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Bioengineering

Sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: Rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siARN préalable Applications

Published: January 27, 2014 doi: 10.3791/51218
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

Summary

Activation persistante des inhibiteurs G récepteurs couplés aux protéines résultats dans la sensibilisation de la signalisation de l'adénylcyclase. Pour identifier les voies moléculaires essentiels, les approches non biaisée sont nécessaires, mais, cette stratégie nécessite le développement d'un test AMPc de sensibilisation à base de cellules évolutive. Ici, nous décrivons un test de sensibilisation pour une petite molécule et le dépistage siRNA.

Abstract

Sensibilisation de l'adénylcyclase de signalisation (AC) a été impliqué dans une variété de troubles neuropsychiatriques et neurologiques y compris la toxicomanie et la maladie de Parkinson. Activation aiguë de Gai / o-récepteurs liés inhibe l'activité AC, alors que l'activation persistante de ces récepteurs résulte en une sensibilisation hétérologue de l'AC et l'augmentation des niveaux d'AMPc intracellulaire. Des études antérieures ont démontré que cette amélioration de la réactivité AC est observée à la fois in vitro et in vivo suite à l'activation chronique de plusieurs types de récepteurs Gai / o-lié, y compris la dopamine D 2 et les récepteurs opioïdes μ. Bien que la sensibilisation hétérologue de l'AC a été signalée il ya quatre décennies, le mécanisme (s) qui sous-tendent ce phénomène restent encore largement méconnus. Le manque de données mécanistiques reflète sans doute la complexité de cette réponse adaptative, ce qui suggère que les approches non biaisée pourraient aider à identifierment les voies moléculaires impliquées dans la sensibilisation de l'AC hétérologue. Des études antérieures ont mis en cause kinase et la signalisation Gbγ comme chevauchant composants qui régulent la sensibilisation hétérologue de l'AC. Pour identifier les cibles se chevauchent uniques et supplémentaires liées à la sensibilisation de l'AC, le développement et la validation d'un dosage de l'AMPc de sensibilisation évolutive est nécessaire pour augmenter le débit. Les approches précédentes pour étudier la sensibilisation sont généralement lourdes impliquant continu entretien de culture cellulaire ainsi que d'une méthodologie complexe pour mesurer l'accumulation d'AMPc qui implique plusieurs étapes de lavage. Ainsi, le développement d'un dosage à base de cellules robuste qui peut être utilisé pour le criblage à haut débit (HTS) dans un format de 384 puits facilitera les études futures. L'utilisation de deux modèles cellulaires D 2 de récepteurs de la dopamine (par exemple. CHO-D 2L et HEK-AC6 / D 2L) nous avons converti notre test de sensibilisation de 48 puits (> 20 étapes 4-5 jours) pour un cinq-step, dosage de jour en format de 384 puits. Ce nouveau format se prête à criblage de petites molécules, et nous démontrer que cette conception de l'essai peut également être facilement utilisé pour la transfection inverse de siRNA en prévision de criblage d'une banque de siRNA ciblés.

Introduction

Un adénylylcyclase adaptatif (AC) de signalisation de réponse connu comme hétérologue-ou super-sensibilisation a été découvert dans le laboratoire du Prix Nobel, le Dr Marshall Nirenberg. Dr Nirenberg a proposé que la réactivité accrue de CA observé suite à l'activation chronique des récepteurs opioïdes δ était un mécanisme impliqué dans la tolérance aux opiacés et la dépendance 1. En plus de l'activation chronique des récepteurs opioïdes δ, cette réponse neuroadaptatif de signalisation AC se produit également après l'activation persistante de plusieurs autres Gai / o-récepteurs couplés 2. Notamment, beaucoup de ces récepteurs sont associés à la douleur, les troubles neuropsychiatriques et neurologiques, et comprennent μ / κ des opioïdes, D 2/4 de la dopamine, 5HT 1A, et M 2/4 2 récepteurs muscariniques. En plus des découvertes du Dr Nirenberg, un grand nombre de preuves existe reliant sensibilisation de signalisation AC à l'activation du récepteur opioïde chronique à la fois et in vivo 3-7. Sensibilisation des AC a également été associée à une variété de maladies impliquant les récepteurs dopaminergiques D 2 et telles que la schizophrénie y compris la maladie de Parkinson (pour une revue voir référence 2). Malgré l'importance potentielle de la sensibilisation, le mécanisme (s) précis associé avec / activation persistante Gai o-récepteur couplé qui conduit à une réactivité accrue AC reste en grande partie inconnue.

Ces études fournissent la justification de l'examen des mécanismes de sensibilisation de l'adénylyl cyclase comme une cible neurobiologique importante. De même, la pertinence physiologique de signalisation AC 8 et l'importance que les isoformes de CA individuels détiennent dans cette réponse adaptative devraient aussi être reconnus 2,9,10. Dans le cadre de notre recherche, les caractéristiques générales associées à la sensibilisation hétérologue des isoformes recombinantes de AC parallèle les caractéristiques described pour étudier les isoformes endogènes de l'AC. Plus précisément, des recherches antérieures ont montré que l'activation de Gai / o protéines et les sous-unités de la suite de presse / réarrangement sont des conditions importantes pour récepteur induite par la sensibilisation de toutes les isoformes AC. En outre, plusieurs études suggèrent que la signalisation de protéines kinases et des sous-unités Gßy sont impliqués dans la sensibilisation 2,11-13. CA individuels présentent également des motifs uniques et distincts de sensibilisation 12. Par exemple, l'exposition persistante des récepteurs D 2 agonistes est associée à une sensibilisation de AC1 et AC8 de Ca2 + stimulation / calmoduline 14,15, tandis que l'AC3 étroitement liée n'est pas sensibilisé 2. AC2, AC4, et AC7 sont étroitement liés, cependant, que l'activité de la PKC-AC2 stimulée est robuste sensibilisés après une exposition prolongée de D 2 récepteurs agonistes 7,14,16,17. En outre, AC5 et AC6 montrent un degré marqué de hetersensibilisation ologous à gaz et stimulée par la forskoline accumulation d'AMPc suite à l'activation de récepteurs D 2 14,18-20, mais semblent différer dans leur exigence de la sous-unité Gßy AC interactions 21. Bien que la plupart des études de sensibilisation AC ont utilisé des lignées de cellules modèles (par exemple des cellules HEK293 exprimant les isoformes individuelles AC), il apparaît que ces résultats traduisent par des modèles de cellules neuronales natives 4,22. Plus récemment, les effets des inhibiteurs sélectifs des isoformes de petites molécules identifiées AC dans les cellules HEK293 exprimant isoformes AC peuvent également être convertis en études comportementales in vivo 23.

L'absence d'un mécanisme moléculaire identifié pour la sensibilisation hétérologue reflète probablement la complexité de la réponse adaptative aussi bien que les propriétés uniques de la régulation individuelle des isoformes AC 12. Démêler une telle complexité est encore compliquée par l'utilisation de la méthodologie lourde tchapeau a limité chercheurs universitaires d'employer des approches impartiales. Par exemple, nos études mécanistiques précédentes impliquaient l'utilisation de modèles cellulaires cultivées en continu en utilisant 24 - et 48-bien le format de culture tissulaire 15. Les cellules cultivées ont été généralement cultivées pendant 48 h et ensuite soumis à un traitement médicamenteux agoniste (2-18 h), suivie par une série de lavages et d'incubations de cellules (figure 1). Protocoles d'accumulation d'AMPc spécifique AC-isoformes ont ensuite été utilisée suivie par la mesure de l'accumulation d'AMPc en utilisant une laborieuse et longue [3 H] AMPc méthodologie 15,24 liaison. La durée de bout en bout pour chaque dosage généralement nécessaire d'un total de quatre à cinq jours à partir de la cellule de placage à l'analyse de données (figure 1). L'application de nouvelles technologies et l'automatisation a conduit à des améliorations marquées pour les études de sensibilisation dans le milieu industriel et centre de HTS. Par exemple, un groupe de travail avec le Centre national pour Chemical génomique a rapporté deux jours une HTS procédure de dosage pour identifier des inhibiteurs de petites molécules de récepteur opioïde μ sensibilisation induite en format 1536 puits 25.

Le présent article décrit nos efforts pour développer un test HTS pour les études de sensibilisation hétérologue utilisant des technologies qui sont disponibles à la plupart des institutions de recherche universitaires. Cette stratégie a été accompli en incorporant l'utilisation de cellules congelées à partir des modèles de cellules exprimant de manière hétérologue au récepteur de la dopamine D 2, en combinaison avec les isoformes de l'adénylyl cyclase ou de recombinaison endogènes individuels (CHO-D 2L ou HEK-AC6 / D 2 L). Pour améliorer notre rendement, nous avons repensé notre test de sensibilisation de 48 puits (environ> 20 étapes sur 4-5 jours) pour un cinq-étape, le dosage de jour en format 384 puits qui était essentiellement "mélanger et lire". Le nouveau format utilise un temps homogène fluorescence disponible dans le commerce résolu (HTRF) d'essai pour mesurer l'AMPc accumulation dans des cellules intactes avec un lecteur multi-plaque de mode. Le dosage est robuste et se prêtent à criblage de petites molécules, et peut être efficacement appliqué pour cribler des inhibiteurs de la sensibilisation hétérologue. En outre, nous fournissons des données qui permet l'utilisation de ce test avec la transfection inverse de siRNA pour une large criblage d'une banque de siRNA ciblés ou de génomes avec seulement une modification mineure à l'approche générale.

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Protocol

Une. Expansion et la cryoconservation de cellules test Prêt

  1. Culture des cellules CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) les cellules d'une cellule plat 15 cm 2 de culture dans le milieu F12 de Ham additionné de 1,0 uM de L-glutamine, 800 pg / pl G418, 300 pg / hygromycine ul, 100 u / pl pénicilline, 100 pg / pl de la streptomycine, et 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
  2. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 jusqu'à ce que les cellules sont confluentes à 90-95%. Laver les cellules avec 10 pi de tampon phosphate salin (PBS), et récolter les cellules par addition de 3 ul de tampon de dissociation de cellules pendant 5 min à 37 ° C. Remettre les cellules en utilisant 12 pi de milieu de culture et compter les cellules en utilisant l'exclusion au bleu trypan.
  3. Centrifuger la suspension de cellules à 500 xg pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ul de milieu de congélation (10% de diméthyl sulfoxyde, de 90% FBS). Diluer la suspension de cellules pour obtenir la concentration cellulaire désirée (par exemple de 1 à 20 x 10 6 cellules / ul).
  4. Aliquote de 1,0 ul de solution de cellules de chaque tube cryogénique. Incuber les tubes cryogéniques dans un récipient de congélation de cellules à -80 ° C pendant une nuit. Transférer les tubes cryogéniques à un N 2 liquide réservoir pour le stockage à long terme.

2. Placage cellules Prêt dosage (et Option n º transfection)

  1. Décongeler rapidement un tube cryogénique congelé de cellules dans un bain-marie à 37 °. Une fois que les cellules sont décongelées, transférer les cellules dans un tube conique de 15 ul contenant 9 ul d'Opti-MEM, et mélanger en inversant le tube 3 à 5 fois.
  2. Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ul d'Opti-MEM.
  3. Compter les cellules en utilisant l'exclusion au bleu trypan pour déterminer la viabilité cellulaire et de diluer les cellules viables comme nécessaire (par ex. 3 x 10 5 cellules / ul de concentration) dansOpti-MEM. Planche 10 pl / puits de cellules dans une culture de tissu traitée plaque à 384 puits en utilisant une pipette multicanaux.
  4. Faire des dilutions en série de l'AMPc dans Opti-MEM pour générer une courbe standard pour estimer la production d'AMPc par les cellules (selon recommandations du fabricant - voir la section 7). Ajouter 10 ul / puits de standards d'AMPc à la plaque. Remarque: une courbe standard unique peut être préparé sur une plaque séparée ou puits vides sur l'une des plaques de dosage.
  5. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à la température ambiante, et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant 1 heure.

3. Inverser siRNA Option de transfection *

Cette section est facultative et pertinente à la figure 3.

  1. Préparer une solution de siRNA dans RNase ddH 2 O (par exemple 0,4 pmol / ul). Ajouter 5 ul à des puits individuels de plaque de 384 puits, et centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à la température ambiante.
  2. Diluer Lipofectamine 2000 à Opti-MEM par un facteur de 0,006 (par exemple, ajouter 6 pi de Lipofectamine 2000 à 1000 pi d'Opti-MEM), et mélanger par pipetage de haut en bas.
  3. Incuber la solution Lipofectamine 2000/Opti-MEM pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 5 ul de la solution diluée Lipofectamine 2000/Opti-MEM à des puits individuels de plaques à 384 puits contenant déjà des siRNA. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à température ambiante.
  4. Incuber la plaque pendant 30 min à température ambiante.
  5. cellules prêtes d'essai de plaque comme décrit ci-dessus (Section 2). Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à température ambiante.
  6. Retour plaque d'essai à incubateur humidifié à 37 ° C (5% de CO 2) pour 48-96 h déterminée pour le gène ciblé abattre (voir la discussion).

4. Petit criblage de molécules

  1. Diluer le médicament d'intérêt (inhibiteurs par exemple. Petites molécules) dans OptiMEM-6x les concentrations finales désirées. Des dilutions en série peuvent être effectuées à l'aide de pipettes à main ou une station de traitement des liquides.
  2. Ajouter 2,5 pl / puits de composé d'essai ou du tampon contenant un véhicule (par exemple DMSO) à côté des puits en utilisant une pipette multicanaux.
  3. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à température ambiante (incubation est facultative).

5. Traitement agoniste persistante

  1. Préparer un 600 nM (c.. 6 fois la concentration finale souhaitée de 100 nM) solution de quinpirole dans Opti-MEM.
  2. Ajouter 2,5 pl / puits de la solution de quinpirole 600 nM sur le côté du puits à l'aide d'une pipette multicanaux.
  3. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à la température ambiante, et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant 2 heures.

6. La stimulation de l'accumulation d'AMPc

  1. Au cours de l'incubation de 2 h, préparer les stimulatisur la solution dans Opti-MEM. La solution de stimulation se compose de 40 uM de forskoline, 2 uM de 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX), et 4 uM spiperone (toutes les concentrations de l'étape 6 sont 4x la concentration finale souhaitée).
  2. Ajouter 5 ul / puits de la solution de stimulation sur le côté du puits à l'aide d'une pipette multicanaux.
  3. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 secondes à la température ambiante, et incuber à température ambiante pendant 1 heure.

7. Trempe et estimation de l'accumulation d'AMPc

  1. La production d'AMPc par les cellules est mesurée en utilisant la trousse cAMP dynamique 2 selon les instructions du fabricant. Brièvement, reconstituer anti-AMPc-cryptate et AMPc-d2 dans de l'eau distillée. Congeler aliquotes à -20 ° C pour le stockage à court terme.
  2. Diluer une partie aliquote d'anticorps anti-AMPc-cryptate et une partie aliquote de l'AMPc-D2 séparément dans le tampon de lyse, selon les instructions du fabricant pour rendre les solutions de travail.
  3. Ajj 10 pl / puits de la solution de travail anti-AMPc-cryptate et 10 pl / puits de la solution de travail cAMP-d2 à la plaque à 384 puits en utilisant une pipette multicanaux.
  4. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 secondes à la température ambiante, et incuber à température ambiante pendant 1 heure.
  5. Lire la plaque dans un lecteur de plaque à fluorescence (réglage de l'échelle automatique de la sensibilité) en utilisant une excitation de 337 nm, et de mesurer les émissions à 620 nm et 665 nm par instructions du fabricant.
  6. Appliquer l'analyse de quotient pour évaluer l'AMPc courbe standard par les instructions du fabricant. En utilisant les valeurs obtenues, extrapoler l'accumulation d'AMPc estimé dans les puits de test en utilisant un logiciel d'analyse de données.

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Representative Results

Partie I. Le développement d'un test de sensibilisation bien hétérologue 384 pour identifier des inhibiteurs de petites molécules en utilisant un modèle de cellule disponible dans le commerce.

Pour étudier la sensibilisation hétérologue dans un modèle cellulaire, nous avons fait un certain nombre d'améliorations qui nous ont permis de rationaliser le test dans un format «mélanger et lire". Plusieurs modifications principales sont exposées ci-dessous, et sont décrits plus en détail dans la discussion. La première étape clé a été modifie notre culture cellulaire à partir de cellules cultivées en continu à 26 cellules congelées. Nous maintenant régulièrement des lots de culture de cellules qui peuvent être cryoconservés à des concentrations comprises entre 1-20 x 10 6 cellules / pl. Pour chaque dosage respectif, les stocks de cellules sont décongelées, diluées, comptées, et ensuite étalées directement dans des plaques à 384 puits. L'élimination de la nécessité d'une période de culture et en augmentant la commodité de l'analyse. Le format de notre essai de sensibilisation précédente utilisé tiss 48 puitsdes plaques de culture de ue, et participent un certain nombre de lavage, la décantation, des mesures de transfert, et un camp sur la base filtration [3 H] essai de liaison (Figure 1). Ainsi, ce format pour la sensibilisation ne se prêtaient pas à des applications à haut débit. Par conséquent, nous avons exercé des efforts importants pour rationaliser le test premier à 96 puits, puis un format 384 puits amendable à criblage à haut débit. L'optimisation élimination impliqué d'étapes et de l'évaluation de plusieurs types de plaques culture / test lavage, différentes densités cellulaires, et des périodes d'incubation différents. Nous avons également exploré plusieurs méthodes pour la détection de l'AMPc et constaté que la technologie HTRF d'AMPc bien caractérisé utilisée dans le présent protocole était hautement reproductible, fiable et très stable. Cette plate-forme de test est basé sur immunocompetition entre l'AMPc produit par les cellules et l'AMPc marqué (c'est à dire. CAMP-d2) fournis par le kit. Nous avons développé avec succès et les protocoles appliqués pour eacu hétérologuetion en format 384 puits qui sont essentiellement «mélanger et lire" (panneau de droite Figure 1).

Notre objectif initial était de générer un haut débit D 2L test de sensibilisation du récepteur à l'aide disponibles dans le commerce des cellules CHO-D 2L (humain DRD 2L, le numéro d'accès: NM_000795) qui expriment de façon endogène AC6 et AC7 27. Des cellules CHO-D 2L cryoconservés ont été étalées à 3000 cellules / puits dans une plaque de culture tissulaire à 384 puits, et ont été équilibrés pendant 1 heure à 37 ° C dans un incubateur humidifié. Les plaques ont été retirées de l'incubateur et des concentrations croissantes de l'agoniste D 2 quinpirole ont été ajoutés à température ambiante. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 2 h à 37 ° C dans un incubateur humidifié. L'accumulation d'AMP cyclique a été ensuite déclenchée par l'addition de 10 uM de forskoline (un activateur direct de courant alternatif). Le circuit tampon d'accumulation d'AMPc contenait un inhibiteur de la phosphodiestérase, l'isobutylméthylxanthine (IBMX), Ainsi que l'antagoniste D 2, la spipérone (1 uM, K i D, 2L = 0,07 nM), afin d'empêcher l'activation du récepteur D 2 résiduelle au cours de la période d'accumulation de l'AMPc. Les cellules ont été incubées à température ambiante pendant 1 heure. Le dosage a été arrêtée par l'addition d'un tampon de lyse contenant les réactifs d'AMPc HTRF. Les études ont montré qu'un prétraitement de deux heures avec quinpirole améliorée ultérieure de l'accumulation d'AMPc stimulée par la forskoline d'une manière dépendant de la dose conforme à la sensibilisation hétérologue (Figure 2A). Les résultats de cette expérience montrent que les dosages de sensibilisation peuvent être effectuées dans un format à 384 puits. Le nouveau format de dosage réduit le nombre d'étapes de plus de 20 à 4 étapes sans la nécessité de lavage ou de décantation des mesures qui en fait un "mix et lire" essai (Figure 1).

La deuxième série d'expériences a exploré si cette nouvelle analyse simplifiée pourrait être utilisé pour uné valuer inhibiteurs de sensibilisation dans le modèle CHO-D 2L. Cryoconservés CHO-D 2 cellules L ont été étalées dans une plaque de culture tissulaire de 384 à une densité de 3000 cellules / puits dans Opti-MEM. Connus D 2 antagonistes ont été ajoutés à bloquer D 2 sensibilisation induite par les récepteurs. Opti-MEM contenant 100 nM quinpirole (concentration finale) a ensuite été ajoutée jusqu'à un volume total de 15 ul, et les cellules ont été incubées pendant 2 h à 37 ° C dans un incubateur humidifié. Après l'incubation, l'accumulation de l'AMPc a été initiée par l'addition directe de la forskoline (10 uM de concentration finale), et l'essai a été interrompu et l'AMPc HTRF mesurée à l'aide. Les premiers résultats ont montré que le prétraitement par l'halopéridol ou spiperone (D prototypique deux antagonistes) complètement empêché de sensibilisation quinpirole induite par la forskoline de l'AMPc stimulée accumulation (figure 2B). Ces résultats fournissent une validation que cette approche peut être utilisée pour identifier les petitesles inhibiteurs de molécules de D 2 sensibilisation induite par les récepteurs. Dans une seconde expérience, nous avons utilisé cette méthode pour évaluer la puissance d'une série de D 2 des antagonistes de tester si ces composés inhibent la sensibilisation. Comme pour les résultats précédents, ces études ont démontré que les antagonistes inhibent D 2 agoniste de sensibilisation induite d'une manière dépendante de la dose (Figure 2C). L'ordre de classement de la puissance d'inhibition de sensibilisation était conforme à leurs actions que D 2 antagonistes des récepteurs et de leur pharmacologie décrit précédemment à récepteurs D 2 28.

Partie II. Application de la 384 puits test de sensibilisation pour la transfection inverse de siRNA dans les efforts de dépistage.

Notre prochain objectif était de développer un test de sensibilisation de 384 puits qui peut être utilisé pour effectuer la transfection inverse dépistage évolutive de la bibliothèque siRNA. Des études préliminaires ont étéréalisée en utilisant un modèle de cellules HEK exprimant hétérologue deux D 2L récepteurs de la dopamine (rat DRD 2L, le numéro d'accès: NM_012547) et AC6 (ADCY6 de rat, numéro d'accession: NC_005120) (c.-à-cellules HEK-AC6 / D 2L). Les premières expériences ont évalué la capacité de démontrer une sensibilisation induite par un agoniste de courant alternatif dans la ligne de cellules. Brièvement, les cellules AC6 / D 2L cryoconservés ont été étalées (1000 cellules / puits) dans une plaque de culture tissulaire à 384 puits. Opti-MEM contenant 1 uM quinpirole (concentration finale) a été ajouté à un volume total de 15 ul, et les cellules ont été incubées pendant 2 h à 37 ° C dans un incubateur humidifié. Après l'incubation, l'accumulation de l'AMPc a été amorcée par l'addition de concentrations croissantes de la forskoline. Le dosage a été terminée par l'addition de tampon de lyse contenant les réactifs de HTRF. Les résultats ont révélé que l'exposition de cellules à la quinpirole agoniste pendant 2 heures a conduit à une amélioration marquée de la CAM stimulée par la forskolineP accumulation (figure 3A). L'accumulation d'AMPc accrue à la fois à 100 nM et 300 nM de forskoline a été supérieure à 15 fois par rapport aux cellules traitées avec le véhicule (figure 3A).

Ensuite, nous avons utilisé des siRNA publié méthodologies 29,30 pour guider nos efforts d'optimisation qui comprenait une évaluation des diverses conditions de transfection inverse (par exemple les réactifs de transfection, l'efficacité de la transfection, la densité cellulaire, le temps d'incubation, etc.). Des études préliminaires utilisés siGloRed, un indicateur de la transfection, en combinaison avec de la Lipofectamine 2000 pour déterminer les conditions optimales de transfection inverse. Les expériences ont indiqué que 4.2 pmol siRNA / 5 ul de H 2 O combiné avec 0,03 ul de Lipofectamine 2000/5 ul d'Opti-MEM a fourni un rendement de transfection près de 95% à 72 heures, sans aucune toxicité observable dans les cellules HEK (données non présentées). Nous avons examiné ensuite l'effet de Gαs siRNA sur la sensibilisation hétérologuede la forskoline accumulation d'AMPc stimulée dans les cellules AC6 / D 2L. Le siRNA gaz a été proposé comme un contrôle positif potentiel, car Gαs a été identifié comme un élément clé de la sensibilisation hétérologue pour plusieurs isoformes AC (c.-à-AC1, AC2, AC5 et AC6) 19-21. En outre, le signal de sensibilisation de pliage 15 dans notre AC6 / D 2L modèle cellulaire (Figure 3A) fournit un signal robuste pour fenêtre de bruit pour évaluer l'efficacité de la transfection inverse. Dans les conditions décrites ci-dessus, nous avons réalisé des études préliminaires évaluant Gαs siRNA comme un contrôle positif, et nos résultats ont démontré un blocus robuste (> 90%) de la sensibilisation (données non présentées).

La réduction induite de siRNA-dramatique dans le signal de sensibilisation fournit un contrôle positif approprié pour le processus de sélection siRNA. Pour obtenir une évaluation plus quantitative pour le dépistage de siRNA de l'AC sensibilisation hétérologue, nous avons généré des données quiun facteur Z 'a été calculé pour une série de conditions d'essai en utilisant des cellules AC6 / D 2L 31. Pour cette expérience, nous avons combiné 2 pmol Gαs siRNA, ou le siRNA contrôle non ciblant, dans 5 ul avec 0,03 ul de Lipofectamine 2000/5 ul d'Opti-MEM par puits dans une plaque à 384 puits (volume total de 10 ul). Cellules congelées ont été décongelées, remises en suspension dans Opti-MEM, puis ajoutés à des puits individuels contenant mélange siRNA / Lipofectamine l'aide de plusieurs densités de cellules (c'est à dire. 500-5000 cellules/10 pl / puits). La durée du traitement quinpirole (2 h vs 18 h) ainsi que la concentration finale de la forskoline (100 à 300 nM) ont été également explorée dans notre AC6 / D 2L dosage de sensibilisation. Les résultats de ces expériences ont révélé que le facteur un solide Z 'a été obtenu dans les conditions suivantes: 750 cellules / puits, la durée de 72 h de transfection, 2 heures de traitement quinpirole, et 300 nM de forskoline pour stimuler l'accumulation d'AMPc (figure 3B). Dans ces conditions, nous avons obtenu une réponse de pliage 15 de la sensibilisation qui a été réduite de 94% en présence de siRNA Gαs (Z 'de 0,6 pour Gαs siRNA vs. contrôler siRNA).

Figure 1
Figure 1. Dans le format traditionnel, les cellules sont étalées dans un format à 48 puits et cultivées jusqu'à confluence de plus de 48 h. Le milieu de croissance est décantée, inhibiteurs de petites molécules ajoutée, suivie de l'addition de l'agoniste D 2. Après l'incubation de 2 h, les médias dosage est décanté et les cellules sont soumises à une série d'étapes de lavage / décantation. Ensuite, AC est stimulée et les cellules sont lysées. L'accumulation d'AMP cyclique est ensuite évaluée à l'aide de [3 H] Test de liaison de l'AMPc, qui est un dosage de 2 jours nécessitant une étape de filtration et comptage à scintillation. Alors que le 96 et le format élimiATED grand nombre de lavage et décantation étapes, nous avons constaté que ce format n'est pas prête facilement à HTS ou l'automatisation. Le format HTS utilise des cellules cryoconservées qui sont plaqués directement dans des plaques à 384 puits. Ces cellules congelées sont "doser prête" après une équilibration 1 h. Après cette période d'incubation initiale, inhibiteurs de petites molécules peuvent être ajoutées, suivi par l'addition de l'agoniste D 2 pour une incubation de 2 h. AC est stimulée, et les cellules sont lysées en utilisant les réactifs de détection de HTRF dans la plaque de dosage.

Figure 2
Figure 2 cellules congelées. CHO-D 2L ont été étalées directement dans des plaques de 384 puits essai à 3000 cellules / puits et équilibrés pendant 1 h. A.) Des concentrations croissantes de la D 2 agoniste, quinpirole, ont été ajoutés et les cellules ont été incubées pendant 2 heures à 37 ° C dans un incubateur humidifié. L'accumulation d'AMP cyclique est stimulée par 10 pM de forskoline (concentration finale) en présence d'IBMX spiperone et pendant 1 heure à température ambiante. La réaction a été arrêtée en utilisant des réactifs de dosage de l'AMPc HTRF (n = 1, représentatifs d'au moins 3 expériences). Les données sont exprimées en tant que réponse pour cent des cellules traitées avec le véhicule. Cellules B.) CHO-D 2L ont été prétraités en l'absence (témoin) ou la présence de D 2 des antagonistes du récepteur (c.-indiquées de spipérone ou halopéridol). Quinpirole (100 nM) a été ajouté et les cellules ont été incubées pendant 2 heures pour induire une sensibilisation. AC a été stimulée avec 10 uM de forskoline (concentration finale) pendant 1 heure à température ambiante. L'AMP cyclique a été déterminée à l'aide HTRF. Les données sont exprimées en tant que réponse pour cent des cellules traitées avec le véhicule. C.), les cellules CHO-D 2L ont été prétraités en l'absence (contrôle =100%) ou la présence d'une concentration croissante de D indiquées deux antagonistes du récepteur. Quinpirole (100 nM) a été ajouté et les cellules ont été incubées pendant 2 heures pour induire une sensibilisation. AC a été stimulée avec 10 uM de forskoline (concentration finale) pendant 1 heure à température ambiante. L'AMP cyclique a été déterminée à l'aide HTRF. Les données sont exprimées en pour cent de la réponse de sensibilisation induite quinpirole. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3
Figure 3. Cryoconservée de cellules HEK-AC6 / D 2L ont été étalées à 1000 cellules / puits et on équilibre pendant 1 heure. A.) Les cellules ont été incubées avec du véhicule ou de 100 nM quinpirole pendant 2 heures dans un incubateur humidifié. Wa ACs stimulés avec des concentrations croissantes de la forskoline pendant 1 heure à température ambiante. L'AMP cyclique a été déterminée à l'aide HTRF. B.) transfection inverse de Gαs siRNA blocs sensibilisation dans les cellules AC6 / D 2L. Gαs siRNA contrôle ou le siRNA nontargeting (2 pmol) ont été combinés avec 0,03 ul Lipofectamine2000 (Lipo) dans un volume total de 10 ul, et la solution a été ajoutée à des puits individuels dans une plaque à 384 puits. Cellules / D 2L AC6 cryoconservée ont ensuite été ajoutés pour la transfection inverse et mis en incubation pendant 70 heures à 37 ° C dans un incubateur humidifié. L'agoniste du récepteur D 2, quinpirole (1 pM final) ou du véhicule a été ajouté, suivi par une incubation de 2 h. L'accumulation d'AMP cyclique a été stimulé avec 300 nM forskoline (concentration finale) pendant 1 h et mesuré à l'aide HTRF. Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Discussion

Dans un effort pour faciliter les études de sensibilisation hétérologue, nous avons largement modifié notre méthode précédente réalisation d'un rationalisé "mélange et de lire" format qui est modifiable à criblage à haut débit et le mécanisme de l'examen de l'action. Les principales modifications apportées à notre protocole peuvent être résumées comme suit: 1) l'utilisation de cellules congelées comme réactifs "de dosage prêt"; 2) la miniaturisation de l'analyse au format 384 puits, et 3) l'utilisation de la mesure de HTRF de cAMP.

L'adoption de la cryoconservation pour nos essais à base de cellules a grandement amélioré l'efficacité et la reproductibilité de nos jours à des expériences de jour et les efforts de dépistage. Cette approche est un standard de l'industrie, et peut être facilement traduit dans la recherche universitaire réglage 26. Pour améliorer l'efficacité de la cellule culture, flacons de cellules sont utilisées comme "hors les réactifs sur le plateau" en ce que les stocks de cellules sont décongelées, dilué, puis plaqué directement sur des plaques de 384 puits for chaque dosage. Nous avons déjà incorporé cellules congelées dans des études visant à identifier les antagonistes des invertébrés protéines G récepteurs couplés 32,33. Cette méthodologie a été avantageuse en ce que le travail initial n'a pas été effectué dans notre laboratoire et a nécessité le transport de cellules en culture sur le campus qui présentent des défis et probablement introduites variabilité. Grâce à notre nouvelle approche, les cellules congelées peuvent désormais être immédiatement dégelés et dilués sur place avant le début du test. En plus d'améliorer la reproductibilité, la cryoconservation a également éliminé la période de temps de 48 h à partir de la cellule de placage à l'exécution du test (figure 1). Nous avons appliqué avec succès l'approche de la cryoconservation des études de transfection stable et transitoire en utilisant une variété de récepteurs et de sous-types de AC recombinantes avec affichages fonctionnels, y compris l'accumulation d'AMPc et le recrutement β-arrestine (Brust, TF, Ejendal, KFK, et Watts, VJ observations non publiées) . DesPite nos expériences positives à ce jour, les chercheurs doivent vérifier que leur récepteur ou cible, et le modèle du système cellulaire est compatible avec la cryoconservation avant le début de toute études à grande échelle.

Une deuxième modification qui était important pour nos efforts visant à rationaliser le test de sensibilisation élimination impliqué de décanter et laver les étapes (figure 1). Ces changements ont été concomitante avec notre miniaturisation de l'essai dans un format de 96 puits (Conley et Watts, observations non publiées). Plus précisément, un protocole de sensibilisation modifié a été conçu où l'accumulation d'AMPc a été initiée par l'addition directe de la forskoline dans un tampon de dosage suivant D 2 agoniste incubation en l'absence de toute mesure de lavage ou de décantation (voir panneau central figure 1). De plus, le tampon d'accumulation d'AMPc contient une concentration relativement élevée de spipérone (1 uM), un antagoniste D 2 qui a une valeur de Ki de 0,07 nM pour D2récepteurs 15. Cet excès de 100 fois la concentration des résultats de spipérone dans l'occupation complète du récepteur D 2 pendant la phase d'accumulation d'AMPc, ce qui empêche résiduelle D 2 l'activation du récepteur par des agonistes (par exemple, quinpirole) au cours de l'étape de la forskoline a stimulé AC 15. Cette modification a éliminé trois décanter et trois étapes de lavage après l'incubation agoniste initiale. Dans le cadre de la mise au point de format à 96 puits, nous avons également réussi à éliminer l'étape de décantation finale avant la trempe et la lyse des cellules. Cette modification a été réalisée en augmentant la concentration de notre réactif de lyse (acide trichloroacétique à-dire,. TCA) 3-9% et en ajoutant le réactif directement à la mémoire tampon d'accumulation d'AMPc. Les résultats prometteurs de l'essai de 96 puits de sensibilisation modifié fourni un appui pour la conversion de l'essai de sensibilisation à un format de 384 puits. Malheureusement, notre méthodologie précédente pour quantifier l'AMPc était un filtratio laborieux-n à base de [3 H] Essai de liaison de protéine de l'AMPc (> 5 étapes). Par exemple, le dosage est généralement achevée au cours de deux jours pour permettre le séchage du filtre et comptage à scintillation 15,24. Ces inconvénients ont fait la [3 H] protéine de liaison de l'AMPc pratique à utiliser pour un format de 384 puits à haut débit.

La troisième clé du développement est venu par incorporation de méthodologies pour mesurer et quantifier l'AMPc de manière prêtent au format 384 puits. Par exemple, nous avons une expérience significative en utilisant un élément de réponse AMPc (CRE) à base de luciférase système rapporteur pour les mesures d'AMPc par rapport à un format de 384 puits 32,33. Bien que cette approche a été utilisée avec succès par notre laboratoire pour de nombreuses études de récepteurs couplés Gαs, les journalistes de la CRE-luc sont soumis à un certain nombre de faux positifs et négatifs au cours des essais de dépistage 34. En outre, nos préliminaires D 2 études de sensibilisation avec cette applicationgardon n'étaient pas encourageants en ce que nous avons observé apparente inhibition de rétroaction du signal de la luciférase (données non présentées). Par conséquent, nous avons concentré nos efforts sur la mise en œuvre de la technologie GloSensor AMPc par la construction et la caractérisation de lignées cellulaires stables en utilisant à la fois leur «première» et «deuxième» vecteurs GloSensor génération. Le GloSensor est un rapporteur de la luciférase modifiée contenant un site de liaison de l'AMPc dans la protéine luciférase 35. Bien que le système est très utile pour la quantification cinétique AMPc, le procédé n'est pas efficace pour mesurer la sensibilisation induite par l'agoniste (Conley et Watts, observations non publiées). Nous avons également exploré un BRET base AMPc biocapteur 36 pour nos études comme un moyen rentables pour évaluer l'accumulation d'AMPc. Malheureusement, le bruit de fond associé à la biocapteur transfectées de manière transitoire limité notre capacité à adapter cette méthode à notre test de sensibilisation. Enfin, nous avons évalué plusieurs kits employant temps homogène fluor résoluescence (HTRF) comme une approche pour mesurer l'AMPc en format de 384 puits. Nous avons constaté que cette méthode établie était plus compatible avec les laboratoires académiques et de dépistage en ce sens qu'ils étaient robuste, sensible, stable, et facile à utiliser. Le principal inconvénient de chercheurs universitaires est le coût des réactifs, mais l'achat de réactifs et de miniaturisation à 384 format bien vrac rend le prix plus que compétitif avec d'autres kits, y compris des analyses basées ELISA et de notre précédente [3 H] protéine "maison" de l'AMPc dosage de 15 liaison.

Le travail représentant démontre l'applicabilité de la sensibilisation à 384 puits à des études de dosage récepteur D2 de la dopamine induite par sensibilisation de signalisation alternatif dans des lignées cellulaires recombinantes. Dans plusieurs études préliminaires, nous avons utilisé ce dosage avec des modifications mineures permettant d'évaluer D 2 récepteur de la dopamine et des récepteurs opioïdes μ sensibilisation induite de plusieurs isoformes de courant alternatif (Le tableau 1). Ces études mettent en évidence l'applicabilité générale de l'analyse de 384 puits à lignes multiples de cellules, sous-types de récepteurs, et isoformes AC. Ceux qui sont intéressés dans le développement de formats de tests similaires seraient encouragés à explorer des variables telles que la densité cellulaire, le temps de prétraitement agonistes, AC protocoles d'activation / conditions, et la méthodologie de détection HTRF AMPc pour leurs modèles cellulaires. Les données présentées ici démontrent antagonistes de la capacité de l'essai pour identifier les petites molécules inhibitrices de la sensibilisation. Les valeurs de puissance sont conformes à celles déterminées avec d'autres tests fonctionnels 28 ainsi que d'affinité (Ki) valeurs obtenues par des essais de liaison radio-récepteur (voir: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php). La conception de l'essai actuel pourrait facilement accueillir HTS efforts là où les composés sont livrés via un pintool ou sont preplated en essai plaques prêtes. En plus des tests de sensibilisation décrites, les méthodes appliquées ici devraient être applicables à d'autres annonceessais Aptive où plusieurs médicaments / réactifs sont appliqués avant à un point de mesure de fin au format 384 puits.

Nous avons tenté de mettre en évidence les étapes importantes de développement pour le dosage de 384 puits ensemble, mais veulent aussi de noter que le développement des analyses inverses transfection de siRNA a été particulièrement difficile. Notre objectif à long terme de ces essais est de procéder à un large effort du génome pour identifier les gènes qui se chevauchent et uniques impliqués dans la sensibilisation hétérologue d'isoformes AC. Grâce à notre test de siRNA initiale à titre indicatif, nous vous proposons les suggestions abréviations suivantes pour développer un siARN essais de transfection inverse: (1) examiner l'efficacité de la transfection en utilisant des rapports d'un indicateur tel que Siglo et réactif de transfection (. Par exemple Lipofectamine 2000); (2) déterminer la densité de semis optimale (par exemple 500-5000 cellules / puits), (3) d'étudier la durée de transfection (par exemple 48-96 h) et (4) d'évaluer les conditions d'essai appropriées (par exemple tr drogueeatments, les mesures de point final, et les contrôles robustes) pour la réalisation optimale du signal (analyse factorielle par exemple Z '). Plus de détails et des informations plus générales pour l'utilisation de siRNA dans les efforts de dépistage peuvent également être trouvés dans les méthodes articles déjà référencés 29,30. Ces chercheurs qui sont intéressés dans les efforts HTS devraient également examiner la capacité d'adaptation de leurs analyses à l'automatisation (par ex. Pintool et robotique). En outre, d'autres facteurs ou des commandes pour les efforts de dépistage comprennent validation formelle d'essai, des analyses de viabilité cellulaire, et des écrans de contre-mesures appropriées. Pour des conseils supplémentaires, le lecteur intéressé serait encouragé à examiner le Manuel CCRE test d'orientation disponible par NCATS à: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/.

Nous avons décrit notre approche de rationalisation d'un essai de plusieurs jours dans un laborieux efficace "mélange et de lire" dosage qui peut être effectuée en une seule journée. Les méthodes décrites ici et unétude récente de 1280 composés dans μopioid récepteur sensibilisation induite en format 1536 puits 25 suggère que la sensibilisation peut maintenant être facilement interroger à l'aide HTS. Le test décrit ici se prête à des essais à petite molécule et peut être appliquée à des approches génétiques telles que siRNA. Notre format d'essai se concentre sur la réponse adaptative appelée sensibilisation hétérologue d'AC, mais l'approche générale et les méthodes peuvent être largement appliquées à d'autres tests cellulaires nécessitant de multiples médicaments et réactifs ajouts (par exemple de désensibilisation et la neuroprotection.). Le travail présenté ici est facile à faire dans un milieu universitaire à l'aide de pipettes multicanaux et un lecteur de plaque de mode multi capable de lire le point final désiré en format de 384 puits.

Tableau 1. Modèles cellulaires testés pour la sensibilisation induite par l'agoniste.

Récepteur AC isoforme La lignée cellulaire Sensibilisation
signal
D 2L dopamine Endogène
(AC6 et AC7 27) 		CHO-D 2L 2-3 fois
D 2L dopamine AC2 recombinant, AC5 et AC6 HEK 293 transfectées de manière stable AC2 = 2-3 fois
AC5 = 50 fois
AC6 = 15 fois
μ opiacés AC1 recombinant, AC2, et AC5 HEK 293 transfectées de manière stable AC1 = 6-7 fois
AC2 = 2-3 fois
AC5 = 10-15 fois

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier M. Richard Zink et Todd Wiernicki pour la formation méthodologique et des conseils de dosage. Nous remercions également Jean-Paul Spence pour lecture attentive et suggestions d'ordre rédactionnel. Ce travail a été soutenu par l'Institut national de la santé 060 397 MH, Fondation Brain and Behavior Research, et Eli Lilly and Company à travers le Programme de bourses de recherche Lilly (LRAP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHO-K1-DRD2L cells DiscoveRx 930579C2
Ham’s F12 media VWR SH30026fs
Fetal Bovine Serum VWR SH3007003
G418 Sigma A1720
Hygromycin Fisher 50-230-5556
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15070063
15 cm dishes BD Falcon 353025
DMSO Sigma D2650
Cell dissociation buffer Life Technologies 13150016
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-049
Cryovials Fisher 976171
Opti-MEM Life Technologies 31985070
TC treated 384-well plates Perkin-Elmer 6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kit Cisbio Bioassays 62AM4PEB http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4 Biotek H4MLFPTAD
Prism 6 GraphPad Software NA
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
(±)Quinpirole Sigma Q111
Spiperone Sigma S7395
Clozapine Sigma C6305
Haloperidol Sigma H1512
S-(-)Sulpiride Sigma S112
Lipofectamine 2000 transfection reagent Invitrogen 11668019
Trypan blue Life Technologies T10282
Water, DNase- and RNase-free MP Biomedicals 821739
Gas siRNA Dharmacon custom siRNA
Nontargeting siRNA control Dharmacon D-001206-14-20
siGlo Red Dharmacon D-001630-02

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References

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