Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Drug-induced Sensibilisering av adenylyl cyclase: Analyse Effektivisering og miniatyrisering for lite molekyl og siRNA screening programmer

Published: January 27, 2014 doi: 10.3791/51218
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

Summary

Vedvarende aktivering av hemmende G protein-koblede reseptorer resulterer i sensibilisering av adenylyl cyclase signalering. For å identifisere de essensielle molekylære veier, nonbiased tilnærminger er nødvendig, men denne strategi krever utviklingen av en skalerbar cellebasert assay cAMP sensibilisering. Heri, beskriver vi en allergi analysen for lite molekyl og siRNA screening.

Abstract

Sensibilisering av adenylat cyclase (AC) signalisering har vært innblandet i en rekke nevropsykiatriske og nevrologiske forstyrrelser, inkludert stoffmisbruk og Parkinsons sykdom. Akutt aktivering av Gαi / o-koblede reseptorer hemmer AC-aktivitet, mens det vedvarende aktivering av disse reseptorene resulterer i en heterolog sensibilisering av AC og økte nivåer av intracellulært cAMP. Tidligere studier har vist at denne forbedring av strømrespons observert både in vitro og in vivo som følge av kronisk aktivering av flere typer Gαi / o-koblede reseptorer, inkludert D 2 dopamin og μ opioidreseptorer. Selv heterologe sensibilisering av AC først ble rapportert fire tiår siden, mekanismen (e) som ligger til grunn for dette fenomenet fortsatt i stor grad ukjent. Mangelen på mekanistiske data gjenspeiler antagelig kompleksiteten involvert med denne adaptiv respons, noe som tyder på at nonbiased tilnærminger kunne hjelpe til med å identifisereing de molekylære stier involvert i heterologe sensibilisering av AC. Tidligere studier har antydet kinase og Gbγ signale som overlappende komponenter som regulerer heterologe sensibilisering av AC. Å identifisere unike og flere overlappende mål knyttet til sensibilisering av AC, er utvikling og validering av en skalerbar cAMP allergi analysen som kreves for større gjennomstrømming. Tidligere fremgangsmåter for å studere sensibilisering er generelt tungvint involverer kontinuerlig cellekultur vedlikehold, så vel som en kompleks metode for måling av cAMP akkumulering som involverer flere vasketrinn. Dermed vil utviklingen av en robust cellebasert assay som kan brukes for high throughput screening (HTS) i en 384 brønns lette fremtidige studier. Ved hjelp av to D 2 dopamin reseptor cellulære modeller (dvs.. CHO-D 2L og HEK-AC6 / D 2L), har vi konvertert vår 48-vel allergi analysen (> 20 trinn 4-5 dager) til en fem-step, eneste dag analysen i 384-brønnen format. Denne nye formatet er mottagelig for lite molekyl screening, og vi vise at dette assay utforming også kan lett anvendes for omvendt transfeksjon av siRNA i påvente av målrettet siRNA-bibliotek-screening.

Introduction

En adaptiv adenylyl cyclase (AC) signal respons kjent som heterologe-eller super-allergi ble først oppdaget i laboratoriet av nobelprisvinner, Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg foreslått at den observerte økning strømrespons etter kronisk δ opioid reseptor aktivering var en mekanisme som er involvert i opiat toleranse og avhengighet 1.. I tillegg til kronisk δ opioid reseptor aktivering, denne neuroadaptive respons på strømsignalisering skjer også etter vedvarende aktivering av flere andre Gαi / o-coupled receptors to. Særlig er mange av disse reseptorene er assosiert med smerte, nevropsykiatriske og nevrologiske lidelser, og omfatter μ / κ opioid, D 2/4 dopamin, 5HT 1A, og M 2/4 muskarinreseptorer 2. I tillegg til Dr. Nirenberg funn, eksisterer en stor mengde bevis knytter sensibilisering av AC signale til kronisk opioid reseptor aktivering både in vivo 3-7. Sensibilisering av AC har også vært forbundet med en rekke sykdommer som involverer D-2-lignende dopaminreseptorer inkludert schizofreni og Parkinsons sykdom (for gjennomgang se referanse 2). Til tross for den potensielle betydningen av allergi, den nøyaktige mekanismen (er) forbundet med vedvarende Gαi / o-koblet reseptor aktivering som fører til økt AC respons fortsatt i stor grad ukjent.

Disse studiene gir begrunnelsen for å undersøke mekanismene for sensibilisering av adenylyl cyclase som en viktig nevrobiologisk mål. Likeledes bør den fysiologiske relevans av strømsignalisering 8 og den betydning at de enkelte veksel isoformer holder i denne adaptive også anerkjennes 2,9,10. I sammenheng med vår forskning, de generelle funksjoner knyttet til heterologe sensibilisering av rekombinante isoformer av AC parallelt disse egenskapene desbert for å studere de endogene isoformer av AC. Konkret har tidligere forskning funnet at aktiveringen av Gαi / o proteiner og påfølgende utslipp / omorganisering βγ subenheter er viktige krav reseptor indusert sensibilisering av alle AC isoformer. I tillegg viste flere studier tyder på at signale fra protein kinaser og Gβγ subenheter er involvert i allergi 2,11-13. Individuelle ACs også vise unike og distinkte allergi mønstre 12. For eksempel er vedvarende eksponering av D-2 reseptorene til agonister forbundet med sensibilisering av AC1 og AC8 i Ca2 + / kalmodulin stimulering 14,15, mens den tilgrensende AC3 ikke er sensibilisert 2.. AC2, AC4, og AC7 er nært beslektet, men er bare PKC-stimulert AC2 aktivitet robust sensibilisert etter langvarig eksponering av D 2 reseptorer å agonister 7,14,16,17. I tillegg AC5 og AC6 viser en markert grad av Heterologous sensibilisering til Gas-og forskolin-stimulert cAMP akkumulering etter aktivering av D 2 reseptorer 14,18-20, men ser ut til å variere i deres krav om Gβγ subenhet-AC interaksjoner 21. Selv om de fleste studier av AC sensibilisering har brukt modellcellelinjer (f.eks HEK293 celler uttrykker individuelle AC isoformer), ser det ut til at disse funnene kan overføres til innfødte nevronale cellemodeller 4,22. Flere nylig, kan effekten av AC isoformselektive selektive lite molekyl hemmere identifisert i HEK293 celler uttrykker AC isoformer også bli oversatt til in vivo atferdsstudier 23.

Mangelen på en identifisert molekylmekanisme for heterolog sensibilisering sannsynlig reflekterer kompleksiteten til det adaptive, så vel som de unike regulatoriske egenskaper av individuelle AC isoformene 12. Rakne slik kompleksitet er ytterligere komplisert ved bruk av tungvinte metoden thatten har begrenset akademiske etterforskere fra ansette objektive tilnærminger. For eksempel våre tidligere mekanistiske undersøkelser omfattet bruk av kontinuerlig dyrkede cellemodeller ved bruk av 24 - og 48-brønners vevskultur-format 15. Dyrkede celler ble vanligvis dyrket i 48 timer og deretter utsatt for agonist behandling (2-18 timer), etterfulgt av en serie av celle vasker og inkubasjoner (figur 1). AC-isoformselektive spesifikke cAMP akkumulering protokoller ble deretter ansatt fulgt av måling av cAMP akkumulering ved en omstendelig og tidkrevende [3 H] cAMP bindende metodikk 15,24. Varigheten fra start til slutt for hver analyse vanligvis kreves i alt fire til fem dager fra celle plette til data-analyse (figur 1). Anvendelsen av ny teknologi og automatisering har ført til markerte forbedringer for overfølsomhets studier i det industrielle og HTS senteret innstilling. For eksempel, en gruppe som jobber med Nasjonalt Senter for Chemical Genomics rapportert en todagers HTS analyseprosedyre for å identifisere små molekyl hemmere av μ opioidreseptor indusert sensibilisering i 1536-brønnformat 25.

Denne artikkelen beskriver arbeidet med å utvikle en HTS-analysen for studier av heterolog allergi ved hjelp av teknologier som er tilgjengelig på de fleste akademiske forskningsinstitusjoner. Denne strategien ble oppnådd ved å innarbeide bruken av cryopreserved celler fra cellemodeller, heterologt uttrykte D 2 dopamin-reseptoren i kombinasjon med endogene eller individuelle rekombinante adenylat cyclase-isoformene (CHO-D 2L eller HEK-AC6 / D 2 L). For å forbedre vår gjennomstrømning, redesignet vi vår 48 godt allergi analysen (ca.> 20 trinn mer enn 4-5 dager) til en fem-trinns, eneste dag analysen i 384-brønnen format som i hovedsak var "mix og lese". Det nye formatet bruker en kommersielt tilgjengelig homogen tid løst fluorescens (HTRF) analyse for å måle cAMP accumulation i intakte celler med en multi-modus plateleser. Analysen er robust og mottagelig for lite molekyl screening, og kan effektivt anvendes for å screene for hemmere av heterolog sensibilisering. I tillegg gir vi data som tillater bruk av denne analysen med omvendt transfeksjon av siRNA for målrettet eller genom bred siRNA-bibliotek screening med bare en mindre modifikasjon av den generelle metode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Utvidelse og kryokonservering analysen Klar Cells

  1. Kultur CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) celler på en 15 cm to celledyrkningsskål i Hams F12 media supplert med 1,0 mM L-glutamin, 800 ug / mL G418, 300 pg / mL hygromycin, 100 U / mL penicillin, 100 ug / mL streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS).
  2. Inkuber cellene ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2 inntil cellene er 90-95% sammenflytende. Vask cellene med 10 pl fosfatbufret saltvann (PBS), og høste cellene ved tilsetning av 3 ul av celle dissosiasjon buffer i 5 min ved 37 ° C. Resuspender cellene ved å bruke 12 ul av kulturmedier og telle celler ved hjelp av trypanblått-eksklusjon.
  3. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 5 mL av frysemediet (10% dimetylsulfoksid, 90% FBS). Fortynn cellesuspensjonen for å oppnå den ønskede cellekonsentrasjon (for eksempel 1 til 20 x 10 6 celler / mL).
  4. Delmengde 1,0 mL av celle løsning til hver cryovial. Inkuber cryovials i en celle innfrysningskar ved -80 ° C over natten. Overfør cryovials til en flytende N 2 tank for langtidslagring.

2. Plating Analyse Klar Cells (og omvendt Transfection Option)

  1. Raskt tine frosne cryovial av celler i et 37 ° C vannbad. Når cellene er tint, overføre cellene til en 15 mL konisk rør inneholdende 9 ul av OPTI-MEM, og bland ved å snu røret 3-5x.
  2. Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 min ved romtemperatur. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i en mL Opti-MEM.
  3. Tell cellene ved hjelp av trypan-blå-ekskludering til å bestemme cellenes levedyktighet og for å fortynne de levedyktige celler som er nødvendig (f.eks. 3 x 10 5 celler / mL konsentrasjon) iOpti-MEM. Plate 10 ul / brønn av celler i en vevskultur behandlede 384-brønners plate ved bruk av en multikanal pipette.
  4. Gjør serielle fortynninger av cAMP i Opti-MEM å generere en standardkurve for beregning av cAMP produksjon av cellene (i henhold til de produserer anbefalinger - se seksjon 7). Tilsett 10 mL / godt av leiren standarder til plate. Merk: en enkelt standard kurve kan være forberedt på en separat plate eller tomme brønner på en av de analyse plater.
  5. Sentrifuger plate ved 100 xg i 15 sekunder ved romtemperatur, og inkuberes ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2 i 1 time.

Tre. Omvendt siRNA Transfection Alternativ *

Denne delen er valgfri og relevant Figur 3.

  1. Forbered en løsning av siRNA i RNase-frie DDH 2 O (f.eks 0,4 pmol / ul). Tilsett 5 ul til individuelle brønner av 384-brønners plate, og Sentrifuger plate ved 100 xg i 15 sec ved romtemperatur.
  2. Fortynn Lipofectamine 2000 i Opti-MEM med en faktor på 0,006 (som legger 6 mL av Lipofectamine 2000 til 1000 ul Opti-MEM), og bland ved å pipettere opp og ned.
  3. Inkuber Lipofectamine 2000/Opti-MEM oppløsningen i 5 minutter ved romtemperatur. Tilsett 5 mL av den fortynnede Lipofectamine 2000/Opti-MEM løsning til individuelle brønner av 384-brønners plate som allerede inneholder siRNA. Sentrifuger plate ved 100 xg i 15 sekunder ved romtemperatur.
  4. Inkuber platen i 30 minutter ved romtemperatur.
  5. Plate assay ferdige celler som beskrevet ovenfor (avsnitt 2). Sentrifuger plate ved 100 xg i 15 sekunder ved romtemperatur.
  6. Retur assay-plate for å fuktet inkubator ved 37 ° C (5% CO2) i 48 til 96 timer som bestemt for målrettet gene knock down (se diskusjon).

4. Small Molecule Screening

  1. Fortynne stoffet av interesse (f.eks. Lite molekyl hemmere) i Opti-MEM 6x de ønskede sluttkonsentrasjoner. Seriefortynning kan gjennomføres ved hjelp av håndholdte pipetter eller en væskehåndtering stasjon.
  2. Til 2,5 ul / brønn av testforbindelsen eller buffer inneholdende kjøretøy (for eksempel DMSO) til siden av brønnene ved hjelp av en multikanal pipette.
  3. Sentrifuger plate ved 100 xg i 15 sekunder ved romtemperatur (inkuberingen er valgfritt).

5. Vedvarende agonistbehandlingen

  1. Forbered en 600 nM (ie. 6 ganger ønsket endelig konsentrasjon på 100 nM) løsning av quinpirole i Opti-MEM.
  2. Til 2.5 mL / brønn av 600 nM quinpirole løsning til siden av brønnene ved hjelp av en multikanal pipette.
  3. Sentrifuger plate ved 100 xg i 15 sekunder ved romtemperatur, og inkuberes ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2 i 2 timer.

6. Stimulering av cAMP Opphopning

  1. Under to timers inkubasjon forberede stimulatipå løsning i Opti-MEM. Stimulering løsning består av 40 uM forskolin, 2 mM 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX) og 4 uM spiperon (alle konsentrasjoner i trinn 6 er 4 x den ønskede sluttkonsentrasjon).
  2. Tilsett 5 ul / brønn av stimulerings løsningen på den siden av brønnene ved hjelp av en multikanal pipette.
  3. Sentrifuger plate ved 100 xg i 15 sekunder ved romtemperatur, og inkuber ved værelsetemperatur i 1 time.

7. Leskende og estimering av cAMP Opphopning

  1. Produksjon av cAMP av cellene måles ved hjelp av cAMP dynamisk to kit i henhold til produsentens instruksjoner. Kort, rekonstituere anti-cAMP-kryptat og cAMP-d2 i destillert vann. Fryse alikvoter ved -20 ° C for kortvarig lagring.
  2. Fortynn en delmengde av anti-cAMP-kryptat og en delmengde av cAMP-D2 separat i lysis buffer i henhold til produsentens instruksjoner for å gjøre arbeidsløsninger.
  3. Add 10 ul / brønn av anti-cAMP-kryptat arbeidsoppløsning og 10 pl / brønn av den cAMP-d2 fungerende løsning på 384-brønners plate ved bruk av en multikanal pipette.
  4. Sentrifuger plate ved 100 xg i 15 sekunder ved romtemperatur, og inkuber ved værelsetemperatur i 1 time.
  5. Les platen i en fluorescens plateleser (innstillingen auto skala for følsomhet) ved hjelp av en eksitasjon av 337 nm, og måle utslipp på 620 nm og 665 nm per produserer instruksjoner.
  6. Påfør ratiometric analyse for å vurdere cAMP standardkurve per produserer instruksjoner. Ved hjelp av de resulterende verdiene, ekstrapolere estimert cAMP opphopning i testbrønnene som bruker dataanalyse programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Del I. Utvikling av en 384 godt heterologt allergi analyse for å identifisere små molekyl hemmere ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig celle modell.

Å studere heterolog allergi i en celle modell, vi har gjort en rekke forbedringer som gjorde oss i stand til å effektivisere analysen inn i en "mix og lese" format. Flere av de viktige modifikasjoner er fremhevet nedenfor, og er beskrevet i mer detalj i diskusjonen. Den første viktig skritt var å endre vår cellekultur fra kontinuerlig dyrkede celler til cryopreserved celler 26. Vi har nå rutinemessig kultur grupper av celler som kan fryses ned i konsentrasjoner mellom 1-20 x 10 6 celler / mL. For hver respektive assay blir celle stocks tint, fortynnet, telles, og deretter belagt direkte i 384-brønns plater. Eliminere behovet for en kultur perioden og øke bekvemmeligheten av analysen. Formatet av vår tidligere sensibilisering analysen benyttet 48-brønners tissue kulturplater, og omfattet en rekke vaske, dekantering, overføringsfremgangsmåten, og et filtreringsbasert [3H] cAMP-bindingsanalyse (figur 1). Således dette formatet for sensibilisering var ikke er mottagelig for høy gjennomstrømning. Derfor har vi utøves betydelige anstrengelser for å effektivisere assay første til en 96-brønn, og deretter et 384-brønnformat amendable til høy throughput screening. Optimalisering involvert eliminering av vasketrinn og evaluering av flere typer av kultur / analyseplater, varierende celle-tettheter, og forskjellige inkubasjonsperioder. Vi har også utforsket flere metoder for cAMP deteksjon og funnet ut at den godt karakterisert HTRF cAMP teknologien som brukes i denne protokollen var svært reproduserbare, pålitelig, og svært stabil. Denne analysen er basert på plattformen immunocompetition mellom cAMP produsert av cellene og merket cAMP (dvs.. CAMP-d2) levert av settet. Vi har nå utviklet og anvendt protokoller for heterologe SensITization i 384-godt format som er essensielt "mix og lese" (høyre panel Figur 1).

Vårt første mål var å generere en høy gjennomstrømming D 2L reseptor allergi analysen bruker kommersielt tilgjengelige CHO-D 2L celler (human DRD 2L, tiltredelse nummer: NM_000795) som endogent uttrykke AC6 og AC7 27. Cryopreserved CHO-D 2L-celler ble sådd ut ved 3000 celler / brønn i en 384-brønners vevkulturplate, og ble ekvilibrert i 1 time ved 37 ° C i en fuktet inkubator. Platene ble fjernet fra inkubatoren, og økende konsentrasjoner av D-2-agonist quinpirole ble tilsatt ved romtemperatur. Cellene ble deretter inkubert i 2 timer ved 37 ° C i en fuktet inkubator. Syklisk AMP-akkumulering ble deretter initiert ved tilsetning av 10 uM forskolin (en direkte aktivator av AC). CAMP opphopning buffer inneholdt en fosfodiesterasehemmer, isobutylmethylxanthine (IBMX), Så vel som D-2-antagonist, spiperon (1 mM, K i for D, 2L = 0,07 nM), for å være til hinder for gjenværende D-2-reseptor-aktivering i løpet av cAMP akkumulering perioden. Cellene ble inkubert ved romtemperatur i 1 time. Analysen ble avsluttet ved tilsetning av en lyseringsbuffer inneholdende de HTRF cAMP reagenser. Studiene viste at en 2 timers forbehandling med quinpirole forbedret følgende forskolin-stimulert cAMP-akkumulering i en doseavhengig måte som er forenlig med heterolog sensibilisering (figur 2A). Resultatene av dette forsøk viser at sensitivitets analyser kan bli utført i en 384-brønners format. Den nye analysen format redusert antall trinn fra mer enn 20 til 4 trinn, uten behov for vaske eller dekanter trinn gjør det til en "mix og les"-analyse (figur 1).

Den andre serie forsøk undersøkt om denne nye strømlinjeformet assay kan utnyttes til enssess inhibitorer av allergi i CHO-D 2L modellen. Cryopreserved CHO-D-2 L-celler ble sådd ut i en 384 brønners vevkul-plate ved en densitet på 3000 celler / brønn i Opti-MEM. Kjente D 2-reseptorantagonister ble lagt for å blokkere D 2-reseptor-indusert sensibilisering. Opti-MEM inneholdende 100 nM quinpirole (sluttkonsentrasjon) ble deretter tilsatt til et totalvolum på 15 ul, og cellene ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C i en fuktet inkubator. Etter inkubering ble cAMP akkumulering initiert ved direkte tilsetning av forskolin (10 uM sluttkonsentrasjon), og analysen ble avsluttet og cAMP måles ved hjelp HTRF. De første resultatene viste at forbehandling med spiperon eller haloperidol (prototypiske D 2-reseptorantagonister) helt forhindret quinpirole indusert sensibilisering av forskolin stimulert cAMP akkumulering (figur 2B). Disse resultatene gir bekreftelse på at denne tilnærmingen kan benyttes til å identifisere småmolekyl hemmere av D 2-reseptor-indusert sensibilisering. I et andre eksperiment, har vi brukt denne metoden til å vurdere styrken av en serie av D-2-antagonister for å teste hvorvidt disse forbindelsene inhiberer sensibilisering. I likhet med de foregående resultater, er disse studier viste at de D-2-antagonister hemmet agonist indusert sensibilisering på en doseavhengig måte (figur 2C). Den stigende orden av styrke for inhibering av sensibilisering var konsistent med sine handlinger som D-2-reseptor-antagonister og deres tidligere beskrevet farmakologien til D-2-reseptorer 28.

Part II. Bruk av 384-brønnen allergi analysen for omvendt transfeksjon av siRNA i screening bestrebelser.

Vårt neste mål var å utvikle en 384-vel allergi analyse som kan brukes til å gjennomføre skalerbar omvendt transfeksjon siRNA bibliotek screening. Foreløpige studier varutføres ved hjelp av en HEK cellemodell som heterologt uttrykker både D 2L dopaminreseptorer (rotte DRD 2L, tiltredelse nummer: NM_012547) og AC6 (rotte ADCY6, sjonsnummer: NC_005120) (dvs. HEK-AC6 / D 2L celler). De første eksperimenter vurderes evnen til å påvise agonist indusert sensibilisering av AC i cellelinjen. Kort fortalt ble cryopreserved AC6 / D 2L celler belagt (1000 celler / brønn) i en 384-brønnen vev kultur plate. Opti-MEM inneholdende 1 mM quinpirole (sluttkonsentrasjon) ble tilsatt til et totalvolum på 15 ul, og cellene ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C i en fuktet inkubator. Etter inkubering ble cAMP akkumulering initiert ved tilsetning av økende konsentrasjoner av forskolin. Analysen ble avsluttet ved tilsetning av lyseringsbuffer inneholdende de HTRF reagenser. Resultatene viste at eksponering av celler til agonist quinpirole i 2 timer førte til en markert forbedring av forskolin-stimulert CAMP akkumulering (figur 3A). Økt akkumulering av cAMP ved både 100 nM og 300 nM av forskolin var større enn 15-ganger sammenlignet med bærer-behandlede celler (figur 3A).

Deretter brukte vi publiserte siRNA metodikk 29,30 å veilede våre optimalisering innsats som inkluderte en vurdering av ulike omvendt transfeksjonsmetoder forhold (f.eks transfeksjon reagenser, transfeksjon effektivitet, celletetthet, inkubasjonstid, osv..). Foreløpige studier benyttet siGloRed, en indikator for transfeksjon, i kombinasjon med Lipofectamine 2000 for å bestemme optimale omvendt transfeksjon forhold. Eksperimentene indikerte at 2-4 pmol siRNA / 5 pl H to O kombinert med 0,03 mL Lipofectamine 2000/5 ul Opti-MEM ga en nesten 95% transfeksjon effektivitet på 72 timer uten noen observerbar toksisitet i HEK-celler (data ikke vist). Vi deretter undersøkt effekten av Gαs siRNA på heterologe allergiav forskolin stimulert cAMP opphopning i AC6 / D 2L celler. The Gas siRNA ble foreslått som en potensiell positiv kontroll fordi Gαs har blitt identifisert som en nøkkelkomponent i heterolog allergi for flere AC isoformene (dvs. AC1, AC2, AC5, og AC6) 19-21. Videre er den 15 ganger sensibilisering signal i våre AC6 / D 2L cellemodell (fig. 3A) er et robust signal-til-støy-vinduet for å vurdere effektiviteten av omvendt transfeksjon. Ved hjelp av forholdene som er beskrevet ovenfor, fullførte vi foreløpige studier som vurderer Gαs siRNA som en positiv kontroll, og våre resultater viste en robust blokade (> 90%) av allergi (data ikke vist).

Den dramatiske siRNA-indusert reduksjon av allergi signalet sørger for en passende positiv kontroll for siRNA screeningprosessen. For å få en mer kvantitativ vurdering for siRNA screening av AC heterolog allergi, vi genererte data deren Z 'faktor ble beregnet for en serie av testforhold ved hjelp av AC6 ​​/ D 2L celler 31. For dette forsøket, kombineres vi 2 pmol Gαs siRNA, eller den ikke rettet siRNA-kontroll, i 5 mL med 0,03 mL Lipofectamine 2000/5 ul Opti-MEM per brønn i en 384-brønners plate (totalt volum 10 ul). Cryopreserved celler ble tint, resuspendert i Opti-MEM og deretter tilsatt til individuelle brønner inneholdende siRNA / Lipofectamine blandingen ved hjelp av flere celle-tettheter (f.eks. 500-5000 cells/10 ul / brønn). Varigheten av quinpirole behandling (2 timer sammenlignet med 18 timer), så vel som den endelige konsentrasjon av forskolin (100-300 nM) ble også undersøkt i vår AC6 / D 2L sensibilisering assay. Resultatene av disse forsøk viste at en robust Z "-faktor ble fremstilt i følgende forhold: 750 celler / brønn, 72 timers transfeksjon varighet, 2 timers quinpirole behandling, og 300 nM forskolin til å stimulere cAMP akkumulering (figur 3B). Under disse conditions, erholdt vi 15 fold sensibilisering respons som ble redusert med 94% i nærvær av Gαs siRNA (Z 'på 0,6 for Gαs siRNA vs. styre siRNA).

Figur 1
Figur 1. På vanlig format blir cellene belagt i en 48-brønns-format og dyrket til konfluens over 48 timer. Vekstmateriale dekanteres, små molekyl-inhibitorer tilsatt, fulgt av tilsetning av D-2-agonist. Etter 2 timers inkubasjon blir assay mediet dekantert, og cellene er utsatt for en serie vaske / dekanter trinn. Deretter blir AC stimulert og cellene blir lysert. Syklisk AMP akkumulering blir deretter vurdert ved å bruke [3H] cAMP-bindingsanalysen som er en 2 dagers assay krever et filtreringstrinn, og scintillasjonstelling. Mens den 96 brønns eliminrerte mange av vask og dekanter trinn, fant vi at dette formatet var ikke lett mottagelig for HTS eller automatisering. Den HTS formatet bruker cryopreserved celler som er belagt direkte inn 384-brønners plater. Disse cryopreserved cellene er "analysen klar" etter en 1 hr vektutjevning. Etter denne innledende inkubasjonsperiode, kan små molekyl-inhibitorer tilsettes etterfulgt av tilsetning av D-2-agonist for en 2 timers inkubasjon. AC er stimulert, og cellene blir lysert ved hjelp av HTRF deteksjons reagenser i analyseplaten.

Fig. 2
Figur 2. Cryopreserved CHO-D 2L-celler ble platet direkte inn i 384 godt assay plater ved 3000 celler / brønn og ble ekvilibrert i 1 time. A.) Økende konsentrasjoner av D-2-agonist, quinpirole, ble tilsatt, og cellene ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C i en fuktet inkubator. Syklisk AMP-akkumulering ble stimulert med 10 uM forskolin (sluttkonsentrasjon) i nærvær av spiperon og IBMX i 1 time ved romtemperatur. Reaksjonen ble undertrykket ved hjelp av HTRF cAMP analysereagensene (n = 1, representative for minst tre forsøk). Data ble uttrykt som en prosent respons med bærer-behandlede celler. B.) CHO-D 2L-celler ble forbehandlet i fravær (kontroll) eller i nærvær av de angitte D-2-reseptor-antagonister (dvs. spiperon eller haloperidol). Quinpirole (100 nM) ble tilsatt, og cellene ble inkubert i 2 timer for å indusere sensibilisering. AC ble stimulert med 10 pM forskolin (sluttkonsentrasjon) i 1 time ved romtemperatur. Syklisk AMP ble fastsatt ved hjelp HTRF. Data ble uttrykt som en prosent respons med bærer-behandlede celler. C.) CHO-D 2L-celler ble forbehandlet i fravær (kontroll =100%) eller tilstedeværelse av økende konsentrasjon av indikert D 2-reseptorantagonister. Quinpirole (100 nM) ble tilsatt, og cellene ble inkubert i 2 timer for å indusere sensibilisering. AC ble stimulert med 10 pM forskolin (sluttkonsentrasjon) i 1 time ved romtemperatur. Syklisk AMP ble fastsatt ved hjelp HTRF. Dataene er uttrykt som en prosent av quinpirole-indusert sensibilisering respons. Klikk her for å se større bilde.

Figur 3
Fig. 3. Cryopreserved HEK-AC6 / D 2L-celler ble platet med 1000 celler / brønn og ble ekvilibrert i 1 time. A.) Celler ble inkubert med bærer eller 100 nM quinpirole i 2 timer i en fuktet inkubator. AC was stimulert med økende konsentrasjoner av forskolin i 1 time ved romtemperatur. Syklisk AMP ble fastsatt ved hjelp HTRF. B.) Omvendt transfeksjon av Gαs siRNA blokker allergi i AC6 / D 2L celler. Gαs siRNA eller nontargeting siRNA-kontroll (2 pmol) ble kombinert med 0,03 mL Lipofectamine2000 (Lipo) i et totalvolum på 10 ul, og oppløsningen ble tilsatt til individuelle brønner i en 384-brønners plate. Cryopreserved AC6 / D 2L-celler ble deretter tilsatt til den omvendte transfeksjon og inkubert i 70 timer ved 37 ° C i en fuktet inkubator. Den D-2 reseptor-agonist, quinpirole (1 mM endelig), eller vehikkel ble tilsatt etterfulgt av en 2 timers inkubasjon. Syklisk AMP akkumulering ble stimulert med 300 nM forskolin (endelig konsentrasjon) for en time og målt ved hjelp HTRF. Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I et forsøk på å legge til rette for studier av heterolog allergi, har vi i stor utstrekning endret vår forrige metoden oppnå en strømlinjeformet "mix og lese" format som er amendable til high-throughput screening og virkningsmekanisme eksamen. De store modifikasjoner på vår protokoll kan oppsummeres som følger: 1) bruk av cryopreserved celler som "analyse-ready" reagenser, 2) miniatyrisering av analysen i 384-brønnformat, og 3) bruk av den HTRF måling cAMP.

Fastsettelsen av nedfrysing for våre cellebaserte analyser har kraftig forbedret effektivitet og reproduserbarhet for våre daglige eksperimenter og screening bestrebelser. Denne tilnærmingen er en industristandard, og kan lett oversettes til akademisk forskning innstilling 26. For å forbedre cellekultur effektivitet, er ampuller med celler brukes som "hyllevare reagenser" i den cellen aksjer er tint, utvannet, og deretter belagt direkte i 384-brønners plater for hver analyse. Vi er blitt inkorporert cryopreserved celler i studier med sikte på å identifisere antagonister av virvelløse G protein koblede reseptorer 32,33. Denne metode var fordelaktig ved at den innledende arbeid som ikke ble utført i vårt laboratorium og nødvendig transport av dyrkede celler tvers campus som presenteres utfordringer og sannsynligvis innført variabilitet. Ved hjelp av den nye metode, frosne celler kan nå umiddelbart tint og fortynnet på stedet forut for igangsettingen av analysen. I tillegg til å forbedre reproduserbarheten, nedfrysing elimineres, de 48 timers periode fra celle plette til analyseutførelse (fig. 1). Vi har med hell brukt den nedfrysing tilnærming i stabile og forbigående transfeksjon studier ved hjelp av en rekke av rekombinante reseptorer og undergrupper av ACs med funksjonelle leselig inkludert cAMP akkumulering og β-arrestin rekruttering (Brust, TF, Ejendal, KFK, og Watts, VJ upubliserte observasjoner) . DesPite våre positive erfaringer hittil, bør forskerne bekrefte at deres reseptor eller mål, og modell cellesystemet er kompatibelt med nedfrysing Før oppstart av noen store studier.

En annen endring som var viktig for vårt arbeid med å effektivisere allergi analysen involvert eliminering av decant og vaske trinn (Figur 1). Disse endringene var sammenfallende med våre miniatyrisering av analysen til en 96-brønns-format (Conley og Watts, upubliserte observasjoner). Nærmere bestemt ble en modifisert sensibilisering protokoll utviklet hvor cAMP akkumulering ble initiert ved direkte tilsetning av forskolin i analysebuffer følgende D2 agonist inkubering i fravær av eventuelle vaske eller dekanter trinn (se midtre panel Figur 1). I tillegg inneholdt den cAMP akkumulering buffer en relativt høy konsentrasjon av spiperon (1 uM), en D-2-antagonist som har en Ki-verdi på 0,07 nM for D2reseptorer 15. Dette 100 ganger overskudd konsentrasjon av spiperon resulterer i komplett D-2-reseptor-stilling i løpet av cAMP akkumulering fasen, og derved utelukker gjenværende D-2-reseptor-aktivering av agonister (f.eks quinpirole) i løpet av forskolin stimulert AC trinn 15. Denne endringen elimineres de tre dekantering og tre vasketrinn etter den første agonist inkubering. Som en del av 96-brønners format utvikling, var vi i stand til å eliminere den endelige dekantering trinn før quenching og lysering av cellene. Denne modifikasjon ble utført ved å øke konsentrasjonen av vår lyse reagens (dvs. trikloreddiksyre,. TCA) 3-9% og tilsette reagenset direkte til cAMP akkumulering buffer. De lovende resultater av den modifiserte 96 brønner sensibilisering assay gitt støtte til omdannelse av allergi assay i et 384-brønnformat. Dessverre, vår forrige metodikk for å kvantifisere cAMP var en strevsom filtration-baserte [3H] cAMP-protein-bindingsanalyse (> 5 trinn). For eksempel blir analysen generelt fullført i løpet av to dager for å tillate filtertørking og scintillasjonstelling 15,24. Disse ulempene har gjort en [3H] cAMP proteinbinding upraktisk å benytte for en høy gjennomstrømning 384-brønnformat.

Den tredje nøkkelen utvikling kom gjennom inkorporering av metoder for å måle og kvantifisere cAMP på en måte mottagelig for 384-brønnen format. For eksempel har vi betydelig erfaring med bruk av en cAMP Response Element (CRE)-luciferase-baserte reporter system for relative cAMP målinger i en 384-brønnen format 32,33. Selv om denne tilnærmingen har blitt brukt av vårt laboratorium for mange studier av Gαs-koblede reseptorer, CRE-luc journalister er underlagt en rekke falske positiver og negativer under screening-analyser 34. I tillegg våre foreløpige D to sensitivitetsstudier med dette programmetmort var ikke oppmuntrende ved at vi observerte tilsynelatende tilbakemelding hemming av luciferase-signal (data ikke vist). Derfor fokuserte vi vår innsats om gjennomføringen av GloSensor cAMP-teknologi ved å bygge og karakterisere stabile cellelinjer med både sin "første" og "andre" generasjon GloSensor vektorer. Den GloSensor er en konstruert luciferase reporter inneholder en cAMP bindende nettsted innenfor luciferase protein 35. Selv om systemet er svært nyttig for kinetisk cAMP kvantifisering, metoden var ikke effektiv for måling agonist-indusert sensibilisering (Conley og Watts, upubliserte observasjoner). Vi har også utforsket en BRET basert cAMP biosensor 36 for våre studier som en kostnadseffektiv måte å vurdere cAMP opphopning. Dessverre, vil bakgrunnsstøy som er knyttet til forbigående transfektert biosensor begrenset evnen til å tilpasse denne fremgangsmåte til vår sensibilisering assay. Til slutt, vi vurderte flere kits ansette homogen tid løst fluorescence (HTRF) som en tilnærming for å måle cAMP i 384-brønnen format. Vi fant ut at dette etablert metodikk var mest forenlig med akademiske laboratorier og screening anlegg i at de var robust, følsom og stabil, og lett å bruke. Den primære ulempen for akademiske etterforskere er kostnaden av reagenser, men bulk kjøp av reagenser og miniatyrisering til 384 godt format gjør prisen mer enn konkurransedyktig med andre byggesett, inkludert ELISA baserte analyser og vår forrige "hjemmelaget" [3 H] cAMP protein bindingsanalyse 15.

Den representative Arbeidet viser anvendeligheten av den 384-brønn assay sensibilisering til studier av D-2 dopaminreseptoren indusert sensibilisering av AC-signalering i rekombinante cellelinjer. I flere forstudier, har vi brukt denne analysen med mindre modifikasjoner for å vurdere D 2 dopamin reseptor og μ opioidreseptoren indusert sensibilisering av flere AC isoformene (Tabell 1). Disse studiene markere den generelle anvendelsen av 384-brønnen analysen til flere cellelinjer, reseptorundertyper og AC isoformer. De som er interessert i å utvikle lignende assayformater ville bli oppmuntret til å utforske variabler som celletetthet, agonist forbehandling ganger, AC aktiverings protokoller / tilstander, og HTRF cAMP deteksjon metodikk for sine mobilmodeller. De antagonistiske data presentert heri demonstrerer evnen av analysen å identifisere små molekyl-inhibitorer for sensibilisering. Styrken verdiene er i overensstemmelse med de som blir fastsatt med andre funksjonelle analyser 28 samt affinitet (Ki) verdier oppnådd ved bruk av radioreceptor bindende analyser (se: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php). Den foreliggende assay utforming kan lett romme HTS innsats, hvor forbindelser blir levert via en pintool eller forhåndsbelagte i analyse ferdige plater. I tillegg til de spesifike assays som er beskrevet, skal de metoder som er benyttet her for å være anvendelig til andre adaptive analyser der flere narkotika / reagenser gjaldt før et sluttpunkt tiltak i 384-brønnen format.

Vi har forsøkt å markere viktige utviklingstrinn for hele 384-brønnen analysen, men også ønsker å være oppmerksom på at utviklingen av omvendt transfeksjon siRNA analyser var spesielt utfordrende. Vårt langsiktige mål for disse analysene er å gjennomføre et genom bred innsats for å identifisere de overlappende og unike gener involvert i heterologe sensibilisering av AC isoformer. Ved hjelp av vår innledende siRNA analysen som en retningslinje, tilbyr vi følgende forkortede forslag for å utvikle en siRNA omvendt transfeksjon analyser: (1) undersøke transfeksjon effektivitet ved hjelp av prosenter av en indikator som Siglo og transfeksjon reagens (. F.eks Lipofectamine 2000), (2) bestemme den optimale seeding tetthet (f.eks 500-5000 celler / brønn), (3) utforske transfeksjon varighet (f.eks 48 til 96 timer), og (4) å vurdere egnede analysebetingelser (f.eks narkotika treatments, endepunkt tiltak, og robuste kontroller) for å oppnå optimal signal (f.eks Z 'faktoranalyse). Ytterligere detaljer og mer generell informasjon som gjelder bruk av siRNA i screening bestrebelser kan også bli funnet i de tidligere refererte metoder artikler 29,30. De etterforskere som er interessert i HTS innsats bør også utforske tilpasning av sine analyser til automatisering (f.eks. Pintool og robotikk). I tillegg vil andre faktorer eller kontroller for screening innsats omfatter formell analysen validering, celle levedyktighet analyser, og hensiktsmessige benke skjermer. For ytterligere veiledning, ville den interesserte leser oppfordres til å undersøke NCGC analysen Guidance Manual tilgjengelig gjennom NCATS på: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/.

Vi har beskrevet vår tilnærming for å effektivisere en arbeidskrevende multiday assay til en effektiv "mix og les"-analyse som kan utføres på en enkelt dag. De metoder som er beskrevet her og enfersk studie av 1280 forbindelser i μopioid reseptor indusert sensibilisering i 1536-brønnformat 25 antyder at sensibilisering nå kan lett avhørt ved hjelp av HTS. Analysen som beskrives her er mottagelig for lite molekyl testing og kan anvendes til genetiske tilnærminger for eksempel siRNA. Vår analyse format er fokusert på det adaptive kjent som heterologe sensibilisering av AC, men kan den generelle tilnærming og metoder bli mye brukt til andre cellebaserte analyser som krever flere legemiddel og reagenstilsetning (f.eks desensitivisering og nevro.). Arbeidet rapporteres her er lett å få til i løpet av et akademisk miljø ved hjelp flerkanalspipetter og en multi-modus plate leseren i stand til å lese den ønskede endepunkt i 384-brønnen format.

Tabell 1. Cellular modeller testet for agonist-indusert sensibilisering.

Receptor AC Isoform Cellelinje Sensibilisering
signal
D 2L dopamin Endogene
(AC6 og AC7 27) 		CHO-D 2L 2-3 fold
D 2L dopamin Rekombinant AC2, AC5, og AC6 HEK 293 stabilt transfektert AC2 = 2-3 ganger
AC5 = 50 ganger
AC6 = 15 ganger
μ opioid Rekombinant AC1, AC2, og AC5 HEK 293 stabilt transfektert AC1 = 6-7 ganger
AC2 = 2-3 ganger
AC5 = 10-15 ganger

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Mr. Richard Zink og Todd Wiernicki for metodisk trening og analysen veiledning. Vi takker også John Paul Spence for grundig lesning og redaksjonelle forslag. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, og Eli Lilly and Company gjennom Lilly Research Award Program (LRAP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHO-K1-DRD2L cells DiscoveRx 930579C2
Ham’s F12 media VWR SH30026fs
Fetal Bovine Serum VWR SH3007003
G418 Sigma A1720
Hygromycin Fisher 50-230-5556
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15070063
15 cm dishes BD Falcon 353025
DMSO Sigma D2650
Cell dissociation buffer Life Technologies 13150016
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-049
Cryovials Fisher 976171
Opti-MEM Life Technologies 31985070
TC treated 384-well plates Perkin-Elmer 6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kit Cisbio Bioassays 62AM4PEB http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4 Biotek H4MLFPTAD
Prism 6 GraphPad Software NA
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
(±)Quinpirole Sigma Q111
Spiperone Sigma S7395
Clozapine Sigma C6305
Haloperidol Sigma H1512
S-(-)Sulpiride Sigma S112
Lipofectamine 2000 transfection reagent Invitrogen 11668019
Trypan blue Life Technologies T10282
Water, DNase- and RNase-free MP Biomedicals 821739
Gas siRNA Dharmacon custom siRNA
Nontargeting siRNA control Dharmacon D-001206-14-20
siGlo Red Dharmacon D-001630-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
  2. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
  3. Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
  4. Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
  5. Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
  6. Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
  7. Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
  8. Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
  9. Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
  10. Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
  11. Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
  12. Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).
  13. Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
  14. Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
  15. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
  16. Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
  17. Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
  18. Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
  19. Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
  20. Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
  21. Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
  22. Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
  23. Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
  24. Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
  25. Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
  26. Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
  27. Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
  28. Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
  29. Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
  30. Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  32. Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
  33. Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
  34. Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
  35. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
  36. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).

Tags

Bioteknologi adenylyl cyclase cAMP heterologt allergi superaktivering D2 dopamin μ opioid siRNA
Drug-induced Sensibilisering av adenylyl cyclase: Analyse Effektivisering og miniatyrisering for lite molekyl og siRNA screening programmer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conley, J. M., Brust, T. F., Xu, R., … More

Conley, J. M., Brust, T. F., Xu, R., Burris, K. D., Watts, V. J. Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications. J. Vis. Exp. (83), e51218, doi:10.3791/51218 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter