Summary
تنشيط دائم لG-البروتين يقترن مستقبلات نتائج المثبطة في توعية أدينيليل محلقة الإشارة. لتحديد المسارات الجزيئية الأساسية، ونهج nonbiased ضرورية، ولكن هذا يتطلب استراتيجية تطوير خلية مقرها قابلة المخيم توعية الفحص. هنا، نحن تصف مقايسة لتوعية جزيء صغير وسيرنا الفرز.
Abstract
وقد تورط توعية أدينيليل محلقة (AC) إشارات في مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية والنفسية والعصبية بما في ذلك تعاطي المخدرات ومرض الشلل الرعاش. تفعيل الحاد في Gαi / المستقبلات المرتبطة س يثبط النشاط AC، بينما تنشيط دائم لهذه النتائج المستقبلات في توعية مغاير من AC وزيادة مستويات مخيم داخل الخلايا. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن هذا تعزيز الاستجابة AC لوحظ سواء في المختبر والمجراة عقب تفعيل المزمن من عدة أنواع من المستقبلات Gαi / س مرتبطة بما في ذلك مد 2 الدوبامين وμ مستقبلات المواد الأفيونية. على الرغم من أن أفيد غيري من التوعية AC للمرة الأولى منذ أربعة عقود، آلية (ق) التي تكمن وراء هذه الظاهرة لا تزال مجهولة إلى حد كبير. عدم وجود بيانات الآلية يعكس يفترض أن التعقيد مع هذا الرد على التكيف، مما يشير إلى أن النهج nonbiased يمكن أن تساعد في تحديدجي المسارات الجزيئية المشاركة في توعية مغاير من AC. وقد تورط الدراسات السابقة كيناز وGbγ إشارات على أنها متداخلة المكونات التي تنظم توعية مغاير من AC. لتحديد أهداف إضافية فريدة ومتداخلة المرتبطة توعية AC، مطلوب تطوير والتحقق من صحة قابلة للمقايسة المخيم توعية لزيادة الإنتاجية. النهج السابقة لدراسة توعية عموما مرهقة تنطوي على خلية المستمر الصيانة الثقافة وكذلك منهجية معقدة لقياس تراكم المخيم الذي ينطوي على خطوات غسل متعددة. وبالتالي، فإن تطوير فحص خلية مقرها قوية والتي يمكن استخدامها لفحص إنتاجية عالية (HTS) في شكل جيد 384 تسهيل الدراسات المستقبلية. باستخدام اثنين من مستقبلات الدوبامين D 2 نماذج الخلوية (أي. CHO-D-2L وكلوة الجنين البشري AC6 / D 2L)، ونحن لدينا فحص وتحويلها توعية 48 جيدا (> 20 الخطوات 4-5 أيام) إلى خمسة لياليTEP، مقايسة يوم واحد في شكل 384 جيدا. هذا الشكل الجديد هو قابل للفحص جزيء صغير، وعلينا أن نبرهن على هذا التصميم الفحص يمكن أيضا أن تستخدم بسهولة لترنسفكأيشن سيرنا عكس تحسبا لاستهداف الفرز مكتبة سيرنا.
Introduction
تم اكتشاف أدينيليل محلقة التكيفية (AC) إشارة استجابة المعروفة باسم مغاير أو فائقة توعية الأولى في مختبر الحائز على جائزة نوبل، والدكتور مارشال Nirenberg. اقترح الدكتور Nirenberg أن زيادة الاستجابة AC لاحظ التالية تنشيط مستقبلات المواد الأفيونية δ المزمنة كانت آلية المشاركة في التسامح الأفيونية والاعتماد 1. بالإضافة إلى تنشيط مستقبلات المواد الأفيونية δ المزمن، يحدث هذا الرد neuroadaptive من AC يشير أيضا التالية تنشيط دائم لعدة Gαi / س يقترن مستقبلات أخرى 2. والجدير بالذكر أن العديد من هذه المستقبلات المقترنة مع الألم، والاضطرابات العصبية والنفسية والعصبية، وتشمل المواد الأفيونية μ / κ، D 2/4 الدوبامين، 5HT 1A، وM 2/4 مستقبلات المسكارينية 2. بالإضافة إلى النتائج د. Nirenberg، ومجموعة كبيرة من الأدلة التي تربط موجود توعية AC يشير إلى تنشيط مستقبلات المواد الأفيونية المزمنة على حد سواء
توفر هذه الدراسات الأساس المنطقي لدراسة آليات لتوعية أدينيليل محلقة كهدف مهم العصبية الحيوية. وبالمثل، ينبغي أيضا الاعتراف أهمية الفسيولوجية للAC إشارة 8 وأهمية أن عقد الأشكال الإسوية AC الفردية في هذه الاستجابة التكيفية 2،9،10. في سياق بحثنا، الملامح العامة المرتبطة توعية مغاير من الأشكال الإسوية المؤتلف من AC موازية تلك الخصائص قصرcribed لدراسة الأشكال الإسوية الذاتية للAC. على وجه التحديد، وقد وجدت الأبحاث السابقة أن تفعيل بروتينات Gαi / س ومفارز إطلاق اللاحقة / إعادة ترتيب βγ هي المتطلبات الهامة للمستقبلات التي يسببها توعية جميع الأشكال الإسوية AC. بالإضافة إلى ذلك، تشير العديد من الدراسات أن يشير من تحركات البروتينات ومفارز Gβγ يشاركون في التوعية 2،11-13. أيضا عرض التكييف الفردية أنماط فريدة من نوعها ومتميزة توعية 12. على سبيل المثال، يرتبط التعرض المستمر للمستقبلات D 2 لمنبهات مع توعية AC1 وAC8 لكا 2 + / كالمودولين التحفيز 14،15، في حين لم يتم توعيتهم على AC3 وثيقة الصلة 2. ترتبط AC2، AC4، وAC7 عن كثب، ومع ذلك، يتم توعيتهم فقط النشاط AC2 حفز PKC-بقوة بعد التعرض لفترة طويلة من مستقبلات D 2 إلى ناهضات 7،14،16،17. بالإضافة إلى ذلك، AC5 وAC6 تظهر درجة ملحوظة من شاذ؛ غير سويتوعية ologous إلى الغاز وحفز forskolin تراكم المخيم التالية تفعيل مستقبلات D 2 14،18-20، ولكن يبدو أن تختلف في ما يتطلبه Gβγ الوحيدات-AC التفاعلات 21. على الرغم من أن معظم الدراسات من AC توعية استخدمت خطوط الخلايا نموذج (مثل الخلايا HEK293 التعبير عن الأشكال الإسوية AC الفردية)، يبدو أن هذه النتائج تترجم إلى نماذج الخلايا العصبية الأصلي 4،22. في الآونة الأخيرة، وآثار AC الإسوي مثبطات جزيء صغير المحددة في الخلايا HEK293 التعبير عن الأشكال الإسوية AC يمكن أيضا أن تترجم إليها في الدراسات المجراة السلوكية 23.
من المرجح يعكس عدم وجود آلية الجزيئية التي تم تحديدها لتوعية مغاير تعقيد استجابة تكيفية وكذلك خصائص تنظيمية فريدة من نوعها للفرد AC الأشكال الإسوية 12. كشف هذه الدرجة من التعقيد يزداد تعقيدا من خلال استخدام منهجية مرهقة رقبعة محدودة المحققين الأكاديمية من استخدام نهج غير متحيز. على سبيل المثال، تشارك دراساتنا السابقة الآلي استخدام النماذج الخلوية مثقف باستمرار باستخدام 24 - و 48 جيدا زراعة الأنسجة شكل 15. وعادة ما نمت الخلايا المستزرعة لمدة 48 ساعة ثم تعرض لمعاملة المخدرات ناهض (2-18 ساعة)، يليه سلسلة من يغسل الخلايا وحضانات (الشكل 1). كان المخيم محددة بروتوكولات تراكم AC-الإسوي ثم يعمل تليها قياس تراكم المخيم باستخدام شاقة وتستغرق وقتا طويلا [3 H] المخيم منهجية 15،24 ملزمة. مدة من البداية الى النهاية لكل مقايسة مطلوب عموما ما مجموعه أربعة إلى خمسة أيام من الطلاء الخلية لتحليل البيانات (الشكل 1). وقد أدى تطبيق التكنولوجيات الجديدة والأتمتة إلى تحسينات ملحوظة للدراسات التوعية في الإعداد الصناعية ومركز HTS. على سبيل المثال، مجموعة العمل مع المركز الوطني للكيمىذكرت كال الجينوم اثنين يوم HTS إجراء فحص لتحديد جزيء صغير مثبطات مستقبلات المواد الأفيونية من μ يسببها التوعية في 1،536 جيدا شكل 25.
ويصف هذه المادة جهودنا لتطوير مقايسة HTS للدراسات توعية مغاير باستخدام التكنولوجيات المتوفرة في معظم المؤسسات البحثية الأكاديمية. تم إنجاز هذه الاستراتيجية من خلال دمج استخدام الخلايا cryopreserved من نماذج الخلايا معربا عن heterologously على مستقبلات الدوبامين D 2 في تركيبة مع الذاتية الفردية أو المؤتلف الأشكال الإسوية أدينيليل محلقة (CHO-D-2L أو كلوة الجنين البشري AC6 / D 2 L). لتحسين الإنتاجية لدينا، ونحن لدينا 48 إعادة تصميم جيدا مقايسة توعية (حوالي> 20 خطوات أكثر من 4-5 أيام) إلى خمس خطوات، مقايسة يوم واحد في شكل 384-جيدا أن كان أساسا "خلط وقراءة". يستخدم الشكل الجديد وقت متجانسة المتاحة تجاريا حل مضان (HTRF) فحص لقياس المخيم وفقumulation في خلايا سليمة مع لوحة متعددة وضع القارئ. مقايسة قوية وقابلة للفحص جزيء صغير، ويمكن تطبيقها على نحو فعال للكشف عن مثبطات للتوعية مغاير. بالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم البيانات التي يسمح استخدام هذا الاختبار مع ترنسفكأيشن عكس سيرنا لاستهداف أو الجينوم واسعة الفرز مكتبة سيرنا فقط مع تعديل طفيف على النهج العام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التوسع والحفظ بالتبريد من الخلايا الفحص جاهز
- ثقافة CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) الخلايا على طبق خلية ثقافة 15 سم 2 في وسائل الإعلام F12 هام لتستكمل مع 1.0 ميكرومتر L-الجلوتامين، 800 ميكروغرام / ميكرولتر G418، 300 ميكروغرام / هيغروميسين ميكرولتر، 100 ش / ميكرولتر البنسلين، 100 ميكروغرام / ميكرولتر الستربتوميسين، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS).
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 حتى الخلايا هي 90-95٪ متموجة. غسل الخلايا مع 10 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وحصاد الخلايا عن طريق إضافة 3 ميكرولتر من العازلة تفارق خلية لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. resuspend الخلايا باستخدام 12 ميكرولتر من وسائل الإعلام والثقافة، والاعتماد استبعاد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق.
- الطرد المركزي تعليق خلية في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح في وطاف resuspend الكرية خلية في 5 ميكرولتر من وسائل الإعلام تجميد (10٪ ميثيل سلفوكسيد، 90٪ FBS). تمييع تعليق خلية لتحقيق تركيز الخلية المطلوبة (على سبيل المثال 1-20 × 10 6 خلية / ميكرولتر).
- قسامة 1.0 ميكرولتر من محلول الخلية إلى كل cryovial. احتضان cryovials في حاوية تجميد الخلايا في -80 درجة مئوية خلال الليل. نقل cryovials إلى السائل N 2 خزان للتخزين على المدى الطويل.
2. طلي الفحص خلايا جاهزة (وعكس ترنسفكأيشن الخيار)
- ذوبان الجليد بسرعة على cryovial المجمدة من الخلايا في 37 درجة مئوية حمام الماء. حالما يتم إذابة الخلايا، ونقل الخلايا إلى 15 ميكرولتر المخروطية أنبوب يحتوي على 9 ميكرولتر من غروب-MEM، وتخلط بواسطة قلب الأنبوب 3-5X.
- الطرد المركزي الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح في وطاف resuspend الخلايا في 1 ميكرولتر غروب MEM.
- عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد لتحديد بقاء الخلية وتمييع الخلايا قادرة على البقاء عند الضرورة (على سبيل المثال. 3 × 10 5 خلية / تركيز ميكرولتر) فيالأمثل-MEM. لوحة 10 ميكرولتر / جيد من الخلايا في نسيج الثقافة تعامل وحة 384 جيدا باستخدام ماصة الأقنية.
- جعل التخفيفات المسلسل من المخيم في غروب MEM لتوليد منحنى القياسية لتقدير الإنتاج المخيم من قبل خلايا (وفقا لتوصيات بتصنيع - انظر القسم 7). إضافة 10 ميكرولتر / جيد من معايير المخيم إلى لوحة ملاحظة: منحنى معيار واحد يمكن أن يكون مستعدا على لوحة منفصلة أو الآبار فارغة في واحدة من لوحات مقايسة.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة، واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 لمدة 1 ساعة.
3. عكس سيرنا ترنسفكأيشن الخيار *
هذا القسم هو اختياري وذات الصلة إلى الشكل 3.
- يعد حل سيرنا في DDH ريبونوكلياز خالية 2 O (على سبيل المثال 0.4 بمول / ميكرولتر). إضافة 5 ميكرولتر من الآبار الفردية لوحة 384 جيدا، وأجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 حد ذاتهج في درجة حرارة الغرفة.
- تمييع Lipofectamine عام 2000 في غروب MEM بمعامل 0.006 (على سبيل المثال إضافة 6 ميكرولتر من Lipofectamine 2000 إلى 1،000 ميكرولتر من غروب-MEM)، ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
- احتضان الحل Lipofectamine 2000/Opti-MEM لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 5 ميكرولتر من المخفف حل Lipofectamine 2000/Opti-MEM إلى الآبار الفردية لوحة 384 جيدا الذي يحتوي بالفعل سيرنا. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- لوحة فحص الخلايا على استعداد كما هو موضح أعلاه (القسم 2). أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
- العودة إلى لوحة فحص حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية (5٪ CO 2) ل48-96 ساعة كما هو محدد لاستهداف الجينات نهدم (انظر المناقشة).
4. فحص جزيء صغير
- يخفف من المخدرات من اهتمام (مثبطات على سبيل المثال. جزيء صغير) في غروب-MEM إلى 6X تركيزات النهائي المنشود. التخفيفات التسلسلي يمكن أن تكتمل باستخدام ماصات باليد أو محطة مناولة السائل.
- إضافة 2.5 ميكرولتر / جيد للمجمع اختبار أو العازلة التي تحتوي على المركبات (مثل DMSO) إلى جانب الآبار باستخدام ماصة الأقنية.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة (الحضانة اختياري).
5. استمرار العلاج ناهض
- إعداد 600 نانومتر (أي 6 أضعاف التركيز النهائي المطلوب من 100 نانومتر) حل quinpirole في غروب MEM.
- إضافة 2.5 ميكرولتر / جيد من حل نانومتر 600 quinpirole إلى جانب الآبار باستخدام ماصة الأقنية.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة، واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 لمدة 2 ساعة.
6. التحفيز مخيم تراكم
- أثناء الحضانة 2 ساعة، وإعداد stimulatiعلى الحل في غروب MEM. ويتألف الحل التحفيز من 40 ميكرومتر forskolin، 2 ميكرومتر الاستيوفينون 3-1-methyxanthine (IBMX)، و 4 ميكرومتر سبيبيرون (جميع التركيزات في الخطوة 6 و4X تركيز النهائي المطلوب).
- إضافة 5 ميكرولتر / جيد من الحل التحفيز إلى جانب الآبار باستخدام ماصة الأقنية.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
7. تبريد وتقدير من المخيم تراكم
- يتم قياس الإنتاج من المخيم من قبل الخلايا باستخدام المخيم ديناميكية 2 عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لفترة وجيزة، إعادة المضادة للمعسكر ومعسكر cryptate-D2 في الماء المقطر. تجميد aliquots في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير.
- تمييع قسامة واحدة المضادة للمعسكر cryptate وقسامة واحدة من المخيم-D2 بشكل منفصل في تحلل العازلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لجعل حلول العمل.
- Aي 10 ميكرولتر / جيد من حل العاملة المضادة للمعسكر cryptate و 10 ميكرولتر / جيد من الحل العمل المخيم-D2 إلى لوحة 384 جيدا باستخدام ماصة الأقنية.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- قراءة في لوحة قارئ لوحة مضان (إعداد مقياس للحساسية السيارات) باستخدام الإثارة من 337 نانومتر، وقياس الانبعاثات في 620 نانومتر و 665 نانومتر في المصنوعات التعليمات.
- تطبيق تحليل ratiometric لتقييم منحنى القياسية في المخيم بتصنيع التعليمات. باستخدام القيم الناتجة، استقراء تراكم المخيم المقدر في آبار اختبار باستخدام برمجيات تحليل البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الجزء الأول تطوير 384 التوعية مغاير كذلك فحص لتحديد مثبطات جزيء صغير باستخدام نموذج الخلية متاحة تجاريا.
لدراسة توعية مغاير في نموذج الخلية، التي قطعناها على أنفسنا عددا من التحسينات التي مكنتنا من تبسيط الفحص إلى "خلط وقراءة" تنسيق. ويسلط الضوء على العديد من التعديلات الرئيسية أدناه، ويتم وصفها بمزيد من التفصيل في المناقشة. الخطوة الرئيسية الأولى التي بتعديل زراعة الخلايا لدينا من الخلايا المستزرعة بشكل مستمر لخلايا cryopreserved 26. نحن الآن بشكل روتيني دفعات ثقافة الخلايا التي يمكن cryopreserved بتركيزات بين 1-20 × 10 6 خلية / ميكرولتر. لكل مقايسة منها، وإذابة مخزون الخلية، المخفف، عدها، ثم مطلي مباشرة في لوحات 384 جيدا. مما يلغي الحاجة لفترة والثقافة، وزيادة الراحة من الفحص. شكل لدينا توعية مقايسة السابقة استخدمت TISS 48 جيدلوحات ثقافة رق، وشارك فيها عدد من يغسل، صب، خطوات نقل، وعلى أساس الترشيح [3 H] المخيم فحص (الشكل 1) ملزمة. وبالتالي، كان هذا الشكل لتوعية غير قابلة للتطبيقات إنتاجية عالية. لذلك، نحن بذلنا جهودا كبيرة لتبسيط الفحص الأول إلى 96 جيدا ثم شكل 384 جيدا قابلة للتعديل لفحص إنتاجية عالية. القضاء الأمثل المعنية من خطوات غسل وتقييم أنواع متعددة من لوحات ثقافة / الفحص، متفاوتة الكثافة الخلية، وفترات الحضانة المختلفة. كما اكتشفنا عدة منهجيات للكشف عن المخيم ووجدت أن تتميز كذلك التكنولوجيا المستخدمة في المخيم HTRF هذا البروتوكول كان تكرار للغاية وموثوق بها، ومستقرة للغاية. ويستند هذا الفحص على منصة immunocompetition بين المخيم التي تنتجها الخلايا وصفت المخيم (أي. المخيم-D2) التي تقدمها المجموعة. لدينا الآن نجحت في تطوير وتطبيق بروتوكولات لsensit مغايرسعودة في شكل 384 جيدا التي هي أساسا "مزيج وقراءة" (يمين لوحة الشكل 1).
كان هدفنا الأولي لتوليد عالية الإنتاجية D 2L مستقبلات توعية الفحص باستخدام خلايا متاحة تجاريا CHO-D 2L (الإنسان DRD 2L، عدد الانضمام: NM_000795) التي تعبر عن التطور الطبيعي AC6 وAC7 27. كانت مطلية الخلايا CHO-D 2L Cryopreserved في 3،000 خلية / جيدا في 384 جيدا نسيج لوحة الثقافة، وتم معايرتها لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب. تم إزالة لوحات من الحاضنة وزيادة تركيزات ناهض D 2 quinpirole أضيفت في درجة حرارة الغرفة. الخلايا ثم تم تحضين لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب. ثم بدأت تراكم دوري امبير من خلال إضافة 10 ميكرومتر forskolin (منشط مباشرة لAC). الواردة المخزن المؤقت تراكم المخيم المانع phosphodiesterase، isobutylmethylxanthine (IBMX)، فضلا عن خصم D 2، سبيبيرون (1 ميكرومتر، K ط لD، 2L = 0.07 نانومتر)، وذلك لمنع المتبقية تنشيط مستقبلات D 2 خلال الفترة تراكم المخيم. وحضنت الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. تم إنهاء الفحص من خلال إضافة العازلة تحلل تحتوي على الكواشف HTRF المخيم. وكشفت الدراسات أن المعالجة 2 ساعة مع quinpirole تعزيز اللاحقة تراكم المخيم حفز forskolin بطريقة تعتمد على الجرعة تتفق مع توعية مغاير (الشكل 2A). تثبت نتائج هذه التجربة أن المقايسات التوعية لا يمكن أن يؤديها في شكل 384 جيدا. تخفيض تنسيق مقايسة جديدة عدد الخطوات من أكثر من 20-4 الخطوات دون الحاجة لغسل أو صب الخطوات مما يجعلها "خلط وقراءة" مقايسة (الشكل 1).
السلسلة الثانية من التجارب استكشاف ما إذا كان هذا الاختبار مبسطة جديدة يمكن استخدامها لمثبطات ssess للتوعية في نموذج CHO-D 2L. كانت مطلية Cryopreserved CHO-D 2 L الخلايا في 384 جيدا لوحة زراعة الأنسجة في مناطق ذات كثافة من 3،000 خلية / جيدا في غروب MEM. أضيفت المعروفة D 2 مضادات لمنع D 2 التي يسببها مستقبلات التوعية. الأمثل-MEM تحتوي على 100 نانومتر quinpirole (تركيز النهائي) ثم أضيف إلى وحدة تخزين ما مجموعه 15 ميكرولتر، وحضنت الخلايا لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب. بعد الحضانة، وبدأ تراكم المخيم من خلال إضافة مباشرة لforskolin (10 ميكرومتر تركيز النهائي)، وأنهيت فحص وقياس المخيم باستخدام HTRF. كشفت النتائج الأولية أن المعالجة مع سبيبيرون أو هالوبيريدول (D تنميط 2 الخصوم) منعت تماما توعية يسببها quinpirole من forskolin حفز المخيم تراكم (الشكل 2B). توفر هذه النتائج التحقق من صحة أن هذا النهج يمكن أن تستخدم لتحديد الصغيرةمثبطات جزيء من D 2 التي يسببها مستقبلات التوعية. في التجربة الثانية، استخدمنا هذا الأسلوب لتقييم فاعلية سلسلة من D 2 الخصوم لاختبار ما إذا كان هذه المركبات تمنع التوعية. مماثلة إلى النتائج السابقة، أظهرت هذه الدراسات أن مضادات D 2 مستعمل ناهض يسببها التوعية في جرعة تبعا للطريقة (الشكل 2C). كان النظام رتبة فاعلية لتثبيط التوعية بما يتفق مع أعمالهم كما D 2 مضادات مستقبلات والصيدلة بهم موضح سابقا في مستقبلات D 2 28.
الجزء الثاني. تطبيق الفحص توعية 384 جيدا لترنسفكأيشن سيرنا في الاتجاه المعاكس من المساعي الفرز.
كان هدفنا المقبل لوضع مقايسة توعية 384 جيدا والتي يمكن استخدامها لإجراء تحجيم ترنسفكأيشن سيرنا عكس الفرز المكتبة. وكانت الدراسات الأوليةتنفيذها باستخدام نموذج خلية كلوة الجنين البشري التي تعبر عن heterologously كلا D 2L مستقبلات الدوبامين (الفئران DRD 2L، عدد الانضمام: NM_012547) وAC6 (ADCY6 الفئران، عدد الانضمام: NC_005120) (أي الخلايا كلوة الجنين البشري AC6 / D 2L). التجارب الأولى تقييم القدرة على إثبات ناهض يسببها توعية AC في خط الخلية. لفترة وجيزة، كانت مطلية الخلايا AC6 / D 2L cryopreserved (1،000 خلايا / جيد) في 384 جيدا نسيج لوحة الثقافة. وأضيف الأمثل-MEM يحتوي على 1 ميكرومتر quinpirole (تركيز النهائي) إلى وحدة تخزين ما مجموعه 15 ميكرولتر، وحضنت الخلايا لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب. بعد الحضانة، وبدأ تراكم المخيم من خلال إضافة زيادة تركيزات forskolin. تم إنهاء الفحص من خلال إضافة العازلة تحلل تحتوي على الكواشف HTRF. أظهرت النتائج أن تعرض الخلايا إلى quinpirole ناهض لمدة 2 ساعة أدى إلى تعزيز ملحوظ في حفز forskolin كامتراكم P (الشكل 3A). كان تراكم متزايد من المخيم في كل 100 نانومتر و 300 نانومتر من forskolin أكبر من 15 أضعاف مقارنة مع الخلايا المعالجة مركبة (الشكل 3A).
المقبل، استخدمنا نشر منهجيات سيرنا 29،30 لتوجيه جهود التحسين التي تضمنت تقييما لمختلف الظروف العكسية ترنسفكأيشن (مثل الكواشف ترنسفكأيشن والكفاءة ترنسفكأيشن، كثافة الخلية، فترة حضانة، الخ). الدراسات الأولية المستخدمة siGloRed، وهو مؤشر على ترنسفكأيشن، بالاشتراك مع Lipofectamine 2000 إلى تحديد الظروف المثلى ترنسفكأيشن العكسي. أشارت التجارب التي بمول سيرنا 2-4 / 5 ميكرولتر H 2 O جنبا إلى جنب مع 0.03 ميكرولتر Lipofectamine 5/2000 ميكرولتر غروب MEM قدمت كفاءة ترنسفكأيشن ما يقرب من 95٪ في 72 ساعة دون أي سمية ملحوظة في الخلايا كلوة الجنين البشري (لا تظهر البيانات). نحن بعد ذلك درست تأثير Gαs سيرنا على توعية مغايرمن حفز forskolin تراكم المخيم في الخلايا AC6 / D 2L. اقترح سيرنا الغاز كعنصر تحكم إيجابية محتملة لGαs قد تم تحديدها على أنها عنصر أساسي في توعية مغاير لعدة الإسوية AC (أي AC1، AC2، AC5، وAC6) 19-21. وعلاوة على ذلك، في إشارة توعية 15 أضعاف في منطقتنا AC6 / D 2L نموذج الخلية (الشكل 3A) يقدم إشارة قوية إلى إطار الضوضاء لتقييم كفاءة ترنسفكأيشن عكسي. باستخدام الشروط الموضحة أعلاه، أكملنا الدراسات الأولية تقييم Gαs سيرنا كعنصر تحكم إيجابية، وأظهرت نتائجنا حصارا قويا (> 90٪) من التوعية (لا تظهر البيانات).
تخفيض الناجم عن سيرنا دراماتيكية في إشارة توعية يوفر السيطرة الإيجابية المناسبة لعملية الفرز سيرنا. للحصول على تقييم أكثر كمية لسيرنا فحص AC توعية مغاير، ونحن ولدت في البيانات التيتم حساب Z 'عامل لسلسلة من الشروط اختبار باستخدام الخلايا AC6 / D 2L 31. لهذه التجربة، ونحن الجمع بين 2 بمول Gαs سيرنا، أو سيطرة سيرنا عدم استهداف، في 5 ميكرولتر مع 0.03 ميكرولتر Lipofectamine 5/2000 ميكرولتر غروب MEM لكل بئر في لوحة 384 جيدا (اجمالى حجم 10 ميكرولتر). تم إذابة الخلايا Cryopreserved، معلق في غروب MEM ثم تضاف إلى الآبار الفردية التي تحتوي على سيرنا / Lipofectamine الخليط باستخدام عدة كثافة الخلية (أي. 500-5،000 cells/10 ميكرولتر / جيد). تم استكشاف مدة العلاج quinpirole (2 ساعة مقابل 18 ساعة) وكذلك تركيز النهائي من forskolin (100-300 نانومتر) أيضا في منطقتنا AC6 / D 2L توعية الفحص. كشفت نتائج هذه التجارب أن Z قوية "عامل تم الحصول عليها في الحالات التالية: 750 خلية / جيدا، مدة 72 ساعة ترنسفكأيشن، 2 ساعة العلاج quinpirole، و 300 نانومتر forskolin لتحفيز تراكم المخيم (الشكل 3B). في ظل هذه المشتركnditions، حصلنا على استجابة 15 أضعاف التوعية التي تم تخفيض بنسبة 94٪ في وجود Gαs سيرنا (Z '0.6 لGαs سيرنا مقابل. السيطرة سيرنا).
الشكل 1. في الشكل التقليدي، ومطلي الخلايا في شكل 48 جيدا ونمت لنقطة التقاء أكثر من 48 ساعة. ويصب وسائط النمو، مثبطات جزيء صغير أضاف، تليها إضافة ناهض D 2. بعد حضانة 2 ساعة، ويصب سائل الإعلام فحص ويتعرضون الخلايا إلى سلسلة من الخطوات غسل / صب. المقبل، يتم تحفيز AC ويتم هي lysed الخلايا. ثم يتم تقييم تراكم دوري امبير باستخدام [3 H] مقايسة المخيم ملزم وهو فحص 2 اليوم تتطلب خطوة الترشيح والتلألؤ العد. في حين أن شكل elimin 96 جيدated العديد من غسل وصب الخطوات، وجدنا أن هذا الشكل لم يكن قابلة بسهولة لHTS أو الأتمتة. يستخدم تنسيق HTS الخلايا cryopreserved التي مطلي مباشرة في لوحات 384 جيدا. هذه الخلايا هي cryopreserved "مقايسة جاهزة" بعد موازنة 1 ساعة. بعد هذه الفترة الحضانة الأولية، يمكن إضافة مثبطات جزيء صغير تليها إضافة لD 2 ناهض لحضانة 2 ساعة. يتم تحفيز AC، ويتم هي lysed الخلايا باستخدام الكواشف كشف HTRF في لوحة الفحص.
كانت مطلية الشكل 2. الخلايا Cryopreserved CHO-D 2L مباشرة في 384 لوحات مقايسة جيدا في 3000 خلية / جيدا ومعايرتها لمدة 1 ساعة. A.) تركيزات متزايدة من مد 2 ناهض، quinpirأوله، وأضيفت وحضنت الخلايا لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب. وقد حفز تراكم دوري امبير مع 10 ميكرومتر forskolin (تركيز النهائي) في وجود سبيبيرون وIBMX لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. كان رد فعل تطفئ باستخدام الكواشف HTRF المخيم فحص (ن = 1، ممثل لا يقل عن 3 تجارب). يتم التعبير عن بيانات كرد في المئة من الخلايا المعالجة السيارة. كانت سابقة التجهيز خلايا B.) CHO-D 2L في غياب (السيطرة) أو وجود أشارت D 2 مضادات مستقبلات (أي سبيبيرون أو هالوبيريدول). وأضاف Quinpirole (100 نانومتر)، وحضنت الخلايا لمدة 2 ساعة للحث على التوعية. وقد حفز AC مع 10 ميكرومتر forskolin (تركيز النهائي) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم تحديد دوري امبير باستخدام HTRF. يتم التعبير عن بيانات كرد في المئة من الخلايا المعالجة السيارة كانت سابقة التجهيز. C.) خلايا CHO-D 2L في غياب (التحكم =100٪) أو وجود تركيز متزايد من أشار D 2 مضادات مستقبلات. وأضاف Quinpirole (100 نانومتر)، وحضنت الخلايا لمدة 2 ساعة للحث على التوعية. وقد حفز AC مع 10 ميكرومتر forskolin (تركيز النهائي) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم تحديد دوري امبير باستخدام HTRF. يتم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من الاستجابة التوعية التي يسببها quinpirole. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. كانت مطلية الخلايا Cryopreserved HEK-AC6 / D 2L في 1000 خلية / جيدا ومعايرتها لمدة 1 ساعة. A.) وحضنت الخلايا مع مركبة أو 100 نانومتر quinpirole لمدة 2 ساعة في حاضنة مرطب. وا ACق حفز مع زيادة تركيزات forskolin لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم تحديد دوري امبير باستخدام HTRF. ب) ترنسفكأيشن عكسي من Gαs سيرنا كتل التوعية في الخلايا AC6 / D 2L. وكان الجمع بين Gαs سيرنا أو سيطرة سيرنا nontargeting (2 بمول) مع 0.03 ميكرولتر Lipofectamine2000 (ليبو) في حجم ما مجموعه 10 ميكرولتر، وأضيف الحل لالآبار الفردية في لوحة 384 جيدا. وبعد ذلك أضاف AC6 Cryopreserved / D 2L الخلايا لترنسفكأيشن العكسي والمحتضنة لمدة 70 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب. ناهض مستقبلات D 2، وأضيف quinpirole (1 ميكرومتر النهائي)، أو مركبة تليها الحضانة 2 ساعة. وقد حفز تراكم دوري امبير مع 300 نيوتن متر forskolin (تركيز النهائي) لمدة 1 ساعة وتقاس باستخدام HTRF. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في محاولة لتسهيل الدراسات التوعية مغاير، ونحن قد عدلت على نطاق واسع لدينا وسيلة مبسطة السابقة تحقيق "مزيج وقراءة" شكل غير قابلة للتعديل لالفرز الفائق الإنتاجية وآلية الفحص العمل. التعديلات الرئيسية لبروتوكول لدينا يمكن تلخيصها على النحو التالي: 1) استخدام الخلايا cryopreserved كما الكواشف "مقايسة جاهزة"؛ 2) التصغير للمقايسة إلى تنسيق 384 جيدا، و 3) استخدام قياس HTRF من المخيم.
اعتماد الحفظ بالتبريد لفحوصات لدينا خلية مقرها تحسن كثيرا من كفاءة واستنساخ لأيامنا هذه لتجارب اليوم والمساعي الفرز. هذا النهج هو معيار الصناعة، ويمكن ترجمتها بسهولة إلى البحث الأكاديمي وضع 26. لتحسين كفاءة الخلايا الثقافة، وتستخدم قارورة من الخلايا كما "قبالة الجرف الكواشف" في تلك الأسهم يتم إذابة الخلايا، المخفف، ثم مطلي مباشرة في لوحات 384 جيدا للص كل فحص. نحن أدرجت سابقا الخلايا cryopreserved في الدراسات التي تهدف إلى تحديد الخصوم من البروتين G اللافقارية المستقبلات إلى جانب 32،33. كان من المفيد في هذه المنهجية أن العمل الأولي لم يتم تنفيذ في مختبرنا واستلزم نقل الخلايا المستزرعة عبر الحرم الجامعي الذي قدم التحديات وقدم تقلب احتمالا. استخدام نهج جديد لدينا، والخلايا المجمدة يمكن الآن إذابة فورا والمخفف في الموقع قبل الشروع في الفحص. بالإضافة إلى تحسين استنساخ، وأيضا القضاء على الحفظ بالتبريد الفترة الزمنية 48 ساعة من الطلاء الخلية لتنفيذ فحص (الشكل 1). لقد طبقت بنجاح نهج الحفظ بالتبريد في الدراسات ترنسفكأيشن مستقرة وعابرة باستخدام مجموعة متنوعة من مستقبلات المؤتلف وأنواع فرعية من التكييف مع قراءات الوظيفية بما في ذلك تراكم المخيم والتوظيف β-arrestin (بروست، TF، Ejendal، KFK، واتس، VJ الملاحظات غير منشورة) . قصرpite التجارب الإيجابية التي حققناها حتى الآن، يجب على الباحثين تحقق من أن مستقبلات أو الهدف، ونظام خلية النموذج هو متوافق مع الحفظ بالتبريد قبل الشروع في أي دراسات على نطاق واسع.
والتعديل الثاني الذي كان مهما لجهودنا الرامية إلى تبسيط القضاء المعنيين توعية مقايسة من صب وغسل الخطوات (الشكل 1). وكانت هذه التغييرات المتزامنة مع شركائنا التصغير للمقايسة إلى تنسيق 96 جيدا (كونلي واتس، والملاحظات غير منشورة). على وجه التحديد، تم تصميم بروتوكول تعديل التوعية حيث بدأ تراكم المخيم من خلال إضافة مباشرة لforskolin العازلة في الفحص التالية D 2 ناهض الحضانة في حالة عدم وجود أي غسيل أو صب الخطوات (انظر لوحة منتصف الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، تضمن العازلة تراكم المخيم على نسبة عالية نسبيا من سبيبيرون (1 ميكرومتر)، وهو خصم D 2 الذي يحتوي على قيمة كي 0.07 نانومتر لD 2مستقبلات 15. هذا 100 أضعاف تركيز تتجاوز النتائج سبيبيرون في كامل D 2 مستقبلات الاحتلال خلال مرحلة تراكم المخيم، مما يحول دون المتبقية D 2 عن طريق تنشيط مستقبلات منبهات (على سبيل المثال quinpirole) خلال forskolin حفز AC الخطوة 15. القضاء على هذا التغيير في صب ثلاث وثلاث خطوات غسل التالية الحضانة ناهض الأولي. كجزء من تطوير شكل 96 جيدا، وكنا أيضا قادرة على القضاء على الخطوة النهائية قبل صب التبريد وlysing الخلايا. وقد تحقق هذا التعديل من خلال زيادة تركيز دينا كاشف lysing (أي حمض الخليك ثلاثي الكلور؛ TCA) 3-9٪ وإضافة الكاشف مباشرة إلى المخزن المؤقت تراكم المخيم. قدمت نتائج واعدة للتعديل مقايسة 96 كذلك توعية ودعم تحويل مقايسة التوعية إلى تنسيق 384 جيدا. للأسف، كان لدينا منهجية السابقة لقياس المخيم filtratio شاقةاستنادا ن [3 H] البروتين المخيم مقايسة ملزمة (> 5 خطوات). على سبيل المثال، يتم الانتهاء من فحص عموما على مدى يومين للسماح لتجفيف مرشح والتلألؤ عد 15،24. جعلت هذه العيوب و[3 H] البروتين المخيم ملزمة عملي للاستفادة من لإنتاجية عالية تنسيق 384 جيدا.
وجاء هذا التطور الرئيسي الثالث من خلال دمج منهجيات لقياس وقياس المخيم بطريقة قابلة للتنسيق 384 جيدا. على سبيل المثال، لدينا خبرة كبيرة باستخدام عنصر الاستجابة المخيم (لجنة المساواة العرقية) المستندة إلى نظام luciferase المراسل الصحفي لقياسات المخيم النسبي في شكل 384 جيدا 32،33. على الرغم من أن هذا النهج قد استخدمت بنجاح من قبل المختبر لدينا العديد من الدراسات لمستقبلات Gαs جانب، للصحفيين، لجنة المساواة العرقية لوك تخضع لعدد من ايجابيات كاذبة والسلبيات خلال فحص المقايسات 34. بالإضافة إلى ذلك، لدينا D 2 الدراسات توعية أولية مع هذا التطبيقصرصور لم تكن مشجعة في هذا لاحظنا ما يبدو ردود الفعل تثبيط إشارة luciferase المراسل (لا تظهر البيانات). لذلك، ركزنا جهودنا على تنفيذ التكنولوجيا GloSensor المخيم عن طريق بناء وتميز خطوط الخلايا مستقرة باستخدام كلا من "الأولى" و "الثانية" الجيل ناقلات GloSensor. وGloSensor هو مراسل luciferase المهندسة يحتوي على موقع ملزمة المخيم ضمن luciferase المراسل البروتين 35. على الرغم من أن نظام مفيد جدا لالحركية المخيم الكمي، كان طريقة غير فعالة لقياس الناجم عن ناهض توعية (كونلي واتس، والملاحظات غير منشورة). كما اكتشفنا لبريت المقيمين في المخيمات جهاز الاستشعار البيولوجي 36 لدراساتنا باعتباره وسيلة فعالة من حيث التكلفة لتقييم تراكم المخيم. للأسف، والضوضاء في الخلفية المرتبطة جهاز الاستشعار البيولوجي عابر تقتصر قدرتنا على التكيف مع هذا الأسلوب لدينا فحص حساسية. أخيرا، قمنا بتقييم عدة مجموعات متجانسة توظيف الوقت حل فلوريescence (HTRF) كنهج لقياس المخيم في شكل 384 جيدا. وجدنا أن هذه المنهجية المقررة وكان أكثر توافقا مع المختبرات الأكاديمية ومرافق الفرز وذلك لأنها كانت قوية وحساسة، ومستقرة، وسهلة الاستخدام. العيب الرئيسي للمحققين الأكاديمية هي تكلفة الكواشف، ولكن الشراء بالجملة من الكواشف والتصغير إلى 384 شكل جيد يجعل السعر أكثر من تنافسية مع مجموعات أخرى، بما في ذلك فحوصات ELISA مقرها ورسائلنا السابقة "محلية الصنع" [3 H] البروتين المخيم فحص 15 ملزمة.
يوضح عمل ممثل انطباق توعية فحص 384 جيدا لدراسات D 2 مستقبلات الدوبامين توعية الناجم عن AC الإشارات في خطوط الخلايا المؤتلف. في العديد من الدراسات الأولية، وقد استخدمنا هذا الاختبار مع تعديلات طفيفة لتقييم D 2 مستقبلات الدوبامين والمواد الأفيونية مستقبلات μ التوعية التي يسببها العديد من الأشكال الإسوية AC (الجدول 1). هذه الدراسات تسلط الضوء على تطبيق العام للمقايسة 384 جيدا لخطوط متعددة الخلايا، وأنواع فرعية مستقبلات، والأشكال الإسوية AC. أن المهتمين في تطوير صيغ فحص مماثلة يتم تشجيعهم على استكشاف المتغيرات مثل كثافة الخلية، وأوقات المعالجة ناهض، AC بروتوكولات تفعيل / الشروط، ومنهجية الكشف HTRF مخيم للنماذجها الخلوية. البيانات الواردة في هذه الوثيقة خصم إثبات القدرة للمقايسة لتحديد مثبطات جزيء صغير من التوعية. قيم رجولية متوافقة مع تلك تحديدها مع المقايسات الفنية الأخرى 28 وكذلك تقارب (كي) القيم التي تم الحصول عليها باستخدام مستقبلة إشعاعية المقايسات ملزمة (انظر: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php). تصميم مقايسة الحاضر يمكن أن تستوعب بسهولة HTS الجهود حيث يتم تسليم المركبات عبر pintool أو preplated في مقايسة لوحات جاهزة. بالإضافة إلى فحوصات التوعية وصفها، يجب على المنهجيات المطبقة هنا يمكن تطبيقها على الإعلانية الأخرىالمقايسات aptive حيث يتم تطبيق أدوية متعددة / الكواشف قبل إجراء نقطة النهاية في شكل 384 جيدا.
حاولنا تسليط الضوء على خطوات تطور مهم لكامل فحص 384 جيدا، ولكن أيضا أريد أن أشير إلى أن تطوير العكس المقايسات ترنسفكأيشن سيرنا كان تحديا من نوع خاص. هدفنا على المدى الطويل لهذه المقايسات هو إجراء جهد واسعة الجينوم لتحديد الجينات المتداخلة وفريدة من نوعها تشارك في التوعية مغاير من الأشكال الإسوية AC. باستخدام لدينا فحص سيرنا الأولية كمبدأ توجيهي، ونحن نقدم ما يلي اقتراحات مختصرة لوضع المقايسات ترنسفكأيشن سيرنا عكس: (1) دراسة كفاءة ترنسفكأيشن باستخدام نسب مؤشرا مثل SIGLO وكاشف ترنسفكأيشن (. مثل Lipofectamine 2000)، (2) تحديد كثافة البذر الأمثل (على سبيل المثال 500-5،000 خلايا / جيد)، (3) استكشاف مدة ترنسفكأيشن (على سبيل المثال 48-96 ساعة)، و (4) تقييم الأوضاع الفحص المناسب (على سبيل المثال آر المخدراتeatments، تدابير نقطة النهاية، وضوابط قوية) لتحقيق إشارة الأمثل (مثل Z 'التحليل العاملي). تفاصيل إضافية ومزيد من المعلومات العامة عن استخدام سيرنا في المساعي الفحص يمكن أيضا أن تكون موجودة في أساليب المقالات المشار إليه سابقا 29،30. ينبغي لتلك المحققين الذين يرغبون في الجهود HTS أيضا استكشاف القدرة على التكيف من المقايسات لأتمتة (على سبيل المثال. pintool والروبوتات). بالإضافة إلى ذلك، عوامل أو عناصر التحكم الأخرى للمساعي الفرز تشمل التحقق من صحة رسمية الفحص، المقايسات بقاء الخلية، وشاشات مكافحة المناسبة. للحصول على إرشادات إضافية، وسوف تشجع القارئ المهتم لفحص يدوي NCGC الفحص الإرشاد المتاحة من خلال NCATS في: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/.
وصفناها نهجنا لتبسيط مقايسة multiday شاقة إلى كفاءة "مزيج وقراءة" الفحص التي يمكن القيام بها في يوم واحد. المنهجيات وصفها هنا ودراسة حديثة من 1،280 المركبات في μopioid مستقبلات يسببها التوعية في 1،536 جيدا شكل 25 تشير إلى أن التوعية ويمكن الآن للاستجواب بسهولة باستخدام HTS. مقايسة الموصوفة هنا هي قابلة للاختبار جزيء صغير ويمكن تطبيقها على النهج الوراثية مثل سيرنا. وتركز شكل مقايسة لدينا على استجابة تكيفية المعروفة باسم مغاير لتوعية AC، إلا أن نهج وأساليب عامة يمكن تطبيقها على نطاق واسع مع غيرها من المقايسات خلية مقرها تتطلب عدة اضافات المخدرات وكاشف (مثل الحساسية والعصبية). ويتم إنجاز العمل ذكرت هنا بسهولة داخل الأوساط الأكاديمية باستخدام ماصات متعددة القنوات ومتعددة قارئ لوحة وضع قادر على قراءة نقطة النهاية المرجوة في شكل 384 جيدا.
الجدول 1. نماذج الخلوية التي يسببها لاختبار ناهض التوعية.
| مستقبلات | AC شكل الإسوي | خط الخلية | التوعية إشارة |
| D 2L الدوبامين | الذاتية (AC6 وAC7 27) | CHO-D 2L | 2-3 أضعاف |
| D 2L الدوبامين | AC2 المؤتلف، AC5، وAC6 | كلوة الجنين البشري 293 ستابلي | AC2 = 2-3 أضعاف AC5 = 50 أضعاف AC6 = 15 أضعاف |
| μ الأفيونية | AC1 المؤتلف، AC2، وAC5 | كلوة الجنين البشري 293 ستابلي | AC1 = 6-7 أضعاف AC2 = 2-3 أضعاف AC5 = 10-15 أضعاف |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أنوه السيد ريتشارد زنك وتود Wiernicki للتدريب والتوجيه المنهجي الفحص. نشكر أيضا يوحنا بولس سبنس لقراءة متأنية والاقتراحات التحرير. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة MH 060397، الدماغ والسلوك مؤسسة البحوث، وايلي ليللي وشركة من خلال برنامج جائزة بحوث ليللي (LRAP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384-well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase- and RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Nontargeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J.
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
