observeras både in vitro och in vivo efter den kroniska aktiveringen av ett antal olika Gαi / O-kopplade receptorer, inklusive D-2 dopamin och μ-opioidreceptorer. Även heterologa sensibilisering av AC rapporterades först fyra decennier sedan, den mekanism (er) som ligger bakom detta fenomen i stort sett okända. Bristen på mekanistiska data förmodligen speglar komplexiteten med detta adaptiv respons, vilket tyder på att nonbiased tillvägagångssätt skulle kunna hjälpa till att identifieraning de molekylära vägar som är involverade i heterologa sensibilisering av AC. Tidigare studier har blandat in kinas och Gbγ signalering som överlappande komponenter som reglerar heterologa sensibilisering av AC. För att identifiera unika och ytterligare överlappande mål i samband med allergi av AC, krävs för ökad genomströmning utveckling och validering av en skalbar cAMP sensibilisering analys. Tidigare metoder för att studera sensibilisering generellt besvärliga involverar kontinuerlig cellodling underhåll samt en komplicerad metod för att mäta cAMP ackumulation som involverar flera tvättsteg. Därmed skulle utvecklingen av en robust cellbaserad analys som kan användas för high throughput screening (HTS) i en 384 bra format lätta framtida studier. Med hjälp av två D 2 dopaminreceptorcellmodeller (dvs.. CHO-D 2L och HEK-AC6 / D 2L), har vi konverterade våra 48-väl sensibilisering analysen (> 20 steg 4-5 dagar) till en fem-step, enda dag analys i 384-brunnsformat. Det nya formatet är mottaglig för små molekyler screening, och vi visar att denna analys design också lätt kan användas för omvänd transfektion av siRNA i väntan på riktade siRNA biblioteksscreening.
Introduction
En adaptiv adenylylcyklas (AC) signalering svar kallas heterologa-eller super-sensibilisering upptäcktes först i laboratorium av nobelpristagaren Dr Marshall Nirenberg. Dr Nirenberg föreslog att den observerade ökningen AC lyhördhet efter kronisk δ opioid receptoraktivering var en mekanism involverad i opiat tolerans och beroende 1. Förutom kronisk δ opioid receptoraktivering sker detta neuroadaptive svar av AC-signalering även efter ihållande aktivering av flera andra Gαi / o-kopplade receptorer 2. Noterbart är att många av dessa receptorer är förknippad med smärta, neuro-psykiatriska och neurologiska störningar och innefattar μ / κ opioid, D 2/4 dopamin, 5HT-1A, och M 2/4 muskarinreceptorer 2. Förutom Dr Nirenberg rön, existerar en stor mängd bevis länka sensibilisering av AC-signalering till kronisk opioid receptoraktivering både
Dessa studier ger den logiska grunden för att undersöka mekanismerna för sensibilisering av adenylylcyklas som en viktig neurobiologisk mål. Likaså bör den fysiologiska betydelsen av AC signalering 8 och den vikt som de enskilda AC isoformer håller i detta adaptiv respons också erkännas 2,9,10. Inom ramen för vår forskning, de generella funktioner i samband med heterologa sensibilisering av de rekombinanta isoformer av AC parallellt dessa egenskaper desfaktorer beskrivs för att studera de endogena isoformer av AC. Specifikt har tidigare forskning funnit att aktiveringen av Gαi / o proteiner och efterföljande release / polyadditionsprodukter βγ subenheter är viktiga krav för receptor inducerad sensibilisering av alla AC-isoformer. Dessutom har flera studier tyder på att signalering från proteinkinaser och Gβγ subenheter är involverade i sensibilisering 2,11-13. Individuella AOC visar också unika och distinkta sensibilisering mönster 12. Till exempel är ihärdig exponering av D2-receptorer till agonister associerad med sensibilisering av AC1 och AC8 till Ca 2 + / kalmodulin stimulering 14,15, medan den närbesläktade AC3 inte sensibiliseras två. AC2, AC4, och AC7 är nära besläktade, dock endast PKC-stimulerad AC2 aktivitet robust sensibiliserade efter långvarig exponering av D2-receptorer att agonister 7,14,16,17. Dessutom AC5 och AC6 visar en markant grad av Fastigheterologous sensibilisering för gas och forskolin-stimulerad cAMP-ackumulering efter aktivering av D-2-receptorer 14,18-20, men tycks skilja sig åt i deras krav för Gβγ subenhet-AC interaktioner 21. Även om de flesta studier av AC sensibilisering har använt modellen cellinjer (t.ex. HEK293 celler som uttrycker individuella AC isoformer), verkar det som om dessa resultat innebär att infödda neuronala cellmodeller 4,22. På senare tid, kan effekterna av AC isoform selektiva småmolekylinhibitorer identifierats i HEK293 celler som uttrycker AC isoformer också översättas till in vivo beteendestudier 23.
Avsaknaden av ett identifierat molekylära mekanismen för heterologt sensibilisering sannolikt speglar komplexiteten i den adaptiva svar samt de unika reglerande egenskaperna hos enskilda AC isoformer 12. Reda sådan komplexitet kompliceras ytterligare av att använda besvärliga metod thatt har begränsade akademiska forskare från att använda objektiva metoder. Till exempel våra tidigare mekanistiska studier involverade användning av kontinuerligt odlade cell-modeller med hjälp av 24 - och 48-och vävnadsodling format 15. Odlade celler typiskt odlas under 48 timmar och utsattes sedan för agonist läkemedelsbehandling (2-18 h) följt av en serie av cell tvättar och inkubationer (figur 1). AC-isoformen specifik cAMP-ackumulering protokoll användes sedan följt av mätning av cAMP-ackumulation med användning av en mödosam och tidskrävande [3H] cAMP-bindande metod 15,24. Längden från början till slut för varje analys som krävs i allmänhet sammanlagt fyra till fem dagar från cell bordläggningen till dataanalys (Figur 1). Tillämpningen av ny teknik och automatisering har lett till markanta förbättringar för sensibiliseringsstudier inom industri-och HTS center inställning. Till exempel, en grupp som arbetar med National Center for Chemical Genomics anmälde en två dagars HTS analysförfarande för att identifiera småmolekylära hämmare av μ opioid receptor inducerad sensibilisering i 1536 brunnar 25.
Denna artikel beskriver vårt arbete med att utveckla en HTS-analys för studier av heterolog sensibilisering som använder tekniker som finns tillgängliga på de flesta akademiska forskningsinstitutioner. Strategin genomfördes genom att införliva användningen av frysförvarade celler från cellmodeller heterologt uttrycker D2 dopaminreceptorn i kombination med endogena eller enskilda rekombinanta adenylylcyklas isoformer (CHO-D 2L eller HEK-AC6 / D 2 L). För att förbättra vår kapacitet, omgjorda vi vår 48 väl sensibilisering analys (ca> 20 steg mer än 4-5 dagar) till ett fem steg, dag-analysen i 384 brunnar som var i huvudsak "blanda och läsa". Det nya formatet använder en kommersiellt tillgänglig homogen tidsupplöst fluorescens (HTRF) analys för att mäta cAMP accumulation i intakta celler med en multi mode plattläsare. Analysen är robust och kan bli föremål för liten molekyl screening, och kan effektivt tillämpas för att screena för hämmare av heterolog sensibilisering. Dessutom ger vi information som tillåter användandet av denna analys med omvänd transfektion av siRNA för riktade eller genomet bred siRNA biblioteksscreening med endast en mindre ändring av den allmänna riktlinjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Expansion och Frysförvaring av analys Ready Cells
- Kultur CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L)-celler på en 15 cm 2 cellodlingsskål i Hams F12-medium kompletterat med 1,0 | iM L-glutamin, 800 mikrogram / l G418, 300 | ag / | il hygromycin, 100 u / ^ l penicillin, 100 mikrogram / l streptomycin och 10% fetalt bovint serum (FBS).
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2 tills cellerna är 90-95% konfluenta. Tvätta cellerna med 10 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och skörda cellerna genom tillsats av 3 | il av cell dissociation buffert under 5 min vid 37 ° C. Omsuspendera cellerna med användning av 12 | il av odlingsmediet och räkna cellerna med hjälp av trypanblått-uteslutning.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g under 5 min vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 5 | il av frysmediet (10% dimetylsulfoxid, 90% FBS). Späd cellsuspensionen att uppnå den önskade cellkoncentrationen (t ex 1 till 20 x 10 6 celler / pl).
- Alikvotera 1,0 l av cell-lösning till varje cryovial. Inkubera kryokärl i en cell frysning behållare vid -80 ° C över natten. Överför kryokärl till en flytande N2 tank för långtidsförvaring.
2. Plating Analys Ready Cells (och Omvänd transfektion Option)
- Snabbt tina en frusen cryovial av celler i ett 37 ° C vattenbad. När väl cellerna tinats överföra cellerna till en 15 | il koniskt rör innehållande 9 | il Opti-MEM, och blanda genom att vända röret 3-5x.
- Centrifugera cellerna vid 500 xg under 5 min vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i 1 il Opti-MEM.
- Räkna celler med hjälp trypanblåttuteslutning att bestämma cellviabiliteten och späda ut de livskraftiga celler som behövs (t. ex. 3 x 10 5 celler / l koncentration) iOpti-MEM. Plate 10 pl / brunn av celler i en vävnadsodlingsbehandlade 384-brunnsplatta med hjälp av en flerkanalspipett.
- Gör seriespädningar av cAMP i Opti-MEM för att generera en standardkurva för uppskattning av cAMP produktion av cellerna (enligt tillverkarens rekommendationer - se avsnitt 7). Lägg till 10 l / brunn av lägret standarder till plattan Anm. En standardkurva kan förberedas på en separat skylt eller tomma brunnar på en av testplattor.
- Centrifugera plattan vid 100 x g under 15 sek vid rumstemperatur, och inkubera vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2 under 1 timme.
3. Omvänd siRNA Transfektion Option *
Detta avsnitt är valfritt och är relevant till figur 3.
- Bered en lösning av siRNA i RNas-fri DDH 2 O (t.ex. 0,4 pmol / | il). Lägg 5 pl till enskilda brunnar i 384-brunnsplatta, och centrifugera plattan vid 100 x g under 15 se-c vid rumstemperatur.
- Späd Lipofectamine 2000 i Opti-MEM med en faktor på 0,006 (t.ex. lägga till 6 | il av Lipofectamine 2000 till 1000 | il Opti-MEM), och blanda genom att pipettera upp och ned.
- Inkubera Lipofectamine 2000/Opti-MEM lösning under 5 min vid rumstemperatur. Lägg 5 pl av det utspädda Lipofectamine 2000/Opti-MEM lösning till enskilda brunnar i 384-brunnsplatta som redan innehåller siRNA. Centrifugera plattan vid 100 x g under 15 sek vid rumstemperatur.
- Inkubera plattan i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Plate analys färdiga celler som beskrivits ovan (avsnitt 2). Centrifugera plattan vid 100 x g under 15 sek vid rumstemperatur.
- Återgå analysplatta till fuktad inkubator vid 37 ° C (5% CO2) under 48-96 h som bestämts för målsökta genen slå ner (se diskussion).
4. Small Molecule Screening
- Späd läkemedlet av intresse (t ex. Småmolekylära hämmare) i Opti-MEM till 6x önskade slutkoncentrationer. Serieutspädningar kan fyllas med handhållna pipetter eller en station vätskehantering.
- Tillsätt 2,5 | il / brunn av testföreningen eller buffert innehållande vehikel (t.ex. DMSO) till sidan av brunnarna med hjälp av en flerkanalspipett.
- Centrifugera plattan vid 100 x g under 15 sek vid rumstemperatur (inkubering är valfritt).
5. Ihållande Agonist Behandling
- Bered en 600 nM (dvs.. Sex gånger den önskade slutliga koncentrationen av 100 nM) lösning av kinpirol i Opti-MEM.
- Tillsätt 2,5 | il / brunn av 600 nM kinpirol lösning till sidan av brunnarna med hjälp av en flerkanalspipett.
- Centrifugera plattan vid 100 x g under 15 sek vid rumstemperatur, och inkubera vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2 under 2 timmar.
6. Stimulering av cAMP-ackumulering
- Under två timmars inkubering, förbereda stimulatipå lösning i Opti-MEM. Stimuleringen lösning består av 40 | iM forskolin, 2 uM 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX) och 4 ^ iM spiperon (alla koncentrationer i steg 6 är 4x den önskade slutkoncentrationen).
- Tillsätt 5 | il / brunn av stimuleringslösning till sidan av brunnarna med hjälp av en flerkanalspipett.
- Centrifugera plattan vid 100 x g under 15 sek vid rumstemperatur, och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme.
7. Släckning och Uppskattning av cAMP Ansamling
- Produktion av cAMP i cellerna mäts med hjälp av cAMP dynamisk 2 kit enligt tillverkarens instruktioner. I korthet rekonstruera anti-cAMP-kryptat och cAMP-d2 i destillerat vatten. Freeze alikvoter vid -20 ° C under kort tids förvaring.
- Späd en alikvot av anti-cAMP-kryptat och en alikvot av cAMP-D2 separat i lyseringsbuffert enligt tillverkarens anvisningar för att göra fungerande lösningar.
- ETTdd 10 | il / brunn av anti-cAMP-kryptat arbetslösning och 10 | il / brunn av den cAMP-d2 arbetslösning till 384-brunnsplatta med hjälp av en flerkanalspipett.
- Centrifugera plattan vid 100 x g under 15 sek vid rumstemperatur, och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme.
- Läs plattan i en fluorescensplattläsare (automatisk skalinställningen för känslighet) med användning av en excitering av 337 nm och mäta utsläppen vid 620 nm och 665 nm per tillverkarens instruktioner.
- Applicera ratiometrisk analys för att bedöma cAMP standardkurva per tillverkar instruktioner. Med hjälp av de erhållna värdena, extrapolera den uppskattade cAMP ackumulering i testbrunnarna med hjälp av dataanalys programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Del I. Att utveckla en 384 väl heterolog sensibilisering analys för att identifiera småmolekylinhibitorer med ett kommersiellt tillgängligt cellmodell.
Att studera heterologa sensibilisering i en cellmodell, gjorde vi ett antal förbättringar som möjligt för oss att effektivisera analysen i en "blanda och läsa"-format. Flera av de viktiga ändringar är markerade nedan och beskrivs mer i detalj i diskussionen. Den första viktigt steg var att modifiera vår cellodling från kontinuerligt odlade celler till kryokonserverade celler 26. Vi nu rutinmässigt odlings satser av celler som kan förvaras i fryst tillstånd vid koncentrationer mellan 1 till 20 x 10 6 celler / | il. För varje respektive assay är cell-lagren tinades, späddes, räknades och pläterades sedan direkt i 384-brunnsplattor. Att eliminera behovet av en odlingsperiod och för att öka bekvämligheten med analysen. Utformningen av vår tidigare sensibilisering assay utnyttjas 48-brunnars Tissue odlingsplattor, och omfattade ett antal tvätt, dekantera, överföringssteg, och en filtreringsbaserad [3H] cAMP-bindningsanalysen (figur 1). Således detta format för sensibilisering var inte mottagliga för hög genomströmning applikationer. Därför utövade vi betydande ansträngningar för att effektivisera analysen först till en 96 brunnar och sedan en 384-brunnar kan ändras till hög throughput screening. Optimeringen inblandade eliminering av tvättsteg och utvärdering av olika typer av kultur / analysplattor, varierande celltäthet, och olika inkubationsperioder. Vi undersökte också flera metoder för cAMP upptäckt och funnit att den väl karakteriseras HTRF cAMP teknik som används i det nuvarande protokollet var mycket reproducerbar, pålitlig och extremt stabil. Denna analys plattform är baserad på immunocompetition mellan cAMP som produceras av cellerna och märktes cAMP (dvs.. CAMP-d2) som tillhandahålls av satsen. Vi har nu framgångsrikt utvecklat och tillämpat protokoll för heterologt sensitsering i 384 brunnar som är i huvudsak "blanda och läsa" (högra panelen Figur 1).
Vårt första mål var att skapa en hög genomströmning D 2L-receptor allergi analys med hjälp av kommersiellt tillgängliga CHO-D 2L-celler (human DRD 2L, antal anslutnings: NM_000795) som endogent uttrycker AC6 och AC7 27. Kryokonserverade CHO-D 2L celler ströks ut med 3000 celler / brunn i en 384-brunnars vävnadsodlingsplatta, och jämviktades i 1 timme vid 37 ° C i en fuktad inkubator. Plattorna avlägsnades från inkubatorn och ökande koncentrationer av D-2-agonisten kinpirol tillsattes vid rumstemperatur. Cellerna inkuberades därefter under 2 h vid 37 ° C i en fuktad inkubator. Cykliskt AMP ackumulation initierades sedan genom tillsats av 10 | iM forskolin (en direkt aktivator av AC). Den cAMP ackumulation bufferten innehöll en fosfodiesterashämmare, isobutylmetylxantin (IBMX), Såväl som D-2-antagonist, spiperon (1 | iM, Ki för D, 2L = 0,07 nM), för att hindra kvarvarande D-2-receptoraktivering under cAMP-ackumulering perioden. Cellerna inkuberades vid rumstemperatur under 1 timme. Analysen avslutades genom tillsats av en lysbuffert innehållande HTRF cAMP-reagens. Studierna visade att ett 2 h förbehandling med kinpirol förbättrad efterföljande forskolinstimulerad cAMP-ackumulering i ett dosberoende sätt som överensstämmer med heterologt allergi (Figur 2A). Resultaten av detta experiment visar att sensibilisering Analyserna kan utföras i en 384-brunnsformat. Den nya analysformatet minskade antalet steg från drygt 20 till 4 steg utan behov av tvätt-eller dekantera steg gör det till en "blanda och läsa"-analys (Figur 1).
Den andra serie experiment undersökte huruvida denna nya rationaliserade analys skulle kunna användas till enT esta hämmare av allergi i CHO-D 2L-modellen. Kryokonserverade CHO-D-2-L-celler ströks ut i en 384 brunnars vävnadsodlingsplatta vid en densitet av 3000 celler / brunn i Opti-MEM. Kända D 2-antagonister har lagts för att blockera D2-receptor-inducerad sensibilisering. Opti-MEM innehållande 100 nM kinpirol (slutlig koncentration) tillsattes därefter till en total volym av 15 | il, och cellerna inkuberades under 2 h vid 37 ° C i en fuktad inkubator. Efter inkubationen var cAMP-ackumulation initierades genom direkt tillsats av forskolin (10 | iM slutlig koncentration), och analysen avbröts och cAMP mättes med användning HTRF. De första resultaten visade att förbehandling med spiperon eller haloperidol (prototypiska D 2-antagonister) fullständigt förhindrade kinpirol inducerad sensibilisering av forskolinstimulerad cAMP-ackumulering (fig 2B). Dessa resultat ger validering som kan utnyttjas för detta tillvägagångssätt för att identifiera småmolekyl hämmare av D2-receptor-inducerad sensibilisering. I ett andra experiment har vi använt denna metod för att utvärdera potensen hos en serie av D-2-antagonister för att testa huruvida dessa föreningar inhiberar sensibilisering. I likhet med tidigare resultat, visade dessa studier att D2-antagonister hämmade agonist inducerad sensibilisering på ett dosberoende sätt (figur 2C). Rangordningen för potensen för inhibering av sensibilisering var i överensstämmelse med deras handlingar såsom D-2-receptorantagonister och deras tidigare beskrivna pharmacology på D-2-receptorer 28.
Del II. Tillämpning av 384 brunnar allergi test för omvänd transfektion av siRNA i screening strävanden.
Vårt nästa mål var att utveckla en 384-väl allergi test som kan användas för att genomföra skalbar omvänd transfektion siRNA biblioteksscreening. Preliminära studier varutförs med hjälp av en HEK cellmodell som heterologt uttrycker både D 2L dopaminreceptorer (råtta DRD 2L, antal anslutnings: NM_012547) och AC6 (råtta ADCY6, tillträdesnummer: NC_005120) (dvs. HEK-AC6 / D-2L-celler). De första experimenten bedöms förmågan att visa agonistinducerad sensibilisering av AC i cellinjen. I korthet, kryokonserverade AC6 / D-2L celler ut (1000 celler / brunn) i en 384-brunnars vävnadsodlingsplatta. Opti-MEM innehållande 1 uM kinpirol (slutlig koncentration) tillsattes till en total volym av 15 | il, och cellerna inkuberades under 2 h vid 37 ° C i en fuktad inkubator. Efter inkubationen var cAMP-ackumulation initierades genom tillsats av ökande koncentrationer av forskolin. Analysen avslutades genom tillsats av lysbuffert innehållande HTRF reagens. Resultaten visade att exponering av celler för agonisten kinpirol under 2 timmar ledde till en markant förbättring av forskolin-stimulerade CAMP ackumulation (Figur 3A). Den ökade ackumuleringen av cAMP på både 100 nM och 300 nM av forskolin var större än 15-faldig jämfört med vehikel-behandlade celler (figur 3A).
Därefter använde vi publicerat siRNA metodiker 29,30 för att vägleda våra optimering ansträngningar som inkluderade en bedömning av olika omvända transfektion förhållanden (t.ex. transfektion reagens, transfektion effektivitet, celltäthet, inkubationstid, osv.). Preliminära studier använt siGloRed, en indikator på transfektion, i kombination med Lipofectamine 2000 för att bestämma optimala back transfektion förhållanden. Experimenten visade att 2-4 pmol siRNA / 5 l H2O kombinerat med 0,03 l Lipofectamine 2000/5 | il Opti-MEM gav en nästan 95% transfektion effektivitet på 72 timmar utan någon observerbar toxicitet i HEK-celler (data visas ej). Vi undersökte därefter effekten av Gαs siRNA på heterologa sensibiliseringav forskolinstimulerad cAMP-ackumulering i AC6 / D-2L celler. Den gas siRNA föreslogs som en potentiell positiv kontroll eftersom Gαs har identifierats som en nyckelkomponent i heterologt sensibilisering för flera AC-isoformer (dvs. AC1, AC2, AC5, och AC6) 19-21. Dessutom 15 gånger sensibilisering signal i vår AC6 / D 2L cellmodell (Figur 3A) ger en tydlig signal till brus fönster för att bedöma effektiviteten i omvänd transfektion. Med hjälp av de villkor som beskrivs ovan, avslutade vi förstudier som bedömer Gαs siRNA som en positiv kontroll, och våra resultat visade en robust blockad (> 90%) av allergi (data visas ej).
Den dramatiska siRNA-inducerad minskning av allergi signalen ger en lämplig positiv kontroll för siRNA screening process. För att få en mer kvantitativ bedömning för siRNA screening av AC heterologt sensibilisering, vi genererade uppgifter dära Z "faktor beräknades för en serie testförhållanden med hjälp av AC6 / D 2L celler 31. För detta experiment kombinerades vi 2 pmol Gαs siRNA, eller den icke måls siRNA kontroll, i 5 ^ il med 0,03 | il Lipofectamine 2000/5 | il Opti-MEM per brunn i en 384-brunnsplatta (total volym 10 pl). Kryokonserverade celler tinades, återsuspenderades i Opti-MEM och sattes sedan till individuella brunnar innehållande siRNA / Lipofectamine blandningen med användning av flera celldensiteter (dvs.. 500-5,000 celler/10 pl / brunn). Varaktigheten av kinpirol behandling (2 h vs 18 timmar) samt den slutliga koncentrationen av forskolin (100-300 nM) var också utforskas i vår AC6 / D-2L sensibilisering assay. Resultaten av dessa experiment visade att en robust Z 'faktor erhölls under följande betingelser: 750 celler / brunn, 72 h transfektion varaktighet, 2 hr kinpirol behandling, och 300 nM forskolin att stimulera cAMP-ackumulering (fig 3B). Under dessa conditions erhöll vi en 15-faldig sensibiliseringssvar som minskades med 94% i närvaro av Gαs siRNA (Z 'av 0,6 för Gαs siRNA vs. styra siRNA).
Figur 1. I den traditionella format, celler pläterades i en 48-brunnsformat och odlades till konfluens under 48 timmar. Tillväxtmediet dekanteras, småmolekylinhibitorer sattes, följt av tillsats av D-2-agonist. Efter två timmars inkubering, är analysmedia dekanterades och cellerna utsattes för en serie av tvätt / dekantera steg. Härnäst AC stimuleras, och cellerna lyseras. Cykliskt AMP-ackumulering bestämdes sedan med användning av [3H] cAMP-bindningsanalys, som är en två dagars analys kräver ett filtreringssteg och scintillationsräkning. Medan 96 brunnsformat elimineringated många av tvätt-och dekantera steg, fann vi att det här formatet inte var direkt mottaglig för HTS eller automation. Den HTS formatet använder frysförvarade celler som är pläterade direkt i 384-hålsplattor. Dessa frysförvarade celler är "analys klar" efter en 1 timme jämvikt. Efter denna initiala inkuberingsperioden kan små molekylhämmare tillsättas följt av tillsats av D-2-agonist för en 2 h inkubation. AC stimuleras, och cellerna lyserades med användning av de HTRF detektionsreagens i analysplattan.
Figur 2. Kryokonserverade CHO-D 2L celler ströks direkt i 384 väl analysplattor vid 3000 celler / brunn och jämviktades under 1 timme. A.) Ökande koncentrationer av D-2-agonist, quinpirole, tillsattes och cellerna inkuberades under 2 h vid 37 ° C i en fuktad inkubator. Cykliskt AMP ackumulering stimulerades med 10 | iM forskolin (slutkoncentration) i närvaro av spiperon och IBMX i 1 h vid rumstemperatur. Reaktionen stoppades genom att använda HTRF cAMP-analysreagens (n = 1, som är representativa för åtminstone tre experiment). Uppgifter är uttryckta som procent svar av fordonsbehandlade celler. B.) CHO-D 2L celler förbehandlades i frånvaro (kontroll) eller förekomst av de angivna D 2-receptorantagonister (dvs. spiperon eller haloperidol). Kinpirol (100 nM) tillsattes, och cellerna inkuberades under 2 h för att inducera sensibilisering. AC stimulerades med 10 | iM forskolin (slutlig koncentration) under 1 timme vid rumstemperatur. Cykliskt AMP bestämdes med hjälp HTRF. Data uttrycks som procent svar av fordons-behandlade celler. C.) CHO-D 2L celler förbehandlats i frånvaro (kontroll =100%) eller i närvaro av ökande koncentration av angivna D-2-receptorantagonister. Kinpirol (100 nM) tillsattes, och cellerna inkuberades under 2 h för att inducera sensibilisering. AC stimulerades med 10 | iM forskolin (slutlig koncentration) under 1 timme vid rumstemperatur. Cykliskt AMP bestämdes med hjälp HTRF. Data uttrycks som procent av den kinpirol-inducerad allergi svar. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Kryokonserverade HEK-AC6 / D-2L-celler ströks ut med 1000 celler / brunn och jämviktades under 1 timme. A.) Celler inkuberades med vehikel eller 100 nM kinpirol under 2 timmar i en fuktad inkubator. AC wamellan stimulerade med ökande koncentrationer av forskolin under 1 timme vid rumstemperatur. Cykliskt AMP bestämdes med hjälp HTRF. B.) Omvänd transfektion av Gαs siRNA block sensibilisering i AC6 / D 2L celler. Gαs siRNA eller nontargeting siRNA kontroll (2 pmol) kombinerades med 0,03 ^ il Lipofectamine2000 (Lipo) i en total volym av 10 ul, och lösningen tillsattes till individuella brunnar i en 384-brunnsplatta. Kryokonserverade AC6 / D 2L celler tillsattes sedan för den omvända transfektion och inkuberas under 70 h vid 37 ° C i en fuktad inkubator. D 2-receptoragonist, kinpirol (1 pM slutlig) eller vehikel tillsattes följt av en 2 h inkubation. Cykliskt AMP ackumulation stimulerades med 300 nM forskolin (slutlig koncentration) under 1 timme och mäts med hjälp HTRF. Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I ett försök att underlätta studier av heterolog sensibilisering, har vi omfattande modifierat vår tidigare metod som ger en strömlinjeformad "mix och läsa" format som kan ändras för high-throughput screening och verkningsmekanism undersökning. De stora modifieringar våra protokoll kan sammanfattas enligt följande: 1) användning av frysförvarade celler som "analys-klar" reagenser, 2) att miniatyrisering av analysen i 384 brunnar, och 3) utnyttjandet av HTRF mätning av cAMP.
Antagandet av frysförvaring för våra cell baserade analyser har kraftigt förbättrad effektivitet och reproducerbarhet för våra dagliga experiment och screening strävanden. Detta tillvägagångssätt är en industristandard, och kan lätt översättas till den akademiska forskningen inställning 26. För att förbättra cellodling effektivitet, flaskor av celler som används som "från hyllan reagens" i den cellen lagren tinas, utspädning och sedan pläterade direkt i 384-brunnars plattor for varje analys. Vi har tidigare bildat frysförvarade celler i studier som syftar till att identifiera antagonister till ryggradslösa G-proteinkopplade receptorer 32,33. Denna metod var fördelaktigt att det inledande arbetet inte utfördes i vårt laboratorium och nödvändig transportera odlade celler över campus som presenterade utmaningar och sannolikt infördes variabilitet. Med hjälp av vår nya strategi, frysta celler kan nu omedelbart tinas och späds på plats före initieringen av analysen. Förutom att förbättra reproducerbarhet, frysförvaring elimineras också den 48 h period från cell bordläggningen till genomförande-analys (Figur 1). Vi har med framgång tillämpat frysförvaring strategi i stabila och övergående transfektion studier med hjälp av olika rekombinanta receptorer och subtyper av ACS med funktionella avläsning inklusive cAMP ackumulering och β-arrestin rekrytering (Brust, TF, Ejendal, KFK, och Watts, VJ opublicerade observationer) . DesPite våra positiva erfarenheter hittills, bör forskarna kontrollera att deras receptor eller mål, och modell cellsystem är kompatibelt med frysförvaring innan inleda storskaliga studier.
En andra modifikation som var viktigt för vårt arbete med att effektivisera allergi analysen inblandade eliminering av dekantera och tvätta steg (Figur 1). Dessa förändringar var samtidig med vår miniatyrisering av analysen till en 96-brunnsformat (Conley och Watts, opublicerade observationer). Specifikt var en modifierad sensibilisering protokoll för där cAMP ackumulation initierades genom direkt tillsats av forskolin i analysbuffert efter D2-agonist inkubation i avsaknad av tvätt-eller dekantera steg (se mittpanelen Figur 1). Dessutom har den cAMP-ackumulering bufferten innehöll en relativt hög koncentration av spiperon (1 pM), en D-2-antagonist som har ett Ki-värde av 0,07 nM för D 2receptorer 15. Denna 100 faldigt överskottskoncentration av spiperon resultat i fullständig D 2-receptor ockupationen under cAMP ackumulation fasen och därmed utgör hinder kvar D 2-receptoraktivering av agonister (t.ex. kinpirol) under forskolin stimulerade AC steg 15. Denna förändring eliminerat tre dekantera och tre tvättsteg efter den första agonist inkubation. Som en del av utvecklingen 96 brunnar, kunde vi också att eliminera det sista decant steget före härdning och lysering av cellerna. Denna modifiering åstadkoms genom att öka koncentrationen av vår lyseringsreagens (t.ex. triklorättiksyra,. TCA) 3-9% och tillsats av reagens direkt till cAMP-ackumulering buffert. De lovande resultaten från den modifierade 96 väl allergi analys gett stöd till omvandling av sensibilisering analysen till en 384-brunnsformat. Tyvärr, vår tidigare metod för kvantifiering av cAMP var en mödosam filtration-baserade [3H] cAMP proteinbindningsanalys (> 5 steg). Till exempel är analysen i allmänhet klar under loppet av två dagar för att möjliggöra filter torkning och scintillation räkna 15,24. Dessa nackdelar gjorde [3H] cAMP-proteinbindning opraktiskt att använda för en stor genomströmning 384-brunnsformat.
Den tredje viktiga utveckling kom genom inkorporering av metoder för att mäta och kvantifiera cAMP på ett sätt som kan bli föremål för 384 brunnar. Till exempel har vi betydande erfarenhet av att använda en cAMP Response Element (CRE)-luciferas-baserad reporter system för relativa cAMP-mätningar i en 384-brunnsformat 32,33. Även om detta tillvägagångssätt har framgångsrikt använts av vårt laboratorium för många studier av Gαs-kopplade receptorer, CRE-luc journalister är föremål för ett antal falskt positiva och negativa under screeninganalyser 34. Dessutom våra preliminära D 2 sensibiliseringsstudier med denna appmört var inte uppmuntrande eftersom vi observerade skenbar feedback inhibition av luciferas-signal (data ej visade). Därför har vi fokuserat våra ansträngningar på att genomföra GloSensor cAMP-teknik genom att konstruera och karakterisera stabila cellinjer med både deras "första" och "andra" generationen GloSensor vektorer. Den GloSensor är en konstruerad luciferas reporter innehållande ett cAMP-bindningsstället inom luciferasprotein 35. Även om systemet är mycket användbart för kinetisk cAMP kvantifiering, där metoden inte var effektiv för mätning av agonistinducerad sensibilisering (Conley och Watts, opublicerade observationer). Vi undersökte också en BRET baserad cAMP biosensor 36 för våra studier som ett kostnadseffektivt sätt att bedöma cAMP ackumulation. Tyvärr, bakgrundsljud i samband med tillfälligt transfekterade biosensor begränsat vår förmåga att anpassa denna metod för att vår allergi analys. Slutligen, vi utvärderade flera satser anställa homogen tidsupplöst fluorescence (HTRF) som en metod för att mäta cAMP i 384 brunnar. Vi fann att denna etablerade metodiken var mest kompatibelt med akademiska laboratorier och screeninganläggningar i att de var robust, känslig, stabil och lätt att använda. Den främsta nackdelen för akademiska forskare är kostnaden för reagens, men inköp av reagenser och miniatyrisering till 384 och formatet gör priset mer än konkurrenskraftig med andra kit, inklusive ELISA baserade analyser och vår tidigare "hemlagade" [3 H] cAMP protein bindningsanalys 15.
Det representativa arbete visar tillämpligheten av den 384-brunnars sensibilisering analys för att studier av D-2-dopaminreceptorn inducerad sensibilisering av AC-signalering i rekombinanta cellinjer. I flera preliminära studier har vi använt denna analys med mindre modifieringar för att bedöma D2 dopamin-receptorn och μ opioid receptor inducerad sensibilisering av flera AC-isoformer (Tabell 1). Dessa undersökningar visar den allmänna tillämpbarheten av 384-brunnsanalys till flera cellinjer, receptorsubtyper och AC isoformer. De som är intresserade av att utveckla liknande analysformat skulle uppmuntras att undersöka variabler såsom celltäthet, agonist förbehandlingstider, AC aktiveringsprotokoll / förhållanden, och HTRF cAMP detektionsmetod för deras cellulära modeller. Antagonisten data som presenteras häri visar förmågan hos analysen att identifiera småmolekylära hämmare av sensibilisering. De potensvärden överensstämmer med dem som fastställts med andra funktionella analyser 28 samt affinitet (Ki) värden med radioreceptorbindningsanalyser (se: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php). Den nuvarande analys designen kan lätt rymma HTS insatser där föreningar levereras via en pintool eller är pläterad i analys färdiga plåtar. Utöver de sensibiliserings analyser som beskrivits, bör de metoder som tillämpas här tillämpas på andra annonsaptive analyser där flera droger / reagenser gällde före en slutpunkt åtgärd 384 brunnar.
Vi har försökt att lyfta fram viktiga utvecklingssteg för hela 384-bra analys, men vill också konstatera att utvecklingen av de omvända transfektion siRNA-analyser var särskilt utmanande. Vårt långsiktiga mål för dessa analyser är att genomföra en genomet bred insats för att kartlägga de överlappande och unika gener involverade i heterologa sensibilisering av AC-isoformer. Med vår initiala siRNA-analys som en riktlinje, erbjuder vi följande förkortade förslag för att utveckla en siRNA omvända transfektionsanalyser: (1) undersöka transfektion effektivitet med hjälp av förhållanden mellan en indikator som Siglo och transfektion reagens (. T.ex. Lipofectamine 2000), (2) bestämma den optimala sådd densitet (t.ex. 500-5,000 celler / brunn), (3) utforska transfektion varaktighet (t ex 48 till 96 timmar), och (4) bedöma lämpliga analysförhållanden (t.ex. läkemedels treatments, slutpunkt åtgärder och robusta kontroller) för att uppnå optimal signal (t.ex. Z-faktoranalys). Ytterligare detaljer och mer allmän information om användning av siRNA i screening strävanden kan också hittas i de tidigare refererade metoder artiklar 29,30. De utredare som är intresserade av HTS ansträngningar bör också undersöka anpassningsförmågan hos sina analyser till automatisering (t ex. Pintool och robotteknik). Även andra faktorer eller kontroller för screening strävanden inkluderar formell analysvalidering, cell viabilitet analyser och lämpliga motåtgärder skärmar. För ytterligare vägledning, skulle den intresserade läsaren uppmanas att undersöka NCGC Assay Guidance Manual tillgängliga via NCATS på: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/.
Vi har beskrivit vår strategi för att effektivisera en mödosam flerdagarsanalysen till en effektiv "blandning och läs"-analys som kan utföras på en enda dag. De metoder som beskrivs här och ennyligen genomförd studie av 1.280 föreningar i μopioid receptor inducerad sensibilisering i 1536 brunnar 25 tyder på att sensibilisering nu lätt kan förhöras med hjälp av HTS. Den analys som beskrivs här är mottaglig för små molekyler testning och kan tillämpas på genetiska metoder såsom siRNA. Vår analysformat är inriktad på adaptiv respons kallas heterologa sensibilisering av AC, men kan den allmänna strategi och metoder i stor utsträckning för andra cellbaserade analyser som kräver flera drog-och reagenstillsatser (t.ex. hyposensibilisering och neuroprotektion.). Arbetet redovisas här är lätt åstadkommas inom en akademisk miljö med hjälp av flerkanalspipetter och en multi mode plattläsare att läsa av den önskade slutpunkten i 384 brunnar.
Tabell 1. Cellulära modeller testas för agonistinducerat sensibilisering.
| Receptor | AC Isoform | Cellinje | Sensibilisering signal |
| D 2L dopamin | Endogent (AC6 och AC7 27) | CHO-D 2L | 2-3 faldig |
| D 2L dopamin | Rekombinant AC2, AC5, och AC6 | HEK 293 stabilt transfekterad | AC2 = 2-3 gånger AC5 = 50-faldigt AC6 = 15 gånger |
| μ opioid | Rekombinant AC1, AC2 och AC5 | HEK 293 stabilt transfekterad | AC1 = 6-7 faldig AC2 = 2-3 gånger AC5 = 10 till 15-faldigt |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för Richard Zink och Todd Wiernicki för metodutbildning och analys vägledning. Vi tackar också John Paul Spence för noggrann läsning och redaktionella förslag. Detta arbete stöddes av National Institute of Health MH 060.397, Brain and Behavior Research Foundation, och Eli Lilly and Company genom Lilly Research Award Program (LRAP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384-well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase- and RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Nontargeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J.
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
