Summary
Adenylyl साइक्लेस संकेतन को संवेदनशील बनाने में निरोधात्मक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स के परिणाम की लगातार सक्रियण. आवश्यक आणविक रास्ते की पहचान करने के लिए, nonbiased दृष्टिकोण जरूरी हैं, लेकिन इस रणनीति एक स्केलेबल सेल आधारित शिविर संवेदीकरण परख के विकास की आवश्यकता है. इस के साथ साथ, हम छोटे अणु और siRNA स्क्रीनिंग के लिए एक संवेदीकरण परख का वर्णन.
Abstract
Adenylyl साइक्लेस (एसी) संकेतन को संवेदनशील मादक द्रव्यों के सेवन और पार्किंसंस रोग सहित neuropsychiatric और तंत्रिका संबंधी विकारों की एक किस्म में फंसाया गया है. Gαi / ओ से जुड़े रिसेप्टर्स की तीव्र सक्रियण एसी गतिविधि को रोकता है, एसी की heterologous संवेदीकरण में इन रिसेप्टर्स के परिणाम की लगातार सक्रियण और intracellular शिविर का स्तर बढ़ा है, जबकि. पिछले अध्ययनों एसी जवाबदेही की यह वृद्धि डी 2 डोपामाइन सहित और opioid रिसेप्टर्स μ Gαi / ओ से जुड़े रिसेप्टर्स के कई प्रकार के जीर्ण सक्रियण के बाद इन विट्रो और इन विवो दोनों में मनाया जाता है कि प्रदर्शन किया है. एसी की heterologous संवेदीकरण पहले चार दशक पहले सूचना मिली थी हालांकि, इस घटना आबाद कि तंत्र (ओं) काफी हद तक अनजान रहते हैं. यंत्रवत डेटा की कमी संभवतः nonbiased दृष्टिकोण की पहचान में सहायता कर सकते हैं, सुझाव है कि इस अनुकूली प्रतिक्रिया के साथ शामिल जटिलता को दर्शाता हैएसी की heterologous संवेदीकरण में शामिल आणविक मार्ग आईएनजी. पिछले अध्ययनों से एसी की heterologous संवेदीकरण विनियमित घटक है कि अतिव्यापी रूप kinase और Gbγ संकेतन उलझा दिया है. एसी को संवेदनशील बनाने के साथ जुड़े अद्वितीय और अतिरिक्त ओवरलैपिंग लक्ष्यों की पहचान करने के लिए, एक स्केलेबल शिविर संवेदीकरण परख के विकास और सत्यापन अधिक से अधिक प्रवाह के लिए आवश्यक है. संवेदीकरण अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण पिछले निरंतर सेल संस्कृति रखरखाव के साथ ही कई धोने कदम शामिल है कि शिविर संचय को मापने के लिए एक जटिल कार्यप्रणाली से जुड़े आम तौर पर बोझिल हैं. इस प्रकार, एक 384 भी प्रारूप में उच्च throughput स्क्रीनिंग (HTS) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक मजबूत सेल आधारित परख के विकास के भविष्य के अध्ययन की सुविधा होगी. दो डी 2 dopamine रिसेप्टर सेलुलर मॉडल (यानी. चो डी 2L और HEK-AC6 / डी 2L) का उपयोग करना, हम एक पांच एस के लिए हमारे 48-अच्छी तरह से संवेदीकरण परख (> 20 कदम 4-5 दिन) बदल दिया हैTEP, 384 अच्छी तरह प्रारूप में एक दिन परख. इस नए स्वरूप छोटे अणु स्क्रीनिंग करने के लिए उत्तरदायी है, और हम इस परख डिजाइन भी आसानी से लक्षित siRNA पुस्तकालय स्क्रीनिंग की प्रत्याशा में siRNA के रिवर्स अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है.
Introduction
Heterologous या सुपर संवेदीकरण के रूप में जाना जाता प्रतिक्रिया संकेत एक अनुकूली adenylyl साइक्लेस (एसी) प्रथम नोबेल पुरस्कार विजेता, डॉ. मार्शल Nirenberg की प्रयोगशाला में खोज की थी. डा. Nirenberg पुरानी δ opioid रिसेप्टर सक्रियण के बाद मनाया वृद्धि हुई एसी जवाबदेही नशा सहिष्णुता और निर्भरता 1 में शामिल एक तंत्र था कि प्रस्तावित. पुरानी δ opioid रिसेप्टर सक्रियण के अलावा, एसी संकेतन के इस neuroadaptive प्रतिक्रिया भी कई अन्य Gαi / ओ युग्मित रिसेप्टर्स 2 की लगातार सक्रियण के बाद होता है. विशेष रूप से, इन रिसेप्टर्स की कई दर्द, neuropsychiatric और मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के साथ जुड़े थे, और μ / κ opioid, डी 2/4 डोपामाइन, 5HT 1 ए, और एम 2/4 मुस्कारिनिक रिसेप्टर्स 2 शामिल हैं. डा. Nirenberg के निष्कर्षों के अलावा, सबूत के एक बड़े शरीर दोनों पुरानी opioid रिसेप्टर सक्रियण के लिए एसी संकेत के संवेदीकरण जोड़ने मौजूद
ये अध्ययन एक महत्वपूर्ण neurobiological लक्ष्य के रूप में adenylyl साइक्लेस को संवेदनशील बनाने के लिए तंत्र की जांच के लिए औचित्य प्रदान करते हैं. इसी तरह, व्यक्तिगत एसी isoforms इस अनुकूली प्रतिक्रिया में पकड़ कि 8 संकेत एसी की शारीरिक प्रासंगिकता और महत्व भी 2,9,10 मान्यता दी जानी चाहिए. हमारे शोध के संदर्भ में, एसी की पुनः संयोजक isoforms की heterologous संवेदीकरण के साथ जुड़े सामान्य सुविधाओं उन विशेषताओं समानांतर देसएसी की अंतर्जात isoforms के अध्ययन के लिए cribed. विशेष रूप से, पिछले अनुसंधान Gαi / ओ प्रोटीन और बाद में रिहाई / विपर्यय βγ सब यूनिटों की सक्रियता सभी एसी isoforms की रिसेप्टर प्रेरित संवेदनशील बनाने के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकताओं हैं कि मिल गया है. साथ ही, कई अध्ययनों प्रोटीन kinases और Gβγ सब यूनिटों से संकेत संवेदीकरण 2,11-13 में शामिल हैं जो सुझाव है. व्यक्तिगत एसी भी अद्वितीय और विशिष्ट संवेदीकरण पैटर्न 12 प्रदर्शित करते हैं. बारीकी से संबंधित AC3 2 अवगत नहीं है, जबकि उदाहरण के लिए, एगोनिस्ट डी 2 रिसेप्टर्स के लगातार संपर्क में, सीए 2 + / calmodulin उत्तेजना 14,15 को AC1 और AC8 को संवेदनशील बनाने के साथ जुड़ा हुआ है. AC2, AC4, और AC7 बारीकी हालांकि, केवल पीकेसी उत्तेजित AC2 गतिविधि मजबूती 7,14,16,17 agonists के लिए डी 2 रिसेप्टर्स की लंबे समय तक निवेश के बाद अवगत है, संबंधित हैं. इसके अतिरिक्त, AC5 और AC6 Heter की एक उल्लेखनीय डिग्री दिखानेologous डी 2 रिसेप्टर्स 14,18-20 के सक्रियण के बाद गैस और forskolin उत्तेजित शिविर संचय करने के लिए संवेदीकरण, लेकिन Gβγ सबयूनिट एसी के लिए उनकी आवश्यकता में अलग दिखाई देते हैं 21 बातचीत. एसी संवेदीकरण के सबसे पढ़ाई मॉडल सेल लाइनों (जैसे HEK293 कोशिकाओं व्यक्ति एसी isoforms व्यक्त) का इस्तेमाल किया है, यद्यपि यह है कि इन निष्कर्षों देशी neuronal सेल मॉडल 4,22 के लिए अनुवाद है कि प्रतीत होता है. हाल ही में, एसी isoforms व्यक्त HEK293 कोशिकाओं में पहचान एसी isoform चयनात्मक छोटे अणु inhibitors का प्रभाव भी vivo में व्यवहार के अध्ययन के लिए 23 अनुवाद किया जा सकता है.
heterologous संवेदनशील बनाने के लिए एक पहचान आणविक तंत्र की कमी होने की संभावना अनुकूली प्रतिक्रिया की जटिलता के साथ ही एसी 12 isoforms व्यक्ति का अनूठा नियामक गुण को दर्शाता है. ऐसे जटिलता Unraveling आगे बोझिल पद्धति टी के उपयोग से जटिल हैटोपी निष्पक्ष दृष्टिकोण को रोजगार से शैक्षिक जांचकर्ताओं सीमित है. और 48 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्रारूप 15 - उदाहरण के लिए, हमारे पिछले यंत्रवत अध्ययनों 24 का उपयोग करते हुए लगातार सुसंस्कृत सेलुलर मॉडल का उपयोग शामिल है. संवर्धित कोशिकाओं को आम तौर पर 48 घंटे के लिए बढ़ा है और फिर सेल washes और incubations की एक श्रृंखला (चित्रा 1) के बाद एगोनिस्ट दवा उपचार (2-18 एचआर) के अधीन थे. एसी isoform विशिष्ट शिविर संचय प्रोटोकॉल शिविर कार्यप्रणाली 15,24 बाध्यकारी एक श्रमसाध्य और समय लेने वाली [3 एच] का उपयोग कर शिविर संचय की माप के द्वारा पीछा कार्यरत तब थे. प्रत्येक परख के लिए शुरू से खत्म करने की अवधि आम तौर पर सेल चढ़ाना से डेटा विश्लेषण (चित्रा 1) के लिए चार से पांच दिनों की कुल आवश्यकता है. नई प्रौद्योगिकियों और स्वचालन के आवेदन औद्योगिक और एचटीएस केंद्र स्थापित करने में संवेदीकरण पढ़ाई के लिए चिह्नित संवर्द्धन के लिए प्रेरित किया. उदाहरण के लिए, Chemi के लिए राष्ट्रीय केन्द्र के साथ काम कर रहे एक समूहसीएएल जीनोमिक्स एक दो दिन 1,536 अच्छी तरह प्रारूप 25 में μ opioid रिसेप्टर प्रेरित संवेदीकरण के छोटे अणु inhibitors की पहचान करने के लिए परख प्रक्रिया HTS की सूचना दी.
वर्तमान अनुच्छेद के सबसे शैक्षिक अनुसंधान संस्थानों में उपलब्ध हैं कि प्रौद्योगिकी का उपयोग कर heterologous संवेदीकरण के अध्ययन के लिए एक एचटीएस परख विकसित करने के प्रयास का वर्णन करता है. इस रणनीति heterologously अंतर्जात या व्यक्तिगत पुनः संयोजक adenylyl साइक्लेस isoforms (चो डी 2L या HEK-AC6 / डी एल 2) के साथ संयोजन में डी 2 dopamine रिसेप्टर व्यक्त सेल मॉडल से cryopreserved कोशिकाओं के उपयोग को शामिल करके पूरा किया गया. हमारे throughput में सुधार, हम अनिवार्य रूप से "मिश्रण और पढ़ा था कि" 384 अच्छी तरह प्रारूप में एक पांच कदम, एक दिन परख करने के लिए हमारे 48 अच्छी तरह से संवेदीकरण परख (4-5 दिन खत्म सी ए> 20 कदम) बदल दिया. नए प्रारूप शिविर एसीसी को मापने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समरूप समय हल प्रतिदीप्ति (HTRF) परख का उपयोग करता हैएक बहु मोड प्लेट रीडर के साथ बरकरार कोशिकाओं में umulation. परख मजबूत और छोटे अणु स्क्रीनिंग करने के लिए उत्तरदायी है, और प्रभावी ढंग से heterologous संवेदीकरण के inhibitors के लिए स्क्रीन के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, हम सामान्य दृष्टिकोण करने के लिए केवल एक मामूली संशोधन के साथ लक्षित या जीनोम चौड़ा siRNA पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए siRNA के रिवर्स अभिकर्मक के साथ इस परख के उपयोग की अनुमति देता है कि डेटा प्रदान करते हैं.
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Protocol
1. परख तैयार कोशिकाओं के विस्तार और cryopreservation
- संस्कृति चो-K1-DRD 2L 1.0 माइक्रोन एल glutamine, 800 माइक्रोग्राम / μl G418, 300 माइक्रोग्राम / μl hygromycin, 100 यू / μl के साथ पूरक हाम F12 मीडिया में एक 15 सेमी 2 सेल संस्कृति डिश पर (चो डी 2L) कोशिकाओं पेनिसिलिन, 100 / μl स्ट्रेप्टोमाइसिन ग्राम, और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS).
- कोशिकाओं 90-95% मिला हुआ हैं जब तक 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं. 10 μl बफर फॉस्फेट खारा (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धो लें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेल हदबंदी बफर के 3 μl जोड़कर कोशिकाओं फसल संस्कृति मीडिया के 12 μl का उपयोग कोशिकाओं Resuspend और trypan नीले बहिष्कार का उपयोग कोशिकाओं गिनती.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और ठंड मीडिया के 5 μl (10% डाइमिथाइल sulfoxide, 90% F में सेल गोली resuspendबी एस). वांछित सेल एकाग्रता (जैसे 1-20 x 10 6 कोशिकाओं / μl) प्राप्त करने के लिए सेल निलंबन पतला.
- प्रत्येक cryovial के लिए सेल के समाधान के विभाज्य 1.0 μl. -80 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर एक सेल ठंड कंटेनर में cryovials सेते हैं. लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक तरल एन 2 टैंक को cryovials स्थानांतरण.
2. परख तैयार कोशिकाओं (और रिवर्स अभिकर्मक ऑप्शन) चढ़ाना
- तेजी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं का एक जमे हुए cryovial पिघलना. कोशिकाओं thawed रहे हैं, Opti-सदस्य के 9 μl युक्त 15 μl शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण, और ट्यूब 3-5X inverting द्वारा मिश्रण.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 1 μl Opti-सदस्य में कोशिकाओं resuspend.
- सेल व्यवहार्यता का निर्धारण और आवश्यक के रूप में (उदाहरण के लिए. 3 x 10 5 कोशिकाओं / μl एकाग्रता) में व्यवहार्य कोशिकाओं को कमजोर करने trypan नीले बहिष्कार का उपयोग कोशिकाओं की गणनाOpti-सदस्य. प्लेट एक टिशू कल्चर में कोशिकाओं के 10 μl / अच्छी तरह से एक multichannel विंदुक का उपयोग 384 अच्छी तरह से थाली का इलाज किया.
- (सिफारिशों का विनिर्माण के अनुसार - धारा 7 देखें) कोशिकाओं द्वारा शिविर उत्पादन का आकलन करने के लिए एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए Opti-सदस्य में शिविर के धारावाहिक dilutions बनाओ. प्लेट के लिए 10 μl / अच्छी तरह से शिविर मानकों की जोड़ें नोट:. एक मानक वक्र परख प्लेटों में से एक पर एक अलग प्लेट या खाली कुओं पर तैयार किया जा सकता है.
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 100 XG पर थाली अपकेंद्रित्र, और 1 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
3. * SiRNA अभिकर्मक विकल्प उल्टा
यह खंड 3 चित्रा के लिए वैकल्पिक और प्रासंगिक है.
- RNase मुक्त DDH 2 ओ (जैसे 0.4 pmol / μl) में siRNA के एक समाधान तैयार करें. 384 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत वेल्स को 5 μl जोड़ें, और 15 एसई के लिए 100 XG पर थाली अपकेंद्रित्रकमरे के तापमान पर सी.
- (जैसे Opti-सदस्य के 1000 μl को 2000 Lipofectamine के 6 μl जोड़ने), ऊपर और नीचे pipetting और मिश्रण 0,006 का एक पहलू से Opti-सदस्य में 2000 Lipofectamine पतला.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए Lipofectamine 2000/Opti-MEM समाधान सेते हैं. पहले से ही siRNA होता है कि 384 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत वेल्स को पतला Lipofectamine 2000/Opti-MEM समाधान के 5 μl जोड़ें. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 100 XG पर थाली अपकेंद्रित्र.
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए थाली सेते हैं.
- (धारा 2) जैसा कि ऊपर वर्णित प्लेट परख तैयार कोशिकाओं. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 100 XG पर थाली अपकेंद्रित्र.
- (चर्चा देखने के लिए) नीचे दस्तक लक्षित जीन के लिए निर्धारित के रूप में 48-96 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (5% सीओ 2) में humidified इनक्यूबेटर को परख थाली लौटें.
4. छोटे अणु स्क्रीनिंग
- ऑप्टी में ब्याज की दवा (जैसे. छोटे अणु inhibitors) पतलासदस्य वांछित अंतिम सांद्रता 6x के लिए. धारावाहिक dilutions हाथ से आयोजित pipettes या एक तरल से निपटने स्टेशन का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है.
- परीक्षण परिसर के 2.5 μl / अच्छी तरह से जोड़ें या एक multichannel विंदुक का उपयोग कुओं की ओर करने के लिए वाहन (जैसे DMSO) युक्त बफर.
- कमरे के तापमान (ऊष्मायन वैकल्पिक है) में 15 सेकंड के लिए 100 XG पर थाली अपकेंद्रित्र.
5. लगातार Agonist उपचार
- एक 600 एनएम Opti-सदस्य में quinpirole का समाधान (100 एनएम यानी. 6 बार वांछित अंतिम एकाग्रता) तैयार करें.
- 2.5 μl / अच्छी तरह से एक multichannel विंदुक का उपयोग कुओं की ओर करने के लिए 600 एनएम quinpirole समाधान जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 100 XG पर थाली अपकेंद्रित्र, और 2 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
6. शिविर संचय की उत्तेजना
- 2 घंटा ऊष्मायन के दौरान, stimulati तैयारOpti-सदस्य में समाधान पर. उत्तेजना समाधान 40 माइक्रोन forskolin, के शामिल है 2 माइक्रोन 3 Isobutyl-1-methyxanthine (IBMX), और 4 माइक्रोन spiperone (6 चरण में सभी सांद्रता वांछित अंतिम एकाग्रता 4x कर रहे हैं).
- 5 μl / अच्छी तरह से एक multichannel विंदुक का उपयोग कुओं की ओर करने के लिए उत्तेजना समाधान जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 100 XG पर थाली अपकेंद्रित्र, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
7. शिविर संचय के शमन और आकलन
- कोशिकाओं द्वारा शिविर का उत्पादन निर्माता के निर्देशों के अनुसार शिविर गतिशील 2 किट का उपयोग कर मापा जाता है. संक्षेप में, आसुत जल में विरोधी शिविर cryptate और शिविर डी 2 पुनर्गठित. लघु अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots फ्रीज.
- काम कर समाधान करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार lysis बफर में विरोधी शिविर cryptate के एक विभाज्य और अलग से शिविर डी 2 के एक विभाज्य पतला.
- एकडीडी विरोधी शिविर cryptate काम समाधान और 10 μl / अच्छी तरह से एक multichannel विंदुक का उपयोग 384 अच्छी तरह से थाली करने के लिए शिविर डी 2 काम समाधान के 10 μl / अच्छी तरह से.
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 100 XG पर थाली अपकेंद्रित्र, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 337 एनएम के एक उत्तेजना का उपयोग कर एक प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक (संवेदनशीलता के लिए ऑटो पैमाने सेटिंग) में थाली पढ़ें, और प्रति 620 एनएम और 665 एनएम उत्सर्जन को मापने के निर्देश बनाती है.
- प्रति आकलन करने के लिए ratiometric विश्लेषण लागू शिविर मानक वक्र निर्देश बनाती है. परिणामस्वरूप मूल्यों का प्रयोग, डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परीक्षण कुओं में अनुमान लगाया गया शिविर संचय एक्सट्रपलेशन.
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Representative Results
एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल मॉडल का उपयोग कर छोटे अणु inhibitors की पहचान करने के लिए एक 384 भी heterologous संवेदीकरण परख के विकास भाग मैं.
एक सेल मॉडल में heterologous संवेदीकरण का अध्ययन करने के लिए, हम एक "मिश्रण और पढ़ें" प्रारूप में परख को कारगर बनाने के लिए सक्षम है कि सुधार के एक नंबर दिया. कुंजी संशोधनों के कई नीचे डाला जाता है, और चर्चा में और अधिक विस्तार में वर्णित हैं. पहला महत्वपूर्ण कदम cryopreserved कोशिकाओं 26 को लगातार संवर्धित कोशिकाओं से हमारे सेल संस्कृति को संशोधित किया गया था. अब हम नियमित रूप से एक्स 10 1-20 6 कोशिकाओं / μl के बीच सांद्रता में कोशिकाओं की संस्कृति बैचों cryopreserved किया जा सकता है. प्रत्येक संबंधित परख के लिए, सेल के शेयरों, thawed पतला, गिना, और फिर 384 अच्छी तरह से प्लेटों में सीधे चढ़ाया जाता है. एक संस्कृति अवधि की आवश्यकता को नष्ट करने और परख की सुविधा बढ़ रही है. हमारे पिछले संवेदीकरण परख का प्रारूप 48 में अच्छी तरह से Tiss उपयोगUE संस्कृति प्लेटों, और धोने, छानना, स्थानांतरण कदम है, और चित्रा (1) परख बाध्यकारी एक निस्पंदन आधारित [3 एच] शिविर के एक नंबर शामिल किया गया. इस प्रकार, संवेदनशील बनाने के लिए इस प्रारूप उच्च throughput आवेदन करने के लिए उत्तरदायी नहीं था. इसलिए, हम एक 96 अच्छी तरह से और उच्च throughput प्रदर्शन को सुधारने योग्य तो एक 384 अच्छी तरह से प्रारूप के लिए सबसे पहले परख कारगर बनाने के लिए महत्वपूर्ण प्रयास exerted. धोने कदम और संस्कृति / परख प्लेटों के कई प्रकार के मूल्यांकन के अनुकूलन शामिल उन्मूलन, अलग सेल घनत्व, और अलग ऊष्मायन अवधि. हम भी शिविर का पता लगाने के लिए कई तरीके का पता लगाया और वर्तमान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल अच्छी तरह से होती HTRF शिविर प्रौद्योगिकी अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विश्वसनीय, और बहुत ही स्थिर था. यह परख मंच किट द्वारा प्रदान की कोशिकाओं द्वारा निर्मित और शिविर (यानी. शिविर डी 2) लेबल शिविर के बीच immunocompetition पर आधारित है. अब हम सफलतापूर्वक heterologous sensit के लिए प्रोटोकॉल विकसित और लागू किया हैअनिवार्य रूप से कर रहे हैं कि 384 अच्छी तरह प्रारूप में ization (सही पैनल चित्रा 1) "मिश्रण और पढ़ें".
Endogenously AC6 एक्सप्रेस और AC7 27 कि: हमारी प्रारंभिक लक्ष्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चो डी 2L कोशिकाओं (NM_000795 मानव DRD 2L, परिग्रहण संख्या) का उपयोग करते हुए एक उच्च throughput डी 2L रिसेप्टर संवेदीकरण परख उत्पन्न करने के लिए किया गया था. Cryopreserved चो डी 2L कोशिकाओं अच्छी तरह से एक 384 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में 3,000 कोशिकाओं / पर चढ़ाया गया, और एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए equilibrated थे. प्लेटों इनक्यूबेटर और कमरे के तापमान पर जोड़ा गया था quinpirole डी 2 एगोनिस्ट की बढ़ती सांद्रता से हटा दिया गया. कोशिकाओं तो एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए incubated रहे थे. चक्रीय एएमपी संचय तो 10 माइक्रोन forskolin (एसी का एक सीधा उत्प्रेरक) के अलावा द्वारा शुरू किया गया था. शिविर संचय बफर एक phosphodiesterase अवरोध करनेवाला, isobutylmethylxanthine (IBMX निहित), शिविर संचय अवधि के दौरान अवशिष्ट डी 2 रिसेप्टर सक्रियण बाधा के क्रम में और साथ ही डी 2 प्रतिपक्षी, spiperone (1 माइक्रोन, डी, 2L = 0.07 एनएम) के लिए कश्मीर मैं. कोशिकाओं 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर incubated रहे थे. परख HTRF शिविर अभिकर्मकों युक्त lysis बफर के अलावा द्वारा समाप्त किया गया. पढ़ाई quinpirole साथ एक 2 घंटा pretreatment heterologous संवेदीकरण (2A चित्रा) के साथ लगातार एक खुराक पर निर्भर ढंग से बाद में forskolin उत्तेजित शिविर संचय बढ़ाया कि पता चला. इस प्रयोग के परिणाम संवेदीकरण assays के एक 384 अच्छी तरह प्रारूप में प्रदर्शन किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है. नई परख प्रारूप बना यह धोने या निथारना कदम के लिए जरूरत है एक "मिश्रण और पढ़ें" परख (चित्रा 1) के बिना अधिक से अधिक 20-4 कदम से कदम की संख्या कम हो.
प्रयोगों की दूसरी श्रृंखला में इस नई सुव्यवस्थित परख एक करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि क्या पता लगायाचो डी 2L मॉडल में संवेदीकरण के ssess inhibitors. Cryopreserved चो डी एल 2 कोशिकाओं / अच्छी तरह Opti-सदस्य में 3,000 कोशिकाओं के घनत्व पर एक 384 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में चढ़ाया गया. ज्ञात डी 2 गरम डी 2 रिसेप्टर प्रेरित संवेदीकरण ब्लॉक करने के लिए जोड़ा गया था. 100 एनएम quinpirole (अंतिम एकाग्रता) युक्त Opti-सदस्य तो 15 μl की कुल मात्रा को जोड़ा गया है, और कोशिकाओं एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए incubated रहे थे. ऊष्मायन के बाद, शिविर संचय forskolin (10 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) के प्रत्यक्ष अलावा द्वारा शुरू किया गया था, और परख समाप्त और शिविर HTRF का उपयोग कर मापा गया था. प्रारंभिक परिणाम spiperone या haloperidol (प्रोटोटाइप डी 2 गरम) forskolin की पूरी तरह से रोका quinpirole प्रेरित संवेदीकरण साथ pretreatment शिविर संचय (चित्रा 2 बी) को प्रेरित किया कि पता चला. इन परिणामों से यह दृष्टिकोण छोटे पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि मान्यता प्रदानडी 2 रिसेप्टर प्रेरित संवेदीकरण के अणु inhibitors. एक दूसरे प्रयोग में, हम इन यौगिकों संवेदीकरण बाधित परीक्षण है कि क्या डी 2 गरम की एक श्रृंखला की शक्ति का आकलन करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया. पिछले परिणामों के समान, इन अध्ययनों डी 2 गरम एक खुराक पर निर्भर ढंग से (चित्रा -2) में एगोनिस्ट प्रेरित संवेदीकरण हिचकते कि प्रदर्शन किया. संवेदीकरण के निषेध के लिए शक्ति का रैंक क्रम डी 2 रिसेप्टर विरोधी और डी 2 रिसेप्टर्स 28 में अपने पहले वर्णित औषध विज्ञान के रूप में अपने कार्यों के अनुरूप था.
भाग द्वितीय. स्क्रीनिंग प्रयासों में siRNA के रिवर्स अभिकर्मक के लिए 384 अच्छी तरह से संवेदीकरण परख के आवेदन.
हमारा अगला उद्देश्य स्केलेबल रिवर्स अभिकर्मक siRNA पुस्तकालय स्क्रीनिंग का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक 384 अच्छी तरह से संवेदीकरण परख करने के लिए विकसित किया गया था. प्रारंभिक अध्ययन थेऔर AC6 (चूहा ADCY6, परिग्रहण संख्या: NC_005120) (यानी HEK-AC6 / डी 2L कोशिकाओं): heterologously डी 2L dopamine रिसेप्टर्स (NM_012547 चूहा DRD 2L, परिग्रहण संख्या) दोनों को व्यक्त करता है कि एक HEK सेल मॉडल का उपयोग कर प्रदर्शन किया. पहले प्रयोगों सेल लाइन में एसी की एगोनिस्ट प्रेरित संवेदीकरण का प्रदर्शन करने की क्षमता का आकलन किया. संक्षेप में, cryopreserved AC6 / डी 2L कोशिकाओं 384 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में (1000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) चढ़ाया गया. 1 माइक्रोन quinpirole (अंतिम एकाग्रता) युक्त Opti-सदस्य 15 μl की कुल मात्रा को जोड़ा गया है, और कोशिकाओं एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए incubated रहे थे. ऊष्मायन के बाद, शिविर संचय forskolin की सांद्रता में वृद्धि के अलावा द्वारा शुरू किया गया था. परख HTRF अभिकर्मकों युक्त lysis बफर के अलावा द्वारा समाप्त किया गया. परिणाम 2 घंटे के लिए एगोनिस्ट quinpirole को कोशिकाओं के संपर्क में forskolin उत्तेजित कैम के एक उल्लेखनीय वृद्धि करने के लिए नेतृत्व से पता चला किपी संचय (चित्रा 3). 100 एनएम और forskolin की 300 एनएम दोनों पर शिविर की वृद्धि संचय वाहन इलाज कोशिकाओं (चित्रा 3) की तुलना में अधिक से अधिक से अधिक 15 गुना था.
अगला, हम siRNA विभिन्न रिवर्स अभिकर्मक शर्तों के एक आकलन शामिल है, जो हमारे अनुकूलन के प्रयासों का मार्गदर्शन करने के 29,30 के तरीके (आदि जैसे अभिकर्मक अभिकर्मकों, अभिकर्मक दक्षता, सेल घनत्व, ऊष्मायन समय,.) प्रकाशित करते थे. प्रारंभिक अध्ययन इष्टतम रिवर्स अभिकर्मक शर्तों का निर्धारण करने के लिए 2000 Lipofectamine साथ संयोजन में siGloRed, अभिकर्मक का एक संकेतक का उपयोग किया था. प्रयोगों 0.03 μl Lipofectamine 2000/5 μl Opti-सदस्य के साथ संयुक्त 2-4 pmol siRNA / 5 μl एच 2 ओ (नहीं दिखाया डेटा) HEK कोशिकाओं में किसी भी नमूदार विषाक्तता के बिना 72 घंटे में एक लगभग 95% अभिकर्मक दक्षता प्रदान की संकेत दिया कि. हम तो heterologous संवेदीकरण पर Gαs siRNA के प्रभाव की जांच कीके forskolin AC6 / डी 2L कोशिकाओं में शिविर संचय को प्रेरित किया. Gαs कई एसी isoforms (यानी AC1, AC2, AC5, और AC6) 19-21 के लिए heterologous संवेदीकरण की एक प्रमुख घटक के रूप में पहचान की गई है, क्योंकि गैस siRNA एक संभावित सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रस्तावित किया गया था. इसके अलावा, हमारे AC6 / डी 2L सेल मॉडल (चित्रा 3) में 15 गुना संवेदीकरण संकेत रिवर्स अभिकर्मक की क्षमता का आकलन करने के लिए शोर खिड़की के पास एक मजबूत संकेत देता है. ऊपर वर्णित शर्तों का उपयोग करना, हम एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में Gαs siRNA आकलन प्रारंभिक पढ़ाई पूरी की, और हमारे परिणाम संवेदीकरण (नहीं दिखाया डेटा) की एक मजबूत नाकाबंदी (> 90%) का प्रदर्शन किया.
संवेदीकरण संकेत में नाटकीय siRNA प्रेरित कमी siRNA स्क्रीनिंग प्रक्रिया के लिए एक उपयुक्त सकारात्मक नियंत्रण प्रदान करता है. एसी heterologous संवेदीकरण के siRNA स्क्रीनिंग के लिए एक और मात्रात्मक मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए, हम जो में डेटा उत्पन्नएक जेड 'कारक AC6 / डी 2L कोशिकाओं 31 का उपयोग कर परीक्षण की स्थिति की एक श्रृंखला के लिए गणना की गई. इस प्रयोग के लिए, हम 0.03 μl Lipofectamine 2000/5 μl Opti-सदस्य प्रति अच्छी तरह से में एक 384 अच्छी तरह से थाली (कुल मात्रा 10 μl) के साथ 5 μl में, 2 pmol Gαs siRNA, या गैर लक्षित कर siRNA नियंत्रण संयुक्त. Cryopreserved कोशिकाओं, thawed Opti-सदस्य में resuspended और फिर कई सेल घनत्व का उपयोग कर siRNA / Lipofectamine मिश्रण युक्त व्यक्ति वेल्स को जोड़ा गया था (यानी. 500-5,000 cells/10 μl / अच्छी तरह से). quinpirole उपचार (2 घंटा बनाम 18 घंटा) के साथ ही forskolin के अंतिम एकाग्रता (100-300 एनएम) की अवधि भी हमारे AC6 / डी 2L संवेदीकरण परख में पता लगाया गया. 750 कोशिकाओं / अच्छी तरह से, 72 घंटा अभिकर्मक अवधि, 2 घंटा quinpirole उपचार, और शिविर संचय (3B चित्रा) को प्रोत्साहित करने के लिए 300 एनएम forskolin:. इन प्रयोगों के परिणामों से एक मजबूत जेड 'कारक निम्न स्थितियों में प्राप्त हुई थी कि पता चला इन के तहत सहnditions, हम Gαs siRNA की उपस्थिति में 94% की कमी थी कि एक 15 गुना संवेदीकरण प्रतिक्रिया प्राप्त (बनाम Gαs siRNA के लिए 0.6 से जेड '. siRNA नियंत्रण).
चित्रा 1. पारंपरिक प्रारूप में, कोशिकाओं एक 48 अच्छी तरह प्रारूप में चढ़ाया और 48 घंटे से अधिक संगम बड़े हो रहे हैं. विकास मीडिया, निथर छोटे अणु inhibitors गयी, डी 2 एगोनिस्ट के अलावा द्वारा पीछा किया जाता है. 2 घंटा ऊष्मायन के बाद, परख मीडिया निथर जाता है और कोशिकाओं को धो / निथारना कदम की एक श्रृंखला के अधीन हैं. अगला, एसी प्रेरित है और कोशिकाओं lysed रहे हैं. चक्रीय एएमपी संचय तो एक निस्पंदन कदम और जगमगाहट गिनती की आवश्यकता होती है एक दिन में 2 परख है जो [3 एच] शिविर बाध्यकारी परख का उपयोग मूल्यांकन किया है. जबकि 96 प्रारूप eliminधोने और निथारना चरण में कई पैदा, हम इस प्रारूप एचटीएस या स्वचालन के लिए आसानी से उत्तरदायी नहीं था. एचटीएस प्रारूप 384 अच्छी तरह से प्लेटों में सीधे चढ़ाया जाता है कि cryopreserved कोशिकाओं का उपयोग करता है. ये cryopreserved कोशिकाओं एक 1 घंटा संतुलन निम्नलिखित "तैयार परख रहे हैं." इस प्रारंभिक ऊष्मायन अवधि के बाद, छोटे अणु inhibitors एक 2 घंटे ऊष्मायन के लिए डी 2 एगोनिस्ट के अलावा द्वारा पीछा जोड़ा जा सकता है. एसी प्रेरित है, और कोशिकाओं परख थाली में HTRF पता लगाने अभिकर्मकों का उपयोग lysed रहे हैं.
चित्रा 2. Cryopreserved चो डी 2L कोशिकाओं 3000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से कम 384 अच्छी तरह से परख प्लेटों में सीधे चढ़ाया और 1 घंटा. ए के लिए equilibrated) डी 2 एगोनिस्ट, quinpir की बढ़ती सांद्रता गयाOLE, जोड़ा गया था और कोशिकाओं एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए incubated रहे थे. चक्रीय एएमपी संचय कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए spiperone और IBMX की उपस्थिति में 10 माइक्रोन forskolin (अंतिम एकाग्रता) के साथ प्रेरित किया गया था. प्रतिक्रिया HTRF शिविर परख अभिकर्मकों (एन = 1, कम से कम 3 प्रयोगों के प्रतिनिधि) का उपयोग बुझती किया गया था. डाटा वाहन इलाज कोशिकाओं का एक प्रतिशत की प्रतिक्रिया के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. बी) चो डी 2L कोशिकाओं अनुपस्थिति (नियंत्रण) या संकेत डी 2 रिसेप्टर विरोधी (यानी spiperone या haloperidol) की उपस्थिति में pretreated थे. Quinpirole (100 एनएम) जोड़ा गया है, और कोशिकाओं संवेदीकरण प्रेरित करने के लिए 2 घंटे के लिए incubated रहे थे. एसी कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 10 माइक्रोन forskolin (अंतिम एकाग्रता) के साथ प्रेरित किया गया था. चक्रीय एएमपी HTRF का उपयोग निर्धारित किया गया था. डेटा =. सी.) चो डी 2L कोशिकाओं अनुपस्थिति (नियंत्रण में pretreated थे वाहन इलाज कोशिकाओं का एक प्रतिशत की प्रतिक्रिया के रूप में व्यक्त कर रहे हैं100%) या संकेत डी 2 रिसेप्टर विरोधी की बढ़ती एकाग्रता की उपस्थिति. Quinpirole (100 एनएम) जोड़ा गया है, और कोशिकाओं संवेदीकरण प्रेरित करने के लिए 2 घंटे के लिए incubated रहे थे. एसी कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 10 माइक्रोन forskolin (अंतिम एकाग्रता) के साथ प्रेरित किया गया था. चक्रीय एएमपी HTRF का उपयोग निर्धारित किया गया था. डाटा quinpirole प्रेरित संवेदीकरण प्रतिक्रिया का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. Cryopreserved HEK-AC6 / डी 2L कोशिकाओं 1000 कोशिकाओं / अच्छी तरह पर चढ़ाया और 1 घंटे के लिए equilibrated थे. ए) कक्ष वाहन या एक humidified इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए 100 एनएम quinpirole साथ incubated रहे थे. एसी वाकमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए forskolin की सांद्रता में वृद्धि के साथ प्रेरित है. चक्रीय एएमपी AC6 / डी 2L कोशिकाओं में Gαs siRNA ब्लॉक संवेदीकरण के HTRF. बी) रिवर्स अभिकर्मक का उपयोग निर्धारित किया गया था. Gαs siRNA या nontargeting siRNA नियंत्रण (2 pmol) 10 μl की कुल मात्रा में 0.03 μl Lipofectamine2000 (Lipo) के साथ जोड़ दिया गया था, और समाधान एक 384 अच्छी तरह से थाली में व्यक्तिगत कुओं को जोड़ा गया है. Cryopreserved AC6 / डी 2L कोशिकाओं को फिर रिवर्स अभिकर्मक के लिए जोड़ा गया है और एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 70 घंटे के लिए incubated रहे थे. डी 2 रिसेप्टर agonist, quinpirole (1 अंतिम माइक्रोन), या वाहन एक 2 घंटे ऊष्मायन द्वारा पीछा जोड़ा गया है. चक्रीय एएमपी संचय 1 घंटे के लिए 300 एनएम forskolin (अंतिम एकाग्रता) के साथ प्रेरित और HTRF का उपयोग कर मापा गया था. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
Heterologous संवेदीकरण के अध्ययन की सुविधा देने के प्रयास में, हम बड़े पैमाने पर हमारे पिछले विधि एक सुव्यवस्थित प्राप्त करने के लिए संशोधित किया है "मिश्रण और पढ़ें" उच्च throughput प्रदर्शन और कार्रवाई परीक्षा के तंत्र को सुधारने योग्य है कि प्रारूप. के रूप में हमारे प्रोटोकॉल के प्रमुख संशोधनों में संक्षेप किया जा सकता है: 1) "परख के लिए तैयार" अभिकर्मकों के रूप में cryopreserved कोशिकाओं के उपयोग, 384 अच्छी तरह प्रारूप में परख की 2) miniaturization, और HTRF माप के 3) उपयोग शिविर.
हमारे सेल आधारित assays के लिए cryopreservation के गोद लेने के काफी दिन प्रयोगों और स्क्रीनिंग प्रयासों के लिए हमारे दिन के लिए दक्षता और reproducibility में सुधार हुआ है. यह दृष्टिकोण एक उद्योग मानक है, और आसानी से 26 की स्थापना शैक्षिक अनुसंधान करने के लिए अनुवाद किया जा सकता है. सेल संस्कृति दक्षता में सुधार करने के लिए, कोशिकाओं की शीशियों, thawed पतला, और फिर 384 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए सीधे चढ़ाया जाता है कि सेल के शेयरों में "शेल्फ अभिकर्मकों बंद 'के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैंप्रत्येक परख आर. हम पहले से दब्बू जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स 32,33 के विरोधी की पहचान करने के उद्देश्य से अध्ययन में cryopreserved कोशिकाओं शामिल है. इस पद्धति को प्रारंभिक काम हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया और चुनौतियां पेश की और संभावना परिवर्तनशीलता शुरू की है जो परिसर में संवर्धित कोशिकाओं के परिवहन जरूरी नहीं था कि में फायदेमंद था. हमारे नए दृष्टिकोण का उपयोग, जमे हुए कोशिकाओं को अब तुरंत पहले परख की दीक्षा के लिए thawed और साइट पर पतला किया जा सकता है. Reproducibility में सुधार के अलावा, cryopreservation भी परख निष्पादन करने के लिए सेल चढ़ाना से 48 घंटे का समय अवधि (चित्रा 1) का सफाया कर दिया. हम सफलतापूर्वक शिविर संचय और β arrestin की भर्ती (Brust, TF, Ejendal, KFK, और वत्स, वीजे अप्रकाशित टिप्पणियों) सहित कार्यात्मक readouts के साथ पुनः संयोजक रिसेप्टर्स और एसी के उपप्रकार की एक किस्म का उपयोग कर स्थिर और क्षणिक अभिकर्मक पढ़ाई में cryopreservation के दृष्टिकोण आवेदन किया है . देसआज तक हमारी सकारात्मक अनुभव pite, शोधकर्ताओं ने अपने रिसेप्टर या लक्ष्य, और मॉडल सेल प्रणाली से पहले किसी भी बड़े पैमाने पर अध्ययन की शुरुआत करने के लिए cryopreservation के साथ संगत है कि सत्यापित करना चाहिए.
निथारना को संवेदनशील परख शामिल उन्मूलन को सरल बनाने और चित्रा (1) कदम धोने के लिए हमारे प्रयासों के लिए महत्वपूर्ण था कि एक दूसरे संशोधन. इन परिवर्तनों को एक 96 अच्छी तरह प्रारूप (Conley और वत्स, अप्रकाशित टिप्पणियों) को परख की हमारी miniaturization साथ समवर्ती थे. विशेष रूप से, एक संशोधित संवेदीकरण प्रोटोकॉल (मध्यम पैनल चित्रा 1 देखें) कैंप संचय किसी भी धोने या निथारना कदम के अभाव में डी 2 एगोनिस्ट ऊष्मायन के बाद परख बफर में forskolin के प्रत्यक्ष अलावा द्वारा शुरू किया गया था, जहां डिजाइन किया गया था. इसके अतिरिक्त, शिविर संचय बफर spiperone की एक अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता (1 माइक्रोन), डी 2 के लिए 0.07 एनएम के एक की मूल्य है कि एक डी 2 प्रतिपक्षी निहित15 रिसेप्टर्स. यह 100 जिससे forskolin दौरान एगोनिस्ट द्वारा अवशिष्ट डी 2 रिसेप्टर सक्रियण (जैसे quinpirole) precluding, शिविर संचय चरण के दौरान पूरा डी 2 रिसेप्टर कब्जे में spiperone परिणामों से अधिक एकाग्रता गुना एसी कदम 15 को प्रेरित किया. यह परिवर्तन प्रारंभिक एगोनिस्ट ऊष्मायन के बाद तीन छानना और तीन धोने कदम सफाया कर दिया. 96 अच्छी तरह प्रारूप विकास के हिस्से के रूप में, हम भी शमन करने से पहले और कोशिकाओं lysing अंतिम निथारना कदम को खत्म करने में सक्षम थे. 3-9% से और शिविर संचय बफर करने के लिए सीधे अभिकर्मक जोड़ने, (टीसीए. यानी Trichloroacetic एसिड) इस संशोधन हमारे lysing अभिकर्मक की एकाग्रता बढ़ाने के द्वारा पूरा किया गया. संशोधित 96 संवेदीकरण परख की आशाजनक परिणाम एक 384 अच्छी तरह से करने के लिए प्रारूप संवेदीकरण परख के रूपांतरण के लिए सहायता प्रदान की. दुर्भाग्य से, शिविर बढ़ाता के लिए हमारे पिछले कार्यप्रणाली एक श्रमसाध्य filtratio थाN-आधारित [3 एच] शिविर प्रोटीन बाध्यकारी परख (> 5 कदम). उदाहरण के लिए, परख आम तौर पर 15,24 गिनती फिल्टर सुखाने और जगमगाहट के लिए अनुमति देने के लिए दो दिनों के पाठ्यक्रम पर पूरा हो गया है. ये कमियां एक उच्च throughput 384 अच्छी तरह से प्रारूप के लिए उपयोग करने के लिए अव्यावहारिक बंधन [3 एच] शिविर प्रोटीन बनाया.
तीसरा महत्वपूर्ण विकास 384 अच्छी तरह से प्रारूप करने के लिए उत्तरदायी एक तरह से शिविर को मापने और बढ़ाता के लिए तरीके के समावेश के माध्यम से आया था. उदाहरण के लिए, हम एक शिविर रिस्पांस तत्व (रचनात्मक)-luciferase आधारित एक 384 अच्छी तरह से प्रारूप 32,33 में रिश्तेदार शिविर माप के लिए संवाददाता प्रणाली का उपयोग महत्वपूर्ण अनुभव है. इस दृष्टिकोण सफलतापूर्वक Gαs युग्मित रिसेप्टर्स के कई अध्ययनों के लिए हमारी प्रयोगशाला द्वारा इस्तेमाल किया गया है, रचनात्मक ल्यूक संवाददाताओं स्क्रीनिंग assays 34 के दौरान झूठी सकारात्मक और नकारात्मक की एक संख्या के अधीन हैं. इस बॉक्स के साथ साथ ही, हमारी प्रारंभिक डी 2 संवेदीकरण पढ़ाईरोच हम luciferase संकेत (नहीं दिखाया डेटा) की स्पष्ट प्रतिक्रिया निषेध मनाया में उत्साहजनक नहीं रहे थे. इसलिए, हम दोनों अपने "पहला" की मदद स्थिर सेल लाइनों और "दूसरा" पीढ़ी GloSensor वैक्टर के निर्माण और निस्र्पक द्वारा GloSensor शिविर प्रौद्योगिकी के कार्यान्वयन के हमारे प्रयासों पर ध्यान केंद्रित किया. GloSensor luciferase प्रोटीन 35 के भीतर एक शिविर बाध्यकारी साइट से युक्त एक इंजीनियर luciferase संवाददाता है. प्रणाली गतिज शिविर मात्रा का ठहराव के लिए बहुत उपयोगी है, विधि एगोनिस्ट प्रेरित संवेदीकरण (Conley और वत्स, अप्रकाशित टिप्पणियों) को मापने के लिए प्रभावी नहीं था. हम भी शिविर संचय का आकलन करने के लिए एक लागत प्रभावी साधन के रूप में हमारे अध्ययन के लिए एक ब्रेट आधारित शिविर biosensor 36 का पता लगाया. दुर्भाग्य से, transiently ट्रांसफ़ेक्ट biosensor के साथ जुड़े पृष्ठभूमि शोर हमारे संवेदीकरण परख करने के लिए इस विधि का अनुकूलन करने की क्षमता सीमित. अन्त में, हम समरूप समय से हल Fluor रोजगार कई किट का मूल्यांकन384 अच्छी तरह प्रारूप में शिविर को मापने के लिए एक दृष्टिकोण के रूप escence (HTRF). हम यह स्थापित कार्यप्रणाली वे, मजबूत संवेदनशील, स्थिर, और आसानी से उपयोग कर रहे थे कि में शैक्षिक प्रयोगशालाओं और स्क्रीनिंग सुविधाओं के साथ सबसे अनुकूल था. शैक्षिक जांचकर्ताओं के लिए प्राथमिक नुकसान अभिकर्मकों की लागत, अभिकर्मकों और 384 भी प्रारूप करने के miniaturization हालांकि थोक खरीद एलिसा आधारित assays और हमारे पिछले "घर" [3 एच] शिविर प्रोटीन सहित अन्य किट, साथ कीमत से अधिक प्रतिस्पर्धी बनाता है परख 15 बंधन.
प्रतिनिधि काम पुनः संयोजक कोशिका लाइनों में एसी संकेत के डी 2 dopamine रिसेप्टर प्रेरित संवेदीकरण की पढ़ाई के लिए 384 अच्छी तरह से संवेदीकरण परख की प्रयोज्यता दर्शाता है. कई प्रारंभिक अध्ययन में, हम विकास 2 dopamine रिसेप्टर का आकलन करने के लिए मामूली संशोधनों के साथ इस परख का इस्तेमाल किया है और (कई एसी isoforms की opioid रिसेप्टर प्रेरित संवेदीकरण μतालिका 1). इन अध्ययनों से कई सेल लाइनों, रिसेप्टर subtypes, और एसी isoforms के लिए 384 अच्छी तरह से परख की सामान्य प्रयोज्यता पर प्रकाश डाला. इसी तरह परख प्रारूपों के विकास में रुचि रखने वालों के लिए इस तरह सेल घनत्व, एगोनिस्ट pretreatment बार, एसी सक्रियण प्रोटोकॉल / स्थिति, और उनके सेलुलर मॉडल के लिए HTRF शिविर का पता लगाने पद्धति के रूप में चर का पता लगाने के लिए प्रोत्साहित किया जाएगा. इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रतिपक्षी डेटा संवेदीकरण के छोटे अणु inhibitors की पहचान करने के लिए परख की क्षमता प्रदर्शित करता है. शक्ति मूल्यों (: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php देखें) अन्य कार्यात्मक assays 28 के साथ ही assays के बंधन radioreceptor का उपयोग कर प्राप्त आत्मीयता (केआई) मूल्यों के साथ निर्धारित उन लोगों के साथ संगत कर रहे हैं. वर्तमान परख डिजाइन आसानी यौगिकों एक pintool के माध्यम से वितरित कर रहे हैं या परख तैयार प्लेटों में preplated रहे हैं जहां एचटीएस प्रयासों को समायोजित कर सकता है. वर्णित संवेदीकरण assays के अलावा, यहां लागू तरीके अन्य विज्ञापन के लिए लागू किया जाना चाहिएकई दवाओं / अभिकर्मकों 384 अच्छी तरह प्रारूप में पिछले एक अंत बिंदु उपाय करने के लिए आवेदन कर रहे हैं जहां aptive assays.
हम पूरे 384 अच्छी तरह से परख के लिए महत्वपूर्ण विकास कदम को उजागर करने का प्रयास किया, लेकिन यह भी रिवर्स अभिकर्मक siRNA assays के विकास विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण था कि नोट करना चाहते हैं. इन assays के लिए हमारी दीर्घकालिक लक्ष्य एसी isoforms की heterologous संवेदीकरण में शामिल अतिव्यापी और अद्वितीय जीन की पहचान करने के लिए एक जीनोम चौड़ा प्रयास आचरण है. एक दिशानिर्देश के रूप में हमारे प्रारंभिक siRNA परख का उपयोग करना, हम एक siRNA रिवर्स अभिकर्मक assays विकसित करने के लिए निम्नलिखित संक्षिप्त सुझाव प्रदान करते हैं: (1) ऐसी Siglo और अभिकर्मक अभिकर्मक (. जैसे Lipofectamine 2000) के रूप में एक संकेत के अनुपात का उपयोग अभिकर्मक दक्षता की जांच, (2) इष्टतम बोने घनत्व (जैसे 500-5,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) का निर्धारण, (3) (जैसे 48-96 घंटे) अभिकर्मक अवधि का पता लगाने, और (4) (जैसे दवा टीआर उपयुक्त परख की स्थिति का आकलनइष्टतम संकेत (जैसे जेड 'कारक विश्लेषण) को प्राप्त करने के लिए eatments, अंत बिंदु उपायों, और मजबूत नियंत्रण). अतिरिक्त विस्तार और स्क्रीनिंग प्रयासों में siRNA के उपयोग के लिए और अधिक सामान्य जानकारी भी पहले से संदर्भित तरीकों लेख 29,30 में पाया जा सकता है. एचटीएस प्रयासों में दिलचस्पी रखने वाले लोगों जांचकर्ताओं ने यह भी स्वचालन (जैसे. Pintool और रोबोटिक्स) को उनके assays के अनुकूलन क्षमता का पता लगाने चाहिए. इसके अलावा, स्क्रीनिंग प्रयासों के लिए अन्य कारकों या नियंत्रण औपचारिक परख सत्यापन, सेल व्यवहार्यता assays, और उपयुक्त काउंटर स्क्रीन शामिल हैं. Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/: अतिरिक्त मार्गदर्शन के लिए, रुचि पाठक पर NCATS माध्यम उपलब्ध NCGC परख मार्गदर्शन मेनुअल की जांच करने के लिए प्रोत्साहित किया जाएगा.
हम एक कुशल में एक श्रमसाध्य multiday परख व्यवस्थित बनाने के "मिश्रण और पढ़ें" एक ही दिन में किया जा सकता है कि परख के लिए हमारे दृष्टिकोण का वर्णन किया है. यहाँ वर्णित तरीके और एक1,536 अच्छी तरह प्रारूप 25 में μopioid रिसेप्टर प्रेरित संवेदीकरण में 1,280 यौगिकों के हाल ही के अध्ययन संवेदीकरण अब आसानी से एचटीएस का उपयोग कर पूछताछ की जा सकती है कि पता चलता है. यहाँ वर्णित परख छोटे अणु परीक्षण करने के लिए उत्तरदायी है और इस तरह के siRNA के रूप में आनुवंशिक दृष्टिकोण को लागू किया जा सकता है. हालांकि, सामान्य दृष्टिकोण और विधियों को व्यापक रूप से कई दवा और अभिकर्मक परिवर्धन (. जैसे desensitization और neuroprotection) की आवश्यकता होती है अन्य सेल आधारित assays के लिए लागू किया जा सकता है, हमारे परख प्रारूप एसी की heterologous संवेदीकरण के रूप में जाना अनुकूली प्रतिक्रिया पर ध्यान केंद्रित किया है. यहां काम की रिपोर्ट आसानी मल्टीचैनल pipettes और 384 अच्छी तरह प्रारूप में वांछित समापन बिंदु को पढ़ने में सक्षम एक बहु मोड प्लेट रीडर का उपयोग कर एक शैक्षिक स्थापना के भीतर पूरा किया है.
तालिका 1. सेलुलर मॉडल एगोनिस्ट प्रेरित संवेदीकरण के लिए परीक्षण किया गया.
| रिसेप्टर | एसी isoform | सेल लाइन | सुग्राहीकरण संकेत |
| डी 2L डोपामाइन | अन्तःविकसित (AC6 और AC7 27) | चो डी 2L | 2-3 गुना |
| डी 2L डोपामाइन | संयोजक AC2, AC5, और AC6 | Stably ट्रांसफ़ेक्ट HEK 293 | AC2 = 2-3 गुना AC5 = 50 गुना AC6 = 15 गुना |
| μ opioid | संयोजक AC1, AC2, और AC5 | Stably ट्रांसफ़ेक्ट HEK 293 | AC1 = 6-7 गुना AC2 = 2-3 गुना AC5 = 10-15 गुना |
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों methodological प्रशिक्षण और परख मार्गदर्शन के लिए श्री रिचर्ड Zink और टोड Wiernicki स्वीकार करना चाहते हैं. हम भी सावधान पढ़ने और संपादकीय सुझाव के लिए जॉन पॉल स्पेंस धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य महाराष्ट्र 060397, मस्तिष्क और व्यवहार रिसर्च फाउंडेशन, और एली लिली के संस्थान और लिली अनुसंधान पुरस्कार कार्यक्रम (LRAP) के माध्यम से कंपनी द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384-well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase- and RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Nontargeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
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- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
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