Summary
持续激活的抑制性G蛋白偶联受体导致腺苷酸环化酶信令的致敏作用。以确定必需的分子途径，无偏差的方法是必要的，然而，这种策略需要一个可扩展的基于细胞的cAMP敏感测定法的发展。本文中，我们描述了一种致敏试验用于小分子和siRNA的筛选。
Abstract
腺苷酸环化酶（AC）信号的致敏已经牵涉于多种神经精神和神经紊乱包括物质滥用和帕金森氏病。 Gαi/ O连接受体的急性激活抑制AC活性，而这些受体产生交流的异源致敏持续激活与细胞内cAMP水平的提高。以前的研究已经表明，这种增强的AC响应的观察在体外和体内以下几种类型Gαi/ O-连接的受体，包括D 2多巴胺和μ阿片受体的慢性活化。虽然交流的异源致敏首先报道四十年前，背后这一现象的机制（S）仍是未知。机械数据的缺乏可能反映的涉及本适应性反应的复杂性，这表明无偏差的方法可能有助于确定ING参与交流的异源致敏的分子途径。以前的研究已经牵连激酶和Gbγ信号的重叠，调节交流的异源致敏成分。标识与交流的过敏相关的独特的和额外的重叠的目标，一个可扩展的cAMP致敏试验开发和验证，需要更大的吞吐量。以前的方法来研究致敏一般都是笨重涉及连续细胞培养物保养以及一个复杂的方法用于测定cAMP的积累，涉及到多个洗涤步骤。因此，可在384孔的格式可用于高通量筛选（HTS）一个强大的基于细胞的测定的发展将有利于未来的研究。使用两个D 2多巴胺受体的细胞模型（ 即 ，CHO-D 2L和HEK-AC6 / D 2L），我们已经转换了48孔敏法（> 20级4-5天），以五-STEP，在384孔板格式的单天测定。这种新格式是适合于小分子筛选，我们证明，该试验设计也可以容易地使用用于siRNA的反向转染在预期目标的siRNA文库筛选。
Introduction
一种自适应的腺苷酸环化酶（AC）信号的响应被称为异源或超敏的诺贝尔奖获得者，马歇尔·尼伦伯格博士的实验室首次发现。尼伦伯格博士提出，所观察到的交流增加下列反应慢性δ阿片受体的激活是一个从事鸦片耐受性和依赖性1的机制。除了 慢性δ阿片受体激活，交流信号的这种神经适应性反应也发生以下几种其他Gαi/ O偶联受体2的持续激活。值得注意的是，许多这些受体与疼痛，神经精神及神经系统疾病有关，包括μ/κ阿片，D 2/4多巴胺，5HT 1A和M 2/4毒蕈碱受体2。除了尼伦伯格博士的研究结果，大量的证据存在连接交流信号的宣传，以慢性阿片受体激活都
这些研究为研究对腺苷酸环化酶的致敏机制作为一项重要的神经生物学指标的理由。同样，AC的信令8的生理相关性和重要性，个人交流亚型在此适应性反应保持还应认识2,9,10。在我们的研究的情况下，使用交流的重组同种型异源致敏相关联的一般功能平行那些特征德cribed学习交流的内源亚型。具体来说，以前的研究已经发现，Gαi/ O蛋白质和随后发布/重排βγ亚基的激活是所有交流亚型受体引起过敏的重要要求。此外，一些研究表明，由蛋白激酶和Gβγ亚单位的信令中涉及致敏2,11-13。个别的AC也显示独特而鲜明的致敏模式12。举例来说，D 2受体的持续暴露于激动剂与AC1和AC8的致敏关联到的Ca 2 + /钙调蛋白刺激14,15，而与之密切相关的AC3不致敏2。 AC2，AC4和AC7有密切的关系，但是，只有PKC刺激AC2活动是D 2受体的长期接触后强劲致敏激动剂7,14,16,17。此外，AC5和AC6显示海特的显着程度ologous宣传，以天然气和毛喉素刺激的cAMP积累下激活D 2受体14,18-20，但出现在他们的Gβγ亚单位交流的要求，以不同的相互作用21。虽然交流致敏的大多数研究中使用的模型的细胞系（ 例如 HEK293细胞表达个人交流异构体），看来这些结果转化为原生神经元细胞模型4,22。最近，在HEK293细胞中表达的AC亚型鉴定AC亚型选择性的小分子抑制剂的效果，也可以转换为在体内的行为研究23。
的可识别的分子机制的异源致敏的缺乏可能反映了自适应响应的复杂性以及各个AC亚型12的独特的调节特性。揭开这种复杂性是由使用繁琐的方法吨进一步复杂化帽子已经从用人公正的途径有限的学术研究。例如，我们以前的机理研究涉及使用连续培养的细胞模型使用24 -和48 -孔组织培养格式15。培养的细胞通常培养48小时，然后进行激动剂药物治疗（2-18小时），随后通过一系列细胞洗涤和温育（ 图1）。 AC-同工型特异性的cAMP积聚的协议当时采用随后的cAMP积聚的测量使用一个费 时费力的[3 H] cAMP结合的方法15,24。从开始的持续时间来完成每一测定通常总共四到五天需要从细胞接种到数据分析（ 图1）。新技术和自动化的应用导致了显着的增强功能在工业和HTS中心设置致敏研究。例如，一组具有国家中心的化学工作CAL基因组报道进行了两天的HTS检测程序确定的μ阿片受体引起过敏的小分子抑制剂在1,536孔板格式25。
本文章介绍了我们的努力，开发利用技术，可在大多数学术研究机构异源致敏研究高温超导实验。这种策略通过配合使用冻存细胞的细胞模型异源表达的D 2多巴胺受体与内源性或个人重组腺苷酸环化酶亚型（CHO-D 2L或HEK-AC6 / D 2 L）的组合来完成。为了提高我们的产量，我们重新设计了48和致敏试验（ 约 > 20级以上4-5天）到384孔的格式，基本上是“混读”五步，一天检测。新的格式使用市售的同质时间分辨荧光（HTRF）测定来衡量的cAMP ACCumulation在完整细胞与多模式读板器。化验是稳健经得起small分子筛选，并可有效应用于筛选异源致敏抑制剂。此外，我们提供数据，允许使用该测定的siRNA的反向转染靶向或全基因组的siRNA文库筛选，只有轻微的修改，一般的方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。扩展含量就绪细胞和冷冻保存
- 培养的CHO-K1-DRD 2L（CHO-D 2L）在15 cm 2的细胞培养皿中Ham氏F12培养基补充有1.0μML-谷氨酰胺，800微克/微升G418，300微克/微升潮霉素，100 U /微升细胞青霉素，100微克/微升链霉素和10％胎牛血清（FBS）。
- 孵育的细胞在37℃下在湿润的培养箱中5％的CO 2，直至细胞为90-95％汇合。用10微升磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，并通过加入3微升的细胞解离缓冲液5分钟，在37℃下收集细胞用12微升的培养基中重悬细胞，并使用台盼蓝排除法计数细胞。
- 离心细胞悬浮液，在500×g离心5分钟，在室温下进行。吸出上清，重悬细胞沉淀于5μl冷冻介质（10％二甲亚砜，90％FBS）。稀释细胞悬液，以达到所需的细胞浓度（ 例如 1-20×10 6个细胞/微升）。
- 分装1.0微升的细胞溶液到每个离心管。孵育在细胞冷冻集装箱的冷冻管在-80℃下过夜。转移至离心管的液体氮气罐长期贮存。
2。电镀含量就绪细胞（和反向转股权而更改）
- 快速解冻细胞的冷冻离心管在37℃水浴。一旦细胞被解冻，将细胞转移到15微升的锥形管含有9微升的Opti-MEM中，并通过反相管3到5倍混合。
- 离心细胞，在500×g离心5分钟，在室温下进行。吸去上清，重悬的细胞在1微升的Opti-MEM。
- 使用台盼蓝排除法测定细胞活力和稀释活菌根据需要（ 例如 ，3×10 5个细胞/μL的浓度）中计数细胞的Opti-MEM。使用多通道移液管板10微升的细胞在组织培养/孔处理的384孔板中。
- 使cAMP作用中的Opti-MEM连续稀释以产生标准曲线估计的cAMP产生的细胞（根据生产商的建议 - 见第7节）。加入10μl的cAMP标准品/孔到板上注：一个单一的标准曲线可以在一个单独的盘或空白孔中而制备的测定板中的一个。
- 离心板在100×g离心15秒，在室温下和在潮湿的培养箱中，用5％CO 2的1小时温育在37℃。
3。反向siRNA转染选项*
这部分是可选的，相关的图3。
- 准备的siRNA的溶液中无RNA酶的双蒸2 O（ 例如 0.4皮摩尔/微升）。加入5微升至384 - 孔板各孔中，并离心板在100×g离心15本身C在常温。
- 稀释脂质体2000中的Opti-MEM由0.006倍（ 例如加6μL脂质体2000〜1000μL的Opti-MEM），以及由上下吹打混匀。
- 孵育5分钟，在室温下将脂质体2000/Opti-MEM溶液。加入5微升稀释的Lipofectamine 2000/Opti-MEM溶液至384 - 孔板各孔中已包含的siRNA。离心板在100×g离心15秒，室温下进行。
- 孵育板30分钟，在室温下进行。
- 平板测定细胞准备上述（第2部分）所描述的。离心板在100×g离心15秒，室温下进行。
- 返回试验板到潮湿的培养箱中，在37°C（5％CO 2）为48-96小时所确定的靶基因敲下来（见讨论）。
4。小分子筛选
- 淡化感兴趣的药物（ 如 。小分子抑制剂）的Opti中-MEM 6倍的所需最终浓度。连续稀释可以使用手持式移液器或液体处理工作站完成。
- 加试验化合物的2.5100μl/孔或缓冲液含有载体（ 如 DMSO）中，以使用多通道移液管的孔的侧面上。
- 离心板在100×g离心15秒，在室温（潜伏期是可选的）。
5。持久性激动剂治疗
- 准备一个600纳米的的Opti-MEM quinpirole的溶液（浓度100nM 即 6倍所需终浓度）。
- 添加2.5微升/孔的600 nM的quinpirole溶液用多道移液管的孔的侧面上。
- 离心板在100×g离心15秒，在室温下和在潮湿的培养箱中，用5％CO 2下2小时，在37℃下。
6。 cAMP的积累刺激
- 在2小时培养，准备stimulati对的Opti-MEM溶液。刺激溶液是由40μM毛喉素，2μM的3 - 异丁基-1 - methyxanthine黄嘌呤（IBMX）和4μM螺哌隆（在步骤6中所有浓度4倍的所需最终浓度）。
- 加入5微升/孔的刺激溶液用多道移液管的孔的侧面上。
- 离心板在100×g离心15秒，在室温下和在室温下孵育1小时。
7。淬火cAMP的积累和预测
- 产生cAMP的细胞是使用的cAMP动态2试剂盒根据制造商的说明书测定。简言之，将重组抗-cAMP-穴状化合物和cAMP-d2的蒸馏水中。分装冷冻在-20℃下短期存储。
- 根据制造商的说明，以使工作溶液稀释的抗-cAMP-穴状化合物的1等分试样和内cAMP-D2分开一个等份的裂解缓冲液。
- 一西元10微升抗-cAMP-穴状化合物工作溶液和10μl内cAMP-d2的工作溶液到384孔板用多通道移液器/孔/孔。
- 离心板在100×g离心15秒，在室温下和在室温下孵育1小时。
- 读板中使用的337 nm光激发的荧光酶标仪（自动量程设定为灵敏度），并测量排放量为每620 nm和665 nm的制造商的说明。
- 每申请比例分析，评估的cAMP标准曲线生产指令。使用所得到的值，推算估计的cAMP积聚在使用数据分析软件的测试井。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
第一部分开发一个384以及异源致敏试验确定使用市售的细胞模型小分子抑制剂。
为了研究异源致敏的细胞模型，我们做了一些改进，使我们能够简化检测到一个“混合和阅读”格式。一些重要的修改包括以下各项，并且更详细地讨论所述。第一个关键步骤是从连续培养的细胞改变我们的细胞培养冻存细胞26。我们现在经常细胞培养批次可1-20×10 6个/μl之间冻存的浓度。对于每个各自的测定中，细胞种群解冻，稀释，计数，然后直接在384孔板中接种。消除的培养期间的需要并提高了测定的方便性。我们以前的致敏试验的格式采用48孔TISSUE培养板中，以及涉及若干洗涤，倾析，转印步骤，和一个基于过滤的[3 H] cAMP的结合测定法（ 图1）。因此，这种格式的致敏并不适用于高吞吐量的应用。因此，我们产生显著努力，第一简化试验，以96孔，然后在384孔格式适合于高通量筛选。优化涉及消除洗涤步骤和多种类型的培养/测定板的评价，不同的细胞密度，且不同的孵育时间。我们也探讨了几种方法对cAMP的检测和发现，本协议中使用的很好的特点HTRF cAMP的技术是高度可重复的，可靠的，并且非常稳定。该测定平台基于由所述试剂盒提供的细胞产生和标记的cAMP（ 即 。的cAMP-d2）中的cAMP的之间immunocompetition。我们已经成功地开发和应用协议的异源SENSIT化在384孔格式，基本上是“混读”（右图图1）。
我们最初的目标是生成使用市售的CHO-D 2L细胞（人DRD 2L，登录号：NM_000795）一种高通量ð2L受体致敏测定内源性表达AC6和AC7 27。冷冻保存的CHO-D 2L细胞铺板于3000个细胞/孔在384 -孔组织培养板中，并平衡1小时，在37℃下在湿润的培养箱中培养。从培养箱和quinpirole中加入在室温下对D 2受体激动剂的浓度的增加，除去板材。然后将细胞温育2小时，在37℃，在湿润的培养箱中培养。环AMP累积，然后通过加入10μM的毛喉素（交流的直接激活剂）启动。 cAMP的积累缓冲液含有磷酸二酯酶抑制剂，异丁基甲基黄嘌呤（IBMX），以及对D 2受体拮抗剂，螺哌隆（1μM，K i表示D，2L = 0.07纳米），为了在cAMP的积累期，以排除残留的D 2受体活化。将细胞于室温温育1小时。该测定法已被终止通过加入含有HTRF cAMP的试剂裂解缓冲液中。本研究显示，2小时的预处理quinpirole增强随后的forskolin刺激的cAMP的积累以剂量依赖的方式与异源致敏（ 图2A）相一致。本实验的结果表明，增感测定可以在384 - 孔格式进行。新的测定形式从超过20个至4个步骤，减少了工序数，而不需要冲洗或倾析步骤，使其成为一个“混合和读”测定法（ 图1）。
在第二组实验探讨这个新的简化测定法是否可以利用一个致敏在CHO-D 2L模型ssess抑制剂。冷冻保存的CHO-D 2L的细胞以3000个细胞/孔中的Opti-MEM的密度接种于384孔组织培养板。加入已知的D 2受体拮抗剂阻断D2 受体引起的过敏。的Opti-MEM含有100nM的quinpirole（最终浓度），然后加入到15微升的总体积，并将细胞温育2小时，在37℃，在湿润的培养箱中培养。以下的温育后，cAMP的积累是通过直接加入毛喉素（10μM最终浓度）的启动，在测定被终止，并使用HTRF cAMP的测定。初步结果表明，预处理螺哌隆或氟哌啶醇（原型D 2受体拮抗剂）完全阻止quinpirole毛喉素诱导的致敏刺激的cAMP的积累（ 图2B）。这些结果提供了验证，该方法可以被用于识别小D 2受体诱导致敏的分子抑制剂。在第二个实验中，我们使用这种方法来评估的一系列D 2受体拮抗剂的效力，以测试这些化合物是否抑制致敏。类似于前面的结果，这些研究表明，对D 2受体拮抗剂抑制激动剂诱导致敏以剂量依赖的方式（ 图2C）。效力抑制敏化的排列顺序是他们作为D 2受体拮抗剂和它们在D 2受体28前面所述的药理学行动一致。
第二部分。对于siRNA的筛选努力 反向转染的384孔敏检测的应用程序。
我们的下一个目标是开发出可用于进行可扩展的反向转染的siRNA文库筛选384孔敏试验。初步的研究是和AC6（大鼠ADCY6，登录号：NC_005120）（ 即 HEK-AC6 / D 2L细胞）：使用HEK细胞模型中异源性表达二者兼有d 2L多巴胺受体（NM_012547大鼠DRD 2L，保藏号）执行。第一个实验评估证明AC激动剂诱发致敏的细胞系的能力。简言之，将冷冻保存的AC6 / D 2L细胞接种（1,000个细胞/孔）在384 -孔组织培养板中。的Opti-MEM含有1μM的quinpirole（终浓度）加入到15微升的总体积，并将细胞温育2小时，在37℃，在湿润的培养箱中培养。以下的温育后，cAMP的积累，通过加入毛喉素浓度的增加开始。该测定法已被终止通过加入含有HTRF试剂裂解缓冲液。结果表明，细胞暴露于激动剂quinpirole 2小时导致forskolin刺激的凸轮的显着增强磷积累（ 图3A）。 cAMP作用于两个为100nM和300nM的毛喉素的积累增加大于15倍相比于载体处理的细胞（ 图3A）。
接下来，我们使用的siRNA出版方法论29,30来指导我们，包括各种反向转染条件进行评估优化的努力（ 如转染试剂，转染效率，细胞密度，培养时间等 ）。初步研究中所用siGloRed，转染的指标，与阳离子脂质体2000的组合来确定最佳的反向转染条件。该实验表明，2-4皮摩尔的siRNA / 5微升H 2 O的结合0.03微升阳离子脂质体2000/5微升的Opti-MEM中的HEK细胞提供在72小时的近95％的转染效率，没有任何可观察到的毒性（数据未显示）。然后，我们对GαssiRNA对异源致敏作用的477刺激的AC6 / D 2L细胞内cAMP的积累。气体的siRNA提出作为一个潜在的阳性对照，因为Gαs已被确定为异源致敏的一个关键组成部分的几个AC亚型（即 AC1，AC2，AC5，AC6和）19-21。此外，在我们的AC6 / D 2L细胞模型（ 图3A）的15倍致敏信号提供了一个强大的信号噪声窗口，以评估反向转染的效率。使用上述的条件下，我们完成了初步的研究评估Gαs的siRNA作为阳性对照，与我们的研究结果表明敏（数据未显示）的一个强大的封锁（> 90％）。
戏剧性的siRNA诱导的减少致敏信号提供一个适当的阳性对照为siRNA的筛选过程。为了获得更多的量化评估，交流异源致敏的siRNA筛选，我们在其中生成的数据的Z'因子，计算为一系列使用AC6 / D 2L电池31的测试条件。在这个实验中，我们结合2皮摩尔Gαs的siRNA，或者非靶向siRNA对照，在5微升含0.03微升阳离子脂质体2000/5微升的Opti-MEM中，每孔在384孔板中（总体积为10微升）。冷冻保存的细胞解冻，再悬浮于的Opti-MEM中，然后加入到含有的siRNA /脂质体混合物用几个细胞密度各孔（ 即 。500-5000 cells/10微升/孔）。 quinpirole治疗（2小时而不是18小时）以及毛喉素的终浓度（100-300纳米）的持续时间还探讨了在我们的AC6 / D 2L致敏试验。这些实验的结果表明，一个强大的Z'因子是在下列条件下获得：750个细胞/孔，72小时转染持续时间，2小时quinpirole治疗和300 nM的毛喉素刺激的cAMP的积累（ 图3B）。在这些合作制条件，我们获得了15倍的致敏反应，是在Gαs的siRNA的存在降低了94％（0.6 Z'为Gαs的siRNA 比 。对照siRNA）。
图1，在传统的格式，将细胞接种于48孔格式和生长至汇合超过48小时后，将生长培养基中倾析，加入小分子抑制剂，接着加入在D 2激动剂。在2小时培养后，测定培养基倾析和细胞进行了一系列的洗涤/倾析步骤。接着，AC是刺激和裂解细胞。环AMP累积然后被评估使用[3 H] cAMP结合测定法，其是一个需要过滤步骤和闪烁计数2天测定。而96孔格式eliminATED许多清洗和澄清步骤，我们发现，这种格式是不容易服从HTS或自动化。对HTS格式使用了直接接种于384孔板中冻存细胞。这些冻存细胞是“吸附试验准备”下一个1小时的平衡。经过这一初步的潜伏期，小分子抑制剂可以添加，随后添加的D 2受体激动剂的2小时培养。 AC被刺激，并且所述细胞是使用HTRF检测试剂在测定板裂解。
图2。冻存的CHO-D 2L细胞直接接种到384孔测定板在3000个细胞/孔和平衡1小时。A.）对D 2受体激动剂，quinpir浓度增加OLE中，加入与细胞温育2小时，在37℃，在湿润的培养箱中培养。环AMP累积于螺哌隆和IBMX的存在下进行1小时，在室温下刺激用10μM毛喉素（终浓度）。使用HTRF cAMP测定试剂（n = 1时，代表性的至少3个实验）淬灭反应。数据表示为媒介物处理的细胞的百分比响应。B.）的CHO-D 2L细胞预处理在不存在（对照）或所指示的D 2受体拮抗剂（ 如螺哌隆或氟哌啶醇）的存在。 Quinpirole（100纳米）中的溶液，并将细胞温育2小时以诱导过敏。交流电进行刺激用10μM毛喉素（终浓度）为1小时，在室温下进行。环磷酸腺苷是使用HTRF确定。数据表示为媒介物处理的细胞。C.）的CHO-D 2L细胞预处理在不存在（对照的百分比响应=100％），或表示D 2受体拮抗剂的浓度增加的存在。 Quinpirole（100纳米）中的溶液，并将细胞温育2小时以诱导过敏。交流电进行刺激用10μM毛喉素（终浓度）为1小时，在室温下进行。环磷酸腺苷是使用HTRF确定。数据表示为quinpirole引起致敏反应的百分比。 点击这里查看大图。
图3。冻存的HEK-AC6 / D 2L细胞铺板在1000个细胞/孔和平衡1小时。 A.）细胞培养用载体或100nM的quinpirole 2小时，在湿润的培养箱中培养。交流娃受激随着毛喉素浓度为1小时，在室温下进行。环磷酸腺苷是使用HTRF。B.）反向的AC6 / D 2L细胞Gαs块的siRNA转染致敏确定。 Gαs的siRNA或nontargeting siRNA对照（2皮摩尔）中，加入0.03微升Lipofectamine2000（锂电）在10微升的总体积，并将该溶液加入到各孔在384孔板中。然后冷冻保存AC6 / D 2L细胞加入用于反向转染和在湿润的培养箱中孵育70小时，在37℃。对D 2受体激动剂，quinpirole（1μM终浓度），或车辆，接着加入一个2小时培养。环磷酸腺苷的积累，刺激与300 nM的毛喉素（终浓度）为1小时，使用HTRF测定。 点击这里查看大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在努力促进外源过敏的研究中，我们广泛地修改了我们以前的方法实现一个精简的“组合和阅读”格式，易于进行高通量筛选和行动检查机制。主要的修改我们的协议可以概括如下：1）使用冷冻保存的细胞作为“测定就绪”试剂;测定到384 - 孔格式的2）的小型化，并在HTRF测定3）的利用cAMP的。
采用冷冻保存我们的基于细胞的测定，大大提高了效率和可重复性为我们日常的实验和筛选的努力。这种方法是一种工业标准，并且可以很容易地转换为学术研究设置26。提高细胞培养效率，细胞的小瓶在该细胞种群作为“现成的试剂”解冻，稀释，然后直接在384孔板FO镀每个R都检测。我们前面引入的冻存细胞的研究，旨在确定无脊椎动物的G蛋白偶联受体32,33的拮抗剂。这种方法是有利的，并没有在我们的实验室中进行，并需要运送在校园培养的细胞所带来的挑战，并可能引入变异的初步工作。利用我们的新方法，冷冻细胞，现在可以立即在测定开始前解冻并稀释在现场。除了 提高可重复性，低温保存也取消了48小时的时间内从细胞接种到试验执行（ 图1）。我们已经采用了多种重组受体和AC的亚型与功能读数，包括cAMP的积累和β-arrestin的招聘（布鲁斯特，TF，Ejendal，KFK和瓦，VJ未发表意见）成功应用了超低温保存方法的稳定和瞬时转染研究。德皮特我们的积极的经验到目前为止，研究人员应该验证其受体或目标，以及细胞模型系统与冷冻保存启动任何大规模研究之前兼容。
这是重要的是我们努力精简致敏试验参与消除澄清和洗涤步骤（ 图1）的第二个修改。这些变化是并发与我们的微型化在测定到一个96 - 孔格式（康利和瓦特，未发表的观察结果）。具体而言，修饰的致敏协议被设计，其中的cAMP蓄积通过直接加入毛喉素的以下在没有任何洗涤或倾析的步骤D 2激动剂孵育发起在测定缓冲液（见中间面板图1）。另外，cAMP的积累缓冲液含有较高浓度的螺哌隆（1μM）时，D 2拮抗剂，其具有0.07纳米为D 2的Ki值受体15。在cAMP的积累阶段这100倍螺哌隆业绩超出浓度在完成D 2受体的占领，从而使毛喉素中排除由激动剂残留的D 2受体激活（ 如 quinpirole）刺激的交流步骤15。这种变化消除了三个澄清和三个洗涤步骤如下初始激动剂孵化。为96孔格式开发的一部分，我们还能够消除最终倾出液步骤淬火之前和裂解细胞。从3-9％，并直接加入到试剂中的cAMP蓄积缓冲器;（TCA。 即三氯乙酸）该变形是通过增加了裂解试剂的浓度来实现。修改后的96孔敏化试验的有希望的结果，以384孔格式所规定的敏化试验的转换支持。不幸的是，我们以前的方法量化阵营是一个艰苦的filtratio正基础的[3 H] cAMP的蛋白结合测定（> 5步）。例如，该法通常完成超过两天的过程中，以允许过滤器的干燥和闪烁计数15,24。这些缺点提出的[3 H] cAMP的蛋白结合不切实际地利用了高吞吐量384孔格式。
通过方法的引入第三个关键的发展来为适合于384孔板的方式衡量和量化的cAMP。例如，我们可以选择使用cAMP反应元件（CRE）的荧光素酶为基础的用于在384孔板32,33相对cAMP的测量报告系统显著的体验。虽然这种方法已成功地应用于我们的实验室Gαs偶联受体的许多研究，CRE-luc的记者都受到了一些误报和漏报期间筛选试验34。此外，我们的初步D 2致敏与此应用程序的研究蟑螂并不令人鼓舞，因为我们观察到的荧光素酶信号（数据未显示）的表观反馈抑制。因此，我们集中精力的GloSensor cAMP的技术的实施通过构建和表征同时使用他们的“第一次”稳定细胞系和“第二”代GloSensor载体。该GloSensor是含有腺苷结合位点的荧光素酶蛋白35内一个精心设计的荧光素酶报告。虽然该系统是动能cAMP的定量非常有用的，该方法不能有效衡量激动剂诱发的过敏（康利和瓦，未发表意见）。我们还探讨了基于BRET的cAMP生物传感器36为我们的研究作为一个成本有效的手段来评估cAMP的积累。不幸的是，随着瞬时转染生物传感器相关的背景噪音限制了我们这个方法来适应我们的致敏试验能力。最后，我们评估了几种工具包采用均相时间分辨荧光染料escence（HTRF）在384 - 孔格式来测量cAMP的一种方法。 ，我们发现，这种既定方法是学术实验室和检查机构，因为它们是强大的，灵敏，稳定，且易于使用的最兼容。学术研究的主要缺点是试剂的成本，但是大量购买的试剂和小型化到384孔的格式，使与其他套件，包括基于ELISA的分析和我们以前的“自制”[3 H] cAMP的蛋白价格超过竞争力结合分析15。
代表作品展示了384孔敏检测，以交流信号在重组细胞系D 2多巴胺受体诱发过敏研究的适用性。在一些初步的研究，我们已经用这种分析稍作修改，以评估D 2多巴胺受体和μ阿片受体诱导的几个AC亚型致敏（表1）。这些研究突出了384孔分析到多种细胞系，受体亚型，和AC亚型的普遍适用性。那些有兴趣开发类似的检测形式将鼓励探索变量，如细胞密度，激动剂预处理时间，交流活化协议/条件，并为他们的细胞模型HTRF cAMP的检测方法。本文中所呈现的拮抗剂的数据表明，以确定致敏的小分子抑制剂的测定的能力。效力值与那些其它功能测定28以及使用放射性受体结合测定获得的亲和力（KI）的值来确定相一致（参见：http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php）。本实验的设计可以很容易地适应需要的化合物通过pintool交付或预镀在实验准备板HTS努力。除了所描述的敏化作用测定中，这里所采用的方法应适用于其它广告其中多个药物/试剂被施加之前的结束点测量在384孔格式aptive测定。
我们试图突出重要的发展步骤，为整个384孔检测，同时也希望注意的是，反向转染siRNA的实验的发展是特别具有挑战性。我们的长期目标，这些分析是进行全基因组的努力，以确定参与交流亚型的异源致敏的重叠和独特的基因。使用我们的初步实验的siRNA作为指导，我们提供用于开发的siRNA反向转染实验以下简称建议：（1）检查转染效率使用的指标，如SIGLO和转染试剂（ 如脂质体2000）的比率;（2）确定最佳的接种密度（ 例如 500-5000个细胞/孔），（3）转染探索持续时间（ 例如 48-96小时），（4）评估合适的测定条件下（ 例如药物TReatments，终点措施，以及强大的控制），实现最佳的信号（ 如 Z'因子分析）。额外的细节和用于筛选努力 中使用的siRNA的更多的一般信息，也可以在前面提到的方法的文章29,30找到。这些研究者谁感兴趣的高温超导努力也应该探索自己的分析的适应性，自动化（ 如 。pintool和机器人）。此外，其它因素或者控制用于筛选努力包括正式测定法的验证，细胞生存力测定法，并采取适当的相应的屏幕。对于更多的指导，有兴趣的读者将鼓励研究可通过NCATS的NCGC分析指导手册在：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/。
我们已经介绍了我们的方法，以简化费力多天检测到一个有效的“组合和阅读”，可以在一天内完成检测。和这里所描述的方法一1,280化合物μopioid受体诱导致敏1,536孔板格式25最近的一项研究表明，过敏现在可以很容易地使用高温超导审问。此处所描述的测定法是适合于小分子检测和可应用于遗传方法如siRNA的。我们的测定形式集中于称为AC的异源致敏的适应性反应，但是，一般的方法和方法可广泛地应用于其它基于细胞的测定法需要多药物和试剂添加（ 例如脱敏和神经保护作用）。据此间的工作是很容易在学术环境使用多道移液器和多模板读卡器能够读取所需的端点在384孔的格式来完成。
表1中。细胞模型测试激动剂诱导的过敏。
| 接收器 | AC亚型 | 细胞系 | 促进感受性 信号 |
| ð2L多巴胺 | 内源性 （AC6和AC7 27） | CHO-D 2L | 2-3折 |
| ð2L多巴胺 | 重组AC2，AC5，AC6和 | HEK 293稳定转染 | AC2 = 2-3折 AC5 = 50倍 AC6 = 15倍 |
| μ阿片 | 重组AC1，AC2，并AC5 | HEK 293稳定转染 | AC1 = 6-7折 AC2 = 2-3折 AC5 = 10-15倍 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢理查德·辛克先生和Todd Wiernicki方法学的培训和实验指导。我们还要感谢约翰·保罗·斯彭斯仔细阅读和编辑建议。这项工作是由卫生MH 060397，脑与行为研究基金会和美国礼来公司的研究所和公司通过礼来公司研究奖励计划（LRAP）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384-well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase- and RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Nontargeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J.
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
