Summary
Adenilat siklaz sinyal duyarlanmasına inhibitör G protein-eşli reseptörler sonuçları Kalıcı aktivasyonu. Temel moleküler yolları belirlemek için, nonbiased yaklaşımlar gereklidir, ancak bu strateji ölçeklenebilir hücre bazlı cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, küçük molekül ve siRNA taranması için olan bir hassaslaşma deneyi tarif eder.
Abstract
Adenilil siklaza (AC) bir sinyal sensitization, madde bağımlılığı, Parkinson hastalığı dahil olmak üzere nöropsikiyatrik ve nörolojik bozukluklar, çeşitli implike edilmiştir. Gαi / o-bağlanmış reseptörlerin aktivasyonu akut AC aktivitesini inhibe eden, AC heterolog duyarlılaşma bu reseptörler sonuçların kalıcı aktivasyonu ve hücre içi cAMP seviyeleri ise. Önceki çalışmalar, AC yanıt bu artış da dahil olmak üzere, dopamin D 2 ve opioid reseptörleri μ Gαi / o-bağlanmış reseptörlerin çeşitli kronik aktivasyon aşağıdaki in vitro ve in vivo olarak görülmektedir olduğunu göstermiştir. AC heterolog hassaslaşması ilk dört yıl önce rapor edilmiş olmasına rağmen, bu olguyu altında yatan mekanizma (lar) büyük ölçüde bilinmemektedir. Mekanistik veri eksikliği muhtemelen nonbiased yaklaşımları belirlemek yardımcı olabilir düşündüren, bu adaptif tepki ile ilgili karmaşıklığı yansıtırAC heterolog sensitizasyon yer moleküler yolları ing. Önceki çalışmalar AC heterolog duyarlılığa düzenleyen bileşenleri örtüşen olarak kinaz ve Gbγ sinyalizasyon karıştırdılar. AC sensitizasyon ile ilişkilendirilmiş benzersiz ve ek örtüşen hedefleri belirlemek, ölçeklenebilir bir cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesi ve doğrulama daha fazla verim için gereklidir. Duyarlaşması Önceki yaklaşımlar sürekli hücre kültürü bakım yanı sıra birden fazla yıkama adımları içerir cAMP birikimini ölçmek için karmaşık bir metodoloji içeren genellikle zahmetlidir. Bu nedenle, 384 formatında yüksek verimli tarama (HTS) için kullanılabilir sağlam bir hücre bazlı tahlilin geliştirilmesi gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracaktır. İki D 2 dopamin reseptör hücre modelleri (yani. CHO-D 2L ve HEK-AC6 / D 2L) kullanarak, bir beş-s bizim 48-kuyu hassaslaşması deneyi (> 20 adım 4-5 gün) çevirdimTEP, 384 oyuklu formatta geçen gün deneyi. Bu yeni biçim küçük molekül taraması için uygun olduğunu ve bu deney tasarımı da hali hazırda siRNA hedef kütüphane tarama beklentisiyle siRNA ters transfeksiyonu için kullanılabileceğini göstermektedir.
Introduction
Heterolog-ya da süper-hassaslaşma olarak bilinen tepki sinyalizasyon adaptif bir adenilat siklaz (AC) ilk Nobel ödüllü Dr Marshall Nirenberg laboratuarında keşfedildi. Dr Nirenberg kronik δ opioid reseptör aktivasyonu sonra gözlenen yüksek AC yanıt opiat tolerans ve bağımlılık 1 'de yer alan bir mekanizma olduğunu önerdi. Kronik δ opioid reseptör aktivasyonunun yanı sıra, AC sinyalinin bu nöroadaptif yanıt da birçok Gαi / o-bağlı reseptörlerin 2 kalıcı aktivasyonu takiben oluşur. Özellikle, bu reseptörlerin çoğu ağrı, nöropsikiyatrik ve nörolojik bozukluklar ile bağlantılı ve μ / κ opioid, D 04/02 dopamin, 5HT 1A ve M 2/4 muskarinik reseptörleri 2 içerir. Dr Nirenberg bulgularına ek olarak, kanıt büyük bir gövde, hem kronik opioid reseptör aktivasyonuna AC sinyalizasyon duyarlılığa bağlama Varlığından
Bu çalışmalar önemli bir nörobiyolojik bir hedef olarak adenilil siklaz hassaslaşması mekanizmaları incelemek için gerekçe sağlar. Aynı şekilde, bireysel ac izoformlarıdır bu adaptif yanıt tutun 8 sinyal AC fizyolojik alaka ve önemi de 2,9,10 kabul edilmelidir. Araştırmamız bağlamında, AC rekombinant izoformlarının heterolog duyarlılık ile ilgili genel özellikleri bu özellikleri paralel desAC endojen izoformlar incelemek için cribed. Özel olarak, önceki araştırma Gαi / o proteinleri ve daha sonra serbest bırakma / yeniden düzenlenmesidir βγ alt birimlerinin aktivasyon her AC izoformlarının reseptör kaynaklı duyarlılık için önemli bir gereklilik olduğunu bulmuştur. Buna ek olarak, pek çok çalışma, protein kinazların ve Gβγ alt birimlerinin gelen sinyalleri sensitizasyon 2,11-13 dahil olduğunu göstermektedir. Bireysel Klimalar aynı zamanda benzersiz ve farklı hassaslaşması desenler 12. gösterilecek. Yakından ilgili AC3 2 duyarlı değildir oysa Örneğin, bunların agonistlere karşı D2 reseptörlerinin kalıcı maruz kalma, Ca2 + / kalmodulin stimülasyonu 14,15 için AC1 ve AC8 duyarlanmasına ile ilişkilidir. AC2, AC4 ve AC7 yakından Ancak, sadece PKC-uyarılmış AC2 aktivite sağlam 7,14,16,17 agonistlerinden için D 2 reseptörleri uzun süreli maruz kaldıktan sonra hassaslaştırılır ilişkilidir. Ayrıca, AC5 ve AC6 heter belirgin derecede göstermektedirologous D2 reseptörlerinin aktivasyonu 14,18-20 takip Gaz ve forskolin ile uyarılmış cAMP birikimi hassasiyeti, ancak Gβγ alt-birimi-AC'de şartlarına göre farklılık göstermedi 21 etkileşimler. AC Hassasiyet çalışmaların çoğu modeli hücre hatları (örneğin HEK293 hücreleri bireysel AC izoformlarını ifade) kullanılmış olmasına rağmen, bu bulgular yerli nöronal hücre modellerinin 4,22 çevirmek görünür. Daha yakın zamanda, AC izoformlarını eksprese eden HEK293 hücrelerinde tespit AC izoform seçici küçük molekül inhibitörlerinin etkileri de in vivo davranış çalışmalar 23 tercüme edilebilir.
Heterolog sensitizasyon için tanımlanmış bir moleküler mekanizmasının olmaması olası adaptif yanıt karmaşıklığını hem de AC 12 izoformları bireyin kendisine özgü düzenleyici özelliklerini yansıtmaktadır. Bu karmaşıklığı çözülüyor daha hantal metodoloji t kullanılmasıyla karmaşıkşapka tarafsız yaklaşımları kullanılarak akademik araştırmacılar sınırlıdır. Ve 48-çukurlu doku kültür biçimi 15 - Örneğin, önceki mekanistik çalışmalar 24 kullanılarak sürekli olarak kültürlenmiş hücre modellerinin kullanımını içeriyordu. Kültürlenmiş hücreler tipik olarak, 48 saat boyunca büyütüldü ve daha sonra hücre yıkama ve inkubasyon bir dizi (Şekil 1) takip agonist ilaç tedavisi (2-18 saat) tabi tutuldu. AC-izoform özel cAMP birikimi protokoller cAMP metodoloji 15,24 bağlayıcı bir zahmetli ve zaman alıcı bir [3H] cAMP kullanılarak birikiminin ölçülmesi ile takip kullanılan sonra idi. Her bir deney için baştan sona süresi genel olarak hücre kaplama veri analizi (Şekil 1) için 4-5 günlük bir toplam gerekmektedir. Yeni teknolojilerin ve otomasyon uygulaması, endüstriyel ve HTS merkezi bir ortamda sensitizasyon çalışmaları için belirgin geliştirmeleri yol açmıştır. Örneğin, kimyasal Ulusal Merkezi ile çalışan bir grupcal Genomics iki günlük bir 1536-çukurlu formatta 25 μ opioid reseptör kaynaklı duyarlılık küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için deney prosedürü HTS bildirdi.
Bu makale en çok akademik araştırma kurumları bulunmaktadır teknolojilerini kullanarak heterolog sensitizasyon çalışmaları için bir HTS test geliştirmek için çabalarımızı açıklanır. Bu strateji, heterolog ya da endojen Tek tek rekombinant adenilat siklaz izoform (CHO-B 2L ya da HEK-AC6 / D 2 L) ile kombinasyon halinde, dopamin D2 reseptörü ifade eden hücre modellerden dondurularak saklanmış hücrelerin kullanımı dahil edilmesi ile gerçekleştirildi. Bizim verimi artırmak için, biz aslında "mix ve okumak" olduğunu 384-kuyu biçiminde bir beş adım, tek bir gün tahlil için 48 iyi hassaslaşması tahlili (4-5 gün içinde yaklaşık> 20 adım) yeniden tasarlanmış. Yeni format cAMP acc ölçmek için piyasada bulunan bir homojen zaman çözüldü floresan (HTRF) deneyi kullanırBir çok modlu bir plaka okuyucusu ile sağlam hücrelerde umulation. Deney, sağlam ve küçük molekül tarama için uygun olan ve etkili bir şekilde heterolog sensitizasyon inhibitörlerinin taranması için uygulanabilir. Buna ek olarak, genel bir yaklaşım, sadece küçük bir değişiklik ile veya hedef genom geniş siRNA bir arşiv taraması için siRNA ters transfeksiyonu bu tahlilin kullanımı sağlar veri sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Deneyi Hazır Hücreleri Genişleme ve Kryoprezervasyon
- Kültür CHO-K1-DRD 2L 1.0 uM L-glutamin, 800 ug / ml G418, 300 ug / ml higromisin, 100 U / ml ile takviye edilmiş Ham F12 ortamı içinde, 15 cm 2 hücre kültürü tabağına (CHO-D 2L) hücreleri penisilin, 100 / ml streptomisin ug ve% 10 fetal sığır serumu (FBS).
- Hücreler% 90-95 konfluent olana kadar% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de inkübe hücreleri. 10 | il fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca hücre ayrışma tampon 3 ul ekleyerek hücreleri hasat Kültür ortamı 12 ul kullanarak hücrelerin tekrar süspansiyon ve tripan mavisi dışlama kullanarak hücreleri saymak.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 xg'de hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatan aspire ve dondurucu ortam içinde 5 ul (% 10 dimetil sülfoksit,% 90 F hücre pelletiniBS). Istenilen hücre konsantrasyonu (örneğin, 1-20 x 10 6 hücre / ml) elde etmek için hücre süspansiyonu seyreltin.
- Her bir dondurarak saklama viali hücre çözeltisi alikosu 1.0 ul. -80 ° C sıcaklıkta gece boyunca bir hücre dondurma kapta cryovials inkübe edin. Uzun süreli depolama için bir sıvı N 2 tankına cryovials aktarın.
2. Deneyi Hazır Hücreleri (ve Ters Transfection Seçeneği) Kaplama
- Hızla 37 ° C su banyosu içinde hücreleri donmuş cryovial eritin. Hücreler çözündürüldü sonra, Opti-MEM 9 ul ihtiva eden bir 15 ul konik tüp hücreleri transferi ve boru 3-5x ters çevirerek karıştırın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri santrifüjleyin. Süpernatan aspire ve 1 ul Opti-MEM içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- Hücre canlılığı belirlenmesi ve gerekirse (örneğin,. 3 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon) 'de canlı hücreler seyreltilmesi için mavi Tripan çıkışı ile hücre sayımıOpti-MEM. Plaka, bir doku kültürü hücre 10 ul / oyuk, çok kanallı pipet kullanarak 384-plaka işlemden geçirildi.
- (Önerileri üretmektedir göre - Bölüm 7) hücreleri tarafından cAMP üretimi tahmin etmek için bir standart eğri oluşturmak için Opti-MEM içinde cAMP seri seyreltmeleri yapın. Plakaya 10 ul / çukur cAMP standartların ekleyin Not:. Tek bir standart eğri, deney plakalarının birinde ayrı bir levha ya da boş bir kuyu üzerinde hazırlanabilir.
- Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 100 x g'de santrifüj plaka ve 1 saat boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
3. * SiRNA Transfection Seçeneği ters
Bu bölümde Şekil 3'e isteğe ve alakalı.
- RNase içermeyen GKD 2 O (örneğin, 0.4 pmol / ul) siRNA içinde bir çözeltisi hazırlandı. 384 oyuklu plakanın her bir gözeneğine 5 ul ekleyin ve 15 se boyunca 100 xg'de plaka santrifüjOda sıcaklığında, c.
- (Örneğin, Opti-MEM 1000 ul Lipofektamin 2000 6 ul ekle) ve aşağı ve yukarı pipetlenerek karıştırın 0,006 bir faktör ile Opti-MEM içinde Lipofectamine 2000 seyreltin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Lipofectamine 2000/Opti-MEM çözelti inkübe edin. Zaten siRNA içeren 384 oyuklu plakanın her bir gözeneğine seyreltilmiş 2000/Opti-MEM Lipofectamine çözeltisi 5 ul ekle. Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 100 xg'de plaka santrifüj.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
- (Bölüm 2), yukarıda tarif edildiği gibi plaka deney hazır hücreleri. Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 100 xg'de plaka santrifüj.
- (Tartışmaya bakınız) yıkmak hedef geni için tespit edildiği üzere 48-96 saat boyunca 37 ° C'de (% 5 CO2) de nemlendirilmiş inkübatör deney plakası geri dönün.
4. Küçük Molekül Eleme
- Opti ilgi konusu ilaç (örneğin,. Küçük molekül inhibitörleri) seyreltin-MEM arzu edilen nihai konsantrasyonları 6x. Seri seyrelmeler el pipet veya bir sıvı taşıma istasyonu kullanılarak tamamlanabilir.
- Test bileşiği 2.5 ml / kuyu ekleme veya bir çok kanallı pipet kullanarak kuyu tarafına araç (örneğin, DMSO) ihtiva eden tampon eklendi.
- Oda sıcaklığında (kuluçka isteğe bağlı) 15 saniye boyunca 100 xg'de plaka santrifüj.
5. Kalıcı Agonist tedavi
- 600 nM Opti-MEM içinde quinpirole solüsyonu (100 nM arasında, yani. 6 kez arzu edilen nihai konsantrasyonu) hazırlanır.
- 2.5 ul / oyuk bir çok kanallı pipet kullanarak kuyu tarafına 600 nM quinpirole solüsyonu ekleyin.
- Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 100 x g'de santrifüj plaka ve 2 saat boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
6. CAMP Birikiminin uyarılması
- 2 saat inkübasyon sırasında, uyanm hazırlamakOpti-MEM içinde çözelti on. Stimülasyon çözelti, 40 uM forskolin, oluşan 2 uM 3-izobutil-1-methyxanthine (IBMX), ve 4 uM spiperon (aşama 6 Tüm konsantrasyonları, arzu edilen nihai konsantrasyon 4x edilmiştir.)
- 5 ul / oyuk bir çok kanallı pipet kullanarak kuyuların tarafına uyarım solüsyonu ekleyin.
- Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 100 x g'de santrifüj plaka ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
7. CAMP Birikim söndürülmesi ve Tahmini
- Hücreler tarafından cAMP üretimi, üreticinin talimatlarına uygun olarak cAMP dinamik 2 kiti kullanılarak ölçülmüştür. Kısaca, damıtılmış su içinde bir anti-cAMP-kriptat ve cAMP-D2 sulandırın. Kısa süreli depolama için -20 ° C'de alikotları dondurun.
- Çalışma çözümler yapmak için, üreticinin talimatlarına uygun olarak liziz tamponunda anti-cAMP-kriptat bir kısım ve ayrı olarak cAMP-D2'nin bir kısım seyreltin.
- Add, anti-cAMP-kriptat çalışma çözeltisi ve 10 ul / oyuk, çok kanallı bir pipet kullanarak 384-iyi levhaya cAMP-d2 çalışma çözeltisi içinde 10 ul / gözenek.
- Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 100 x g'de santrifüj plaka ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
- 337 nm'lik bir uyarma kullanan bir floresan plaka okuyucu (hassasiyet için otomatik ölçekli ayar) plakayı okuyun ve başına 620 nm ve 665 nm'de emisyon ölçümü talimatları üretmektedir.
- Başına değerlendirmek rasyometrik analiz uygulamak cAMP standart eğri talimatları üretmektedir. Elde edilen değerleri kullanarak, veri analiz yazılımı kullanılarak test oyuklarındaki tahmini cAMP birikimini tahmin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir ticari olarak temin edilebilen hücre modeli kullanılarak küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için bir 384 heterolog sensitizasyon tahlili Geliştirme Bölümü I..
Bir hücre modelinde heterolog hassasiyete incelemek için, bir "mix ve okumak" biçime tahlil düzene bize etkin bir dizi iyileştirme yapılmış. Önemli modifikasyonlar pek çok aşağıda belirtilmiştir, ve tartışmaya daha ayrıntılı olarak tarif edilmektedir. İlk önemli bir adım Kriyoprezerve hücrelere 26 sürekli kültüre hücrelerden bizim hücre kültürü değiştirerek edildi. Biz şimdi rutin olarak 1-20 x 10 6 hücre / ml arasındaki konsantrasyonlarda hücre kültürü toplu dondurularak edilebilir. Her bir ilgili tahlil için, hücre hisse senetleri, çözülmüş seyreltildi sayılır ve sonra da 384-kuyucuklu plakalar içinde doğrudan plakalanır. Bir kültür periyodu ihtiyacını ortadan kaldırmak ve tahlilin kolaylık arttırır. Önceki sensitizasyon deneyi formatı 48 oyuklu Tiss kullanılanue kültür plakaları ve yıkama, tortusundan ayırma, transfer adımlar (Şekil 1), bir filtrasyon bağlanma tahlili tabanlı bir [3H] cAMP, bir dizi dahil. Böylece, sensitizasyon için bu format yüksek hacimli uygulamalar için uygun değildi. Bu nedenle, bir 96-kuyu ve yüksek miktarda madde taraması için iyileştirilebilir daha sonra bir 384-gözlü formata Birinci tahlil kolaylaştırmak için önemli çabalar sarf etmiştir. Yıkama adımları ve kültür / deney plakaları çok tip değerlendirme optimizasyonu ilgili ortadan kaldırılması, farklı hücre yoğunlukları ve farklı inkübasyon süreleri. Biz de cAMP tespiti için çeşitli yöntemler araştırdı ve mevcut protokolde kullanılan iyi karakterize HTRF cAMP teknolojisi yüksek, tekrarlanabilir, güvenilir ve son derece kararlı olduğunu öğrendim. Bu deney, bir platform kit ile sağlanan hücreler tarafından üretilir ve cAMP (yani. CAMP-d2) etiketli cAMP ile immunocompetition dayanmaktadır. Biz şimdi başarıyla heterolog Sensit için protokolleri geliştirilmiş ve uygulamışesas olarak 384 oyuklu formatta-laşma (sağ panel Şekil 1) "karıştır ve okumak".
Endojen AC6 ifade ve AC7 27 ki: Bizim ilk hedefi piyasada mevcut CHO-D 2L hücreleri (NM_000795 insan DRD 2L, erişim numarası) kullanarak yüksek verim D 2L reseptör hassaslaşması deneyi oluşturmak oldu. Kriyoprezervasyon CHO-D 2L hücreleri bir 384-kuyucuklu bir doku kültürü plakasında 3,000 hücre / kaplandı ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 1 saat süre ile dengelenmiştir. Plakalar inkübatör ve oda sıcaklığında ilave edildi quinpirole D 2 agonistinin artan konsantrasyonlarının çıkarıldı. Hücreler daha sonra bir nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 2 saat inkübe edildi. Siklik AMP birikimi, ardından 10 uM forskolin (AC doğrudan bir aktivatör) ilavesi ile başlatıldı. CAMP birikimi tampon, bir fosfodiesteraz inhibitörü, izobutilmetilksantin (IBMX içerdiği), CAMP birikimi dönemde kalan D2 reseptör aktivasyonunu önlemek için, hem de D 2 antagonist, spiperon (1 uM, D, 2L = 0.07 nM) için K i,. Hücreler, 1 saat oda sıcaklığında inkübe edildi. Tahlil HTRF cAMP reaktifleri ihtiva eden bir liziz tamponu ilave edilerek sona erdirildi. Çalışmalar quinpirole ile 2 saat ön-muamele heterolog duyarlılık (Şekil 2A) ile uyumlu bir, doza bağımlı bir şekilde daha sonra, forskolin ile uyarılmış cAMP birikimi gelişmiş olduğunu ortaya koydu. Bu deneyin sonuçları, sensitizasyon deneyleri, 384 oyuklu bir formatta gerçekleştirilebilir göstermektedir. Yeni tahlil format yapmadan yıkama veya decant adımlar için gerek bir "mix ve okumak" tahlil (Şekil 1) olmadan fazla 20-4 adımlardan adım sayısını azalttı.
Deneylerin ikinci serisi, bu yeni aerodinamik tahlil bir yararlanılabilir olmadığını araştırdıCHO-D 2L modelinde sensitizasyon ssess inhibitörleri. Kriyoprezervasyon CHO-D 2 L hücre / oyuk Opti-MEM içinde 3000 hücre yoğunluğunda, bir 384 gözlü doku kültür plakasına kaplanmıştır. Bilinen D 2 antagonistleri, D2 reseptör kaynaklı hassasiyet engellemek için ilave edildi. 100 nM quinpirole (nihai konsantrasyon) ihtiva eden Opti-MEM daha sonra 15 ul'lik toplam bir hacimde ilave edildi ve hücreler, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 2 saat inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, cAMP birikimi forskolin (10 uM son konsantrasyon) eklenmesi ile başlatıldı ve deney sona erdirilir ve cAMP HTRF kullanılarak ölçülmüştür. Ilk sonuçlar spiperon veya haloperidol (prototipik D 2 antagonistleri) forskolin tamamen engellenir quinpirole neden hassaslaşma ile ön-muamele cAMP birikimi (Şekil 2B) uyardığını ortaya çıkarmıştır. Bu sonuçlar, bu yaklaşım, küçük tespit etmek için kullanılabilir bu doğrulama sağlamakD 2 reseptör kaynaklı hassaslaştırıcı molekül inhibitörleri. İkinci bir deneyde, bu bileşikler, hassasiyet inhibe olup olmadığını test etmek için D 2 antagonistleri, bir dizi gücünü değerlendirmek için bu yöntem kullanılabilir. Bir önceki sonuçlara benzer şekilde, bu çalışmalar, D 2 antagonistleri, doza bağlı bir şekilde (Şekil 2C) olarak, agonist kökenli hassasiyet inhibe ettiğini gösterdi. Sensitizasyon engellenmesi için potens sıralaması sırası D 2 reseptör antagonistleri ve D 2 reseptörleri 28 de onların daha önce açıklandığı farmakoloji gibi kendi eylemleri ile uyumlu idi.
Part II. Tarama çalışmalarında siRNA ters transfeksiyonu için 384 oyuklu tahlil sensitizasyon uygulanması.
Bir sonraki hedefi ölçeklenebilir ters transfeksiyon siRNA kütüphane tarama yapmak için kullanılabilecek bir 384-duyarlılaşma tahlili geliştirmekti. Ön çalışmalar vardıve AC6 (sıçan ADCY6, katılım sayısı: NC_005120) (yani HEK-AC6 / D 2L hücreler): heterologously D 2L dopamin reseptörleri (NM_012547 sıçan DRD 2L, katılım sayısı) hem de ifade eden HEK hücre modeli kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İlk deneyler, hücre hattı içinde AC Agonistin neden olduğu hassasiyet gösterme yeteneği değerlendirildi. Kısaca, soğukta saklanan AC6 / D 2L hücreler 384 delikli doku kültür plakasında (1,000 hücre / kuyu) ekildi. 1 uM quinpirole (nihai konsantrasyon) ihtiva eden Opti-MEM 15 ul bir toplam hacme ilave edildi ve hücreler, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 2 saat inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, cAMP birikimi forskolin artan konsantrasyonlarının ilave edilmesi ile başlatıldı. Tahlil HTRF reaktif maddeleri ihtiva eden liziz tamponu ilave edilerek sona erdirildi. Sonuçlar, 2 saat için agonist quinpirole hücrelerin maruz forskolinle uyarılmış kamının belirgin bir donanıma yol açtığı ortaya çıkarılmışP birikimi (Şekil 3A). 100 nM ve 300 nM'de forskolin hem de cAMP'nin artan birikim, araçla tedavi edilen hücreler (Şekil 3A) ile karşılaştırıldığında daha fazla 15 kat idi.
Sonra, siRNA çeşitli ters transfeksiyon koşulların değerlendirilmesi dahil optimizasyon çalışmalarına rehberlik 29,30 metodolojileri (örneğin vb transfeksiyon reaktifler, transfeksiyon verimliliği, hücre yoğunluğu, kuluçka süresi,.) Yayınlandı kullandı. Ön çalışmalar, en iyi transfeksiyon ters koşulların belirlenmesi Lipofectamine 2000 ile kombinasyon halinde siGloRed, transfeksiyondan bir göstergesi, el. Deneyler, 0.03 ul Lipofektamin 2000/5 ul Opti-MEM ile birlikte 2-4 siRNA pmol / ul 5 H 2 O (veriler gösterilmemiştir) HEK hücrelerine herhangi bir bariz bir toksisite olmadan 72 saatte bir yaklaşık% 95 transfeksiyon verimi temin olduğunu göstermiştir. Biz sonra heterolog duyarlanmasına Gαs siRNA'nın etkisini inceledikof forskolin AC6 / D 2L hücrelerinde cAMP birikimini artırmıştır. Gαs birçok AC izoformlannın (yani AC1, AC2, AC5 ve AC6) 19-21 heterolog hassaslaşma önemli bir bileşeni olarak tespit edilmiştir, çünkü gaz siRNA potansiyel bir pozitif kontrol olarak önerilmiştir. Ayrıca, AC6 / D 2L hücre modeli (Şekil 3A) 'de 15 kat sensitizasyon sinyali geri transfeksiyon etkinliğini değerlendirmek için gürültü pencerede güçlü bir sinyal verir. Yukarıda tarif edilen koşullar kullanılarak, bir pozitif kontrol olarak Gαs siRNA değerlendirilmesi ön çalışmalar tamamlanmış ve sonuçlarımız duyarlılık (veriler gösterilmemiştir) sağlam bir blokajı (>% 90) göstermiştir.
Sensitizasyon sinyal dramatik siRNA ile uyarılan azalma, siRNA tarama işlemi için uygun bir pozitif kontrol sağlamaktadır. AC heterolog sensitizasyon siRNA taranması için daha nicel bir değerlendirme elde etmek için, biz hangi verileri eldeBir Z 'faktörü AC6 / D 2L hücreleri 31 kullanılarak test koşulları bir dizi için hesaplanmıştır. Bu deney için, 0.03 ul Lipofektamin 2000/5 ul Opti-MEM içinde göz başına 384 oyuklu plakanın (toplam hacim 10 ul) ile 5 ul, 2 pmol Gαs siRNA veya siRNA hedef dışı kontrol birleştirildi. Kriyoprezervasyon hücreler çözülmüş Opti-MEM içinde yeniden süspansiyona alınmış ve daha sonra birkaç hücre yoğunlukları ile siRNA / Lipofectamine karışımını içeren tek tek oyuklara ilave edildi (yani. 500-5,000 cells/10 ul / kuyucuk). Quinpirole tedavisi (2 hr karşı 18 saat) yanı sıra, forskolin nihai konsantrasyon (100-300 nM) süresi aynı zamanda AC6 / D 2L sensitizasyon deney araştırılmıştır. 750 hücre / oyuk, 72 saatlik bir transfeksiyon süresi, 2 saat quinpirole tedavisi ve cAMP birikimi (Şekil 3B) teşvik etmek için 300 nM forskolin:. Bu deneylerin sonuçları, güçlü bir Z 'faktörü, aşağıdaki koşullarda elde edildiğini ortaya çıkarmıştır Bu işbirliği altındaşulları biz Gαs siRNA mevcudiyetinde% 94 azaltılmıştır bir 15 kat sensitizasyon tepki elde edildi (vs Gαs siRNA için 0.6 'Z'. siRNA kontrol).
Şekil 1. Geleneksel biçimde, hücreler, 48-gözlü formatta kaplanmıştır ve 48 saat boyunca akmak üzere yetiştirilmektedirler. Büyüme ortamı, boşaltıldı, küçük molekül inhibitörleri, bu sırada D 2 agonisti eklenmesi takip eder. 2 saat kuluçkadan sonra tahlil ortamı süzülmüş ve hücreler, yıkama / tortusundan bir dizi adım tabi tutulur. Daha sonra, AC uyarılır ve hücreler lize edilir. Siklik AMP birikimi daha sonra bir süzme aşaması ve sintilasyon sayma gerektiren 2 gün deneyidir [3H] cAMP bağlama deneyi kullanılarak değerlendirilir. Da 96 delikli biçim giderilmiştir:yıkama ve decant adımların çok oluşturulacağı, biz bu format HTS veya otomasyon kolayca müsait değildi bulundu. HTS formatı 384 oyuklu plakalara plakalanır doğrudan dondurularak saklanan hücreler kullanır. Bu Kriyoprezerve hücreler 1 saat dengeyi takiben "hazır tahlil" vardır. Bu ilk bir enkübasyon süresinden sonra, küçük molekül inhibitörleri, 2 saat boyunca inkübasyon için D 2 agonistin ilave edildikten sonra ilave edilebilir. AC uyarılır ve hücreler, deney plakasındaki HTRF saptama reaktif maddeler kullanılarak lize edilmiştir.
Şekil 2,. Kriyoprezervasyon CHO-D 2L hücreler 3000 hücre / kuyu 384 gözenekli analiz plakalarının doğrudan kaplama ve 1 saat. A. için dengelenmiş) D 2 agonisti quinpir artan konsantrasyonlarole ilave edildi ve hücreler, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 2 saat inkübe edildi. Siklik AMP birikimi, oda sıcaklığında 1 saat boyunca spiperon ve IBMX 'in mevcudiyeti içinde 10 uM forskolin (nihai konsantrasyon) ile uyarıldı. Reaksiyon HTRF cAMP tahlili tepkin maddeleri (n = 1 olduğunda en azından 3 deney için temsili) ile söndürüldü. Veriler araç ile muamele edilmiş hücrelerin bir yüzde tepki olarak ifade edilmiştir. B.) CHO-D 2L hücrelerinin yokluğunda (kontrol) ya da gösterilen D 2 reseptör antagonistleri (örneğin, spiperon veya haloperidol) varlığında önceden muamele edilmiştir. Quinpirole (100 nM) ilave edildi ve hücreler, hassasiyet uyarılması için 2 saat süre ile inkübe edildi. AC, oda sıcaklığında 1 saat boyunca 10 uM forskolin (nihai konsantrasyon) ile uyarıldı. Siklik AMP HTRF kullanılarak belirlendi. Veriler =. C) CHO-D 2L hücrelerinin yokluğunda (kontrol olarak muamele edilmiş olan bir araç ile muamele edilmiş hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilmiştir tepki% 100) ya da belirtilen D 2 reseptör antagonistleri artan konsantrasyonun varlığı. Quinpirole (100 nM) ilave edildi ve hücreler, hassasiyet uyarılması için 2 saat süre ile inkübe edildi. AC, oda sıcaklığında 1 saat boyunca 10 uM forskolin (nihai konsantrasyon) ile uyarıldı. Siklik AMP HTRF kullanılarak belirlendi. Veri quinpirole kaynaklı sensitizasyon yanıtın bir yüzdesi olarak ifade edilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. Kriyoprezervasyon HEK-AC6 / D 2L hücreler 1000 hücre / göz kaplanmıştır ve 1 saat süre ile dengelenmiştir. A.) Hücreler, bir araç ya da bir nemlendirilmiş inkübatörde 2 saat için 100 nM quinpirole ile inkübe edildi. AC waOda sıcaklığında 1 saat boyunca forskolin artan konsantrasyonları ile uyarılmıştır var. Siklik AMP AC6 / D 2L hücrelerinde Gαs siRNA blok hassaslaştırıcı HTRF. B.) Arka transfeksiyon kullanılarak belirlendi. Gαs siRNA veya nontargeting siRNA kontrol (2 pmol) 10 ul bir toplam hacim içinde 0.03 ul Lipofectamine2000 (Lipo) ile kombine edilmiş ve çözelti bir 384-oyuklu bir plaka içerisinde tek tek oyuklara ilave edildi. Kriyoprezervasyon AC6 / D 2L hücreler daha sonra ters transfeksiyonu için ilave edildi ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 70 saat boyunca inkübe edildi. D 2 reseptör agonisti, quinpirole (1 uM nihai) ya da araç 2 saat inkübasyona bırakıldı ve ardından ilave edildi. Siklik AMP birikim 1 saat için 300 nM forskolın (son konsantrasyon) ile uyarılır ve HTRF kullanılarak ölçüldü. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heterolog sensitizasyon çalışmalarını kolaylaştırmak için bir çaba, biz kapsamlı bizim önceki yöntem bir aerodinamik elde değiştirdiniz "mix ve okumak" yüksek verimli tarama ve eylem inceleme mekanizmasına iyileştirilebilir biçimi. Şu şekildedir protokolüne büyük değişiklikler özetlenebilir: 1) "deneyi hazır" reaktifler olarak dondurularak saklanmış hücrelerin kullanımı, 384-gözlü biçime deneyi 2) minyatürleştirme ve HTRF ölçüm 3) kullanımı cAMP.
Bizim hücre tabanlı deneyleri için Kriyoprezervasyonun benimsenmesi büyük gün deney ve tarama çalışmalarında bizim gün için verimlilik ve tekrarlanabilirlik geliştirdi. Bu yaklaşım, bir endüstri standardı olan ve kolayca 26 ayar akademik araştırma tercüme edilebilir. Hücre kültürü verimliliğini artırmak için, hücre şişeler, çözülmüş seyreltildi ve ardından 384 kuyucuklu plakalar fo doğrudan kaplama olduğu hücre stok "raf reaktifler off" olarak kullanılırr, her bir deney. Daha önce omurgasız G protein birleştirilmiş alıcıların 32,33 antagonistlerini tespit etmeyi amaçlayan çalışmalarda dondurularak saklanan hücreler dahil edildi. Bu metodoloji ilk iş laboratuvarda yapılır ve zorluklar sundu ve büyük olasılıkla değişkenlik tanıttı kampüste kültür hücreleri taşınması zorunlu değildi de avantajlı oldu. Yeni bir yaklaşım kullanılarak, dondurulmuş hücreler, hemen hemen önce tahlilin başlamasından çözülmüş ve sahada seyreltilebilir. Yeniden üretilebilirliğinin geliştirilmesi ek olarak, dondurarak saklama da deney çalıştırılmasına hücre kaplama arasındaki 48 saat süre (Şekil 1) ortadan kaldırılmıştır. Biz başarıyla cAMP birikimi ve β-arrestin işe (Brust, TF, Ejendal, KFK, ve Watts, VJ yayınlanmamış gözlemler) dahil fonksiyonel okumalarla rekombinant reseptörler ve komisyonlarda, alt tiplerinin çeşitli kullanarak kararlı ve geçici transfeksiyon çalışmalarda kriyokoruma yaklaşım uyguladık . DesBugüne kadar bizim olumlu deneyimler PITE araştırmacılar, reseptör veya hedef ve model hücre sistemi önceden herhangi bir büyük ölçekli çalışmaların başlatılması için dondurarak saklama ile uyumlu olduğunu doğrulamak gerekir.
Tortusundan ve hassaslaşması tahlil dahil eleme düzene ve (Şekil 1) adımlarını yıkamak için çabalarımız için önemli bir ikinci değişiklik. Bu değişiklikler, 96 oyuklu bir formatta (Conley ve Watt, yayınlanmamış gözlemler) için, tahlilin, bizim minyatürleştirme ile eşzamanlı idi. Özellikle, modifiye edilmiş sensitizasyon protokolü (orta panel Şekil 1 e bakınız) cAMP birikimi bir yıkama ya da kaptan kaba aktarılır adımları yokluğunda D agonist 2, inkübasyonu takiben deney tamponu içinde forskolin doğrudan ilave edilmesi ile başlatıldı burada tasarlanmıştır. Buna ek olarak, cAMP birikimi tampon spiperon nispeten yüksek bir konsantrasyon (1 uM), D 2 için 0.07 nM'lik bir Ki değerine sahip olan bir D 2 antagonisti ihtiva15 reseptörleri. Bu sayede 100 forskolın sırasında agonistleri tarafından rezidüel D 2 reseptör aktivasyonu (örn. quinpirole) engelleyen, cAMP birikimi aşamasında tam D 2 reseptör işgali Spiperon sonuçlarının aşırı konsantrasyon kat AC adım 15 uyarılır. Bu değişiklik ilk agonist inkübasyon aşağıdaki üç aktarmak ve üç yıkama adımları ortadan kaldırmıştır. 96 göz formatındaki gelişmenin bir parçası olarak, aynı zamanda su verme öncesinde ve hücreler lize nihai decant adımı ortadan kaldırmak mümkün. 3-9 'den% ve cAMP birikimi tampon doğrudan reaktif eklenmesi; (TCA. Örneğin trikloroasetik asit) Bu modifikasyon eden lize reaktifin konsantrasyonunun arttırılması ile gerçekleştirildi. Değiştirilmiş 96 çukurlu sensitizasyon deneyinin ümit verici sonuçlar, 384-gözlü formata sensitizasyon tahlilinin dönüştürülmesi için destek sağlamıştır. Ne yazık ki, cAMP'yi miktarının belirlenmesi için önceki metodoloji zahmetli bir filtratio oldun-tabanlı [3H] cAMP protein bağlama tahlili (> 5 adım). Örneğin, tahlil, genellikle 15,24 sayma filtre kurutma ve sintilasyon izin vermek için, iki gün boyunca tamamlanır. Bu sakıncalar veren yüksek işleme kapasiteli 384 oyuklu formatta için kullanmak için pratik bağlama [3H] cAMP protein yapılmıştır.
Üçüncü önemli gelişme 384-biçimine yatkın bir şekilde cAMP'ı ölçme ve ölçülmesi için metodolojileri yansıtarak geldi. Örneğin, bir cAMP karşılık elemanı (CRE)-lusiferaz-tabanlı 384-çukurlu formatta 32,33 nispi cAMP ölçümleri için önemli bir raportör sistemi kullanılarak deneyimi. Bu yaklaşımın başarılı bir Gαs-bağlanmış reseptörlerin çoğu çalışmalar için laboratuar tarafından kullanılmış olmasına rağmen, CRE-luc muhabir tarama tahlilleri 34 sırasında yanlış pozitif ve negatif bir dizi tabidir. Bu uygulama ile Ayrıca, bizim ön D 2 sensitizasyon çalışmalarıhamamböceği biz lusiferaz sinyali (veri gösterilmemiştir) belirgin bir geri besleme inhibisyonunu gözlemlenen teşvik edici değildi. Bu nedenle, biz de onların "ilk" kullanarak stabil hücre hatları ve "ikinci" kuşak GloSensor vektörleri inşa ve karakterize tarafından GloSensor cAMP teknolojinin uygulanması bizim çabaları yoğunlaşmıştır. GloSensor lusiferaz proteini 35 içinde bir cAMP bağlama sitesi ihtiva eden bir mühendislik lusiferaz raportör olduğunu. Sistem kinetik cAMP ölçümü için çok faydalı olmasına rağmen, bu yöntem agonist kaynaklı hassasiyet (Conley ve Watt, yayınlanmamış gözlemler) ölçmek için etkili değildi. Biz de cAMP birikimini değerlendirmek için maliyet etkin bir aracı olarak çalışmaları için bir BRET tabanlı cAMP biyosensör 36 araştırdı. Ne yazık ki, geçici olarak transfekte edilmiş biosensör ilişkili arka plan gürültü eden sensitizasyon tahlil için bu yöntemi uyarlamak için yeteneği sınırlıdır. Son olarak, homojen bir zaman çözüldü Fluor kullanan birkaç kit değerlendirildi384 oyuklu formatta cAMP ölçmek için bir yaklaşım olarak çeşitli teda (HTRF). Bu kurulan metodoloji onlar, sağlam, duyarlı, kararlı, ve kullanımı kolay olduğu akademik laboratuarlar ve tarama olanakları ile en uyumlu olduğu bulunmuştur. Akademik araştırmacılar için en önemli dezavantajı, reaktiflerin maliyeti, reaktifler ve 384 gözlü formata minyatürleştirme, ancak toplu alım ELISA bazlı tahliller hem de önceki "kek" [3H] cAMP protein dahil olmak üzere diğer kitleri ile fiyatı daha fazla rekabetçi hale getirir deneyi 15 bağlama.
Örnek çalışma rekombinant hücre hatlarında AC sinyal D 2 dopamin reseptör kaynaklı duyarlılık araştırmalara 384 oyuklu tahlil sensitizasyon uygulanabilirliğini gösterir. Birçok ön çalışmalar olarak, D 2 dopamin reseptörü değerlendirmek amacıyla küçük değişiklikler ile bu deneyi kullandık ve (birden fazla AC izoformlarının opioid reseptör kaynaklı hassasiyete μTablo 1). Bu çalışmalar, birden fazla hücre hatları, reseptör alt tiplerinin ve AC izoformlarına 384 tahlilinin genel uygulanabilirliğe vurgulamaktadır. Benzer bir deney biçimlerini geliştirmekle ilgilenenler, hücre yoğunluğu, agonist tedavi öncesi zamanlarda, AC aktivasyon protokolleri / koşulları ve onların hücresel modelleri için HTRF cAMP algılama metodolojisi gibi değişkenleri keşfetmek için teşvik olacaktır. Bu tarifnamede sunulan veriler antagonist hassaslaştırıcı küçük molekül inhibitörleri belirlemek için, tahlilin yeteneğini göstermektedir. Güç değerleri (: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php bakınız) diğer işlevsel tahlillerde 28 hem de bağlanma tahlilleri kullanılarak elde radyoreseptör afinitesi (Ki) değerleri ile tespit ile tutarlıdır. Bu deney tasarımı kolaylıkla bileşikler pintool aracılığıyla teslim edilir veya tahlil hazır plakaları preplated olan HTS çabaları alabilecek. Açıklanan sensitizasyon tahlillerine ek olarak, burada uygulanan yöntemler diğer reklama geçerli olmalıdırBirden fazla ilaç / reaktif maddeler 384 oyuklu formatta önce bir uç noktası ölçmek için uygulanır aptive tahlilleri.
Biz tüm 384-iyi tahlil için önemli geliştirme adımlarını vurgulamak için çalıştı, ama aynı zamanda ters transfeksiyon siRNA tahlillerin gelişimi özellikle zor olduğunu unutmayın istiyorsunuz. Bu tahliller için uzun vadeli bir hedef AC izoformlarının heterolog sensitizasyon katılan örtüşen ve eşsiz genleri belirlemek için bir genom genişliğinde bir çaba yapmaktır. Bir kılavuz olarak ilk siRNA tahlili kullanarak, bir ters siRNA transfeksiyon deneyleri geliştirmek için aşağıdaki kısaltılmış öneri sunmaktadır: (1) bu tür siglo ve transfeksiyon reaktifi (. Örneğin, Lipofectamine 2000) gibi bir göstergenin oranları kullanılarak transfeksiyon etkinliğini incelemek, (2) optimum tohum yoğunluğu (örneğin, 500-5,000 hücre / çukur) belirlemek, (3) (örneğin 48-96 saat) Transfeksiyon süresini araştırmak ve (4) (örneğin uyuşturucu TR Uygun tahlil koşulları değerlendirmekOptimum sinyal (örneğin Z 'faktör analizi) ulaşmak için eatments, uç nokta önlemler ve sağlam kontroller). İlave ayrıntılar ve tarama çalışmalarında siRNA kullanımı için daha genel bir bilgi, daha önce başvurulan yöntem 29,30 makalelerinde bulunabilir. HTS çabaları ilgilenen araştırmacılar da otomasyon (örn.. Pintool ve robotik) kendi tahlillerin uyum keşfetmek gerekir. Buna ek olarak, tarama çalışmaları için, diğer faktörler veya denetimleri resmi tahlil doğrulama, hücre canlılığı deneyleri, ve uygun karşı ekranlar dahil. Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/: ek rehberlik için, ilgilenen okuyucu olarak NCATS aracılığıyla NCGC Testi Rehberlik Kılavuzu incelemek için teşvik olacaktır.
Biz verimli bir zahmetli multiday deneyi düzene "mix ve okumak" tek bir günde yapılabilir tahlil için bizim yaklaşım tarif var. Burada anlatılan metodolojiler ve1.536-kuyu formatında 25 μopioid reseptör kaynaklı duyarlılık 1.280 bileşiklerin yeni bir çalışma hassaslaşması artık kolayca HTS kullanarak sorguya olabilir düşündürmektedir. Burada tarif edilen deney, test Küçük molekül için uygun olan ve bu siRNA gibi genetik yaklaşımlar da uygulanabilir. Bununla birlikte, genel bir yaklaşım ve yöntemleri yaygın olarak çoklu ilaç ve reaktif ekleme (. Örneğin desensitizasyon ve nöro) gerektiren diğer hücre bazlı tahlillerde uygulanabilir, bizim deney formatı AC heterolog duyarlılık olarak da bilinir adaptif tepkisi üzerinde odaklanmıştır. Burada bildirilen işleri kolaylıkla çok kanallı pipet ve 384-çukurlu formatta, istenen son noktaya okuma yeteneğine sahip bir çok modlu plaka okuyucusu kullanılarak akademik bir ortamda içinde gerçekleştirilir.
Tablo 1. Hücresel modelleri agonist kaynaklı duyarlılık için test edilmiştir.
| Reseptör | AC İzoform | Hücre hattı | Sensitizasyonu işaret |
| D 2L dopamin | Endojen (AC6 ve AC7 27) | CHO-D 2L | 2-3 kat |
| D 2L dopamin | Rekombinant AC2, AC5 ve AC6 | Stabil olarak transfekte edilmiş HEK 293 | AC2 = 2-3 kat AC5 = 50 kat AC6 = 15 misli |
| μ opioid | Rekombinant AC1, AC2 ve AC5 | Stabil olarak transfekte edilmiş HEK 293 | AC1 = 6-7 misli AC2 = 2-3 kat AC5 = 10-15 kat |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar metodolojik eğitim ve tahlil rehberlik için Bay Richard Zink ve Todd Wiernicki kabul etmek istiyorum. Biz de dikkatli okuma ve editoryal önerileriniz için John Paul Spence teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık MH 060.397, Beyin ve Davranış Araştırma Vakfı, ve Eli Lilly Enstitüsü ve Lilly Araştırma Ödülü Programı (LRAP) ile Şirket tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384-well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase- and RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Nontargeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J.
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
