Summary
二硝基苯磺酸/ TNBS诱导的结肠炎提供了一种替代，并研究炎性肠病的病理生物学廉价的方法。在本文所讨论的协议概述DNBS的成功应用诱导结肠炎小鼠和大鼠，并允许一个深入研究宿主介导的肠道反应。
Abstract
炎性肠疾病（IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，一直与遗传基础相关联，以及最近宿主免疫应答的微生物和环境代理。二硝基苯磺酸（DNBS）诱导的结肠炎允许一个学习的IBD相关的环境触发诸如压力和饮食，潜在的疗法的效果，其作用机制底层肠道炎症及粘膜损伤的发病机理。在本文中，我们研究了在结肠粘膜的炎症反应的大鼠DNBS诱导的结肠炎的饮食的n-3和n-6脂肪酸的影响。所有大鼠饲喂相同日粮除了不同类型的脂肪酸[红花油（SO），低芥酸菜子油（CO），或鱼油（FO）]三周之前暴露于直肠内DNBS。直肠内给予乙醇对照组大鼠持续了5天的学习体重增加，而，DNBS处理的大鼠饲喂脂肪的饮食都洛吨重量FO和CO喂养大鼠48小时，大鼠经72小时受够展现显著的减肥效果。经过72小时后DNBS体重增加恢复，5天后DNBS，对FO组有较高的体重比SO或CO基团。结肠部分收集后5天DNBS处理呈局灶性溃疡，隐窝破坏，杯状细胞耗竭，以及急性和慢性炎症的细胞不同的严重程度之间饮食组的粘膜渗透。该SO喂食组表明最严重的损害随后的CO，和FO送入这表明组织损伤的温和度组。同样，结肠髓过氧化物酶（MPO）活性，中性粒细胞活性的标志是显著高于SO其次是二氧化碳喂养大鼠，具有显著降低MPO活性FO喂养大鼠。这些结果证明了使用二硝基苯磺酸诱导的结肠炎，如在该协议中概述，以确定饮食在IBD的发病机制的影响。
Introduction
炎性肠疾病（IBD）的特征是慢性复发性炎症的胃肠（GI）道，导致腹泻，体重减轻和腹部疼痛的症状。溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩氏病（CD）是IBD的两种主要形式，并且可以由炎症的位置，在胃肠道内加以区别。在UC患者中，炎症通常涉及直肠和连续了冒号在不同程度上受影响的只是肤浅的粘膜延伸。与此相反，光盘可以影响任何部分在胃肠道的，虽然它主要影响回肠和盲肠。 CD往往表现为透壁炎症常与肉芽肿有关，导致stricturing（fibrostenotic）和/或穿透（瘘管）的疾病。虽然鸡传染性法氏囊病的病因仍不清楚，但大家均认为鸡传染性法氏囊病是多因素的，包括互动的主机之间的免疫系统，遗传易感性和responSES环境和微生物因素。
迄今为止，已经提出了不同型号的IBD中显示UC和CD的特性不同的临床，组织学和免疫反应。最常用的模型包括转基因小鼠（IL-2，IL-10，SAMP / YIT），感染诱发的模型（ 柠檬酸杆菌啮齿类柠檬酸杆菌 ， 鼠伤寒沙门氏菌 ），过继转移模型（CD45 + RB高，CD62L +细胞转入SCID小鼠）和化学诱导的结肠炎模型（葡聚糖硫酸钠（DSS），三硝基苯磺酸（TNBS）和二硝基苯磺酸（DNBS））。由于其低成本和快速起效的疾病的，化学的模型被认为是非常宝贵的IBD的各方面的研究。每个列出的化学性结肠炎模型都有优点和局限性在临床，免疫学和组织病理学的相关性IBD的某些方面。 DSS是用来诱发大肠杆菌最常见的化学方法之一那朵在啮齿类动物1。 3-10％DSS（分子量：42 kDa的）的给药小鼠的饮用水7-10天可诱发症状，结肠炎的症状，包括体重减轻，腹泻带血，结肠缩短，粘膜溃疡和中性粒细胞浸润。这个模型在药物筛选研究，以及探讨上皮再生，对粘膜的动态平衡先天免疫的影响，以及炎症，促进肠道发育不良和腺癌发展中的作用机制尤其有用。然而有一些缺点，在DSS模式，包括变异在DSS的需要引起结肠炎在不同的动物设施的浓度，以及不一致的水吸收的小鼠，从而不一致暴露于DSS，导致变化的程度，范围和分布粘膜损伤和溃疡的结肠。所有这些特点导致结果的异质性，并限制各研究FR比较结果的能力OM不同的研究小组。
一种替代的DSS模型是结肠炎的半抗原诱导的DNBS或TNBS模型。这款机型采用的黏膜增敏剂DNBS或三硝基苯磺酸，稀释于不同浓度的乙醇直肠滴注。乙醇的管理是一个先决条件，打破结肠黏膜屏障以允许DNBS或TNBS渗入固有层。二硝基苯磺酸/ TNBS然后将haptenize局部结肠和肠道微生物蛋白质成为免疫原性的，从而引发宿主的先天和适应性免疫反应。在一般情况下，这种模式是有严重，有时带血腹泻，体重减轻和肠壁增厚但是症状变化取决于所用啮齿动物的种类，以及时机，剂量和暴露于DNBS或TNBS在使用的程度相关联的研究。大鼠和小鼠之间存在着重要的区别应该指出，与购买和板较低的成本，以及洛韦的好处ř体重，以减少处理每个动物的成本在体内 。这应该是设置针对结肠炎的更加迅速和严重的过程中小鼠，其中较脆弱和敏感的动物可能会很快达到一个人性化的终点。
肠道炎症最初起因于乙醇诱导损伤肠上皮细胞，从而增加上皮通透性，微生物渗入到粘膜，宿主蛋白质的haptenization，这一切导致中性粒细胞浸润，巨噬细胞和Th1型T淋巴细胞的到受损粘膜。相比于二硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸被认为是由于其在与碱，如氢氧化钠和氢氧化钾接触，可以造成爆炸的危险高度氧化性的化学危险品。因此DNBS目前被视为化学在三硝基苯磺酸的首选诱发结肠炎。在啮齿动物中，二硝基苯磺酸结肠炎被认为是最方便的方法之一，研究福卢翼鸡传染性法氏囊病相关疾病的修饰符：
- 抑郁症和结肠炎的再活化：它已经表明，压力，焦虑和抑郁在IBD患者常常与疾病复发相关联。二硝基苯磺酸结肠炎是一个合适的模型来研究抑郁症及其后果的作用对结肠炎的活化小鼠。该方法通常包括初始诱导结肠炎通过DNBS，其次是结肠炎的留下的小鼠6-8周的分辨率。小鼠，然后给予抑郁症引起药物如利血平，或嗅觉bulbectomy诱发抑郁其次是通过挑战与DNBS 2的subcolitic剂量测试他们对结肠炎激活。
- 压力和活化结肠炎：压力是一直与IBD的发病另一种常见的环境因素。有越来越多的证据机构，表明慢性应激和起病UC和CD的症状在啮齿动物之间有很强的关联š以及在人类和非人类灵长类动物3。二硝基苯磺酸结肠炎是研究结肠炎的应力相关的活化在小鼠和大鼠的良好模型。该方法通常使用在如上述的抑郁症，除了代替抑郁症类似的方式，将动物暴露于应激如声波和束缚应激4。
- 神经源性炎症：许多研究已经在肠神经系统（ENS）的结构和功能，如从动物模型和从IBD患者的组织样品中看到描述任一瞬时的或永久的改变。 DNBS是一个很好的模型，探讨炎症在ENS 5的影响，同时研究去甲肾上腺素能和胆碱能神经通路6。
- 损伤修复机制：在IBD的发病机制，宿主衍生的损伤介质如活性氧簇（ROS），一氧化氮（NO），细胞间粘附分子3（ICAM-3），和P-选择素都被示出为p躺在肠上皮破坏作用。 DNBS是研究引起的上调这些介质以及由使用选择性的药物或抑制剂的7,8调控机制修复损伤的良好模型。
- 透壁炎症：除了DNBS的上述应用中，该模型也可以用于研究在肠道的透壁炎症，在CD患者中找到一个经典特征。既DNBS和TNBS诱发的结肠炎与淋巴细胞的显著浸润有关，进入结肠黏膜使得这些模型来研究T细胞依赖的免疫机制，特别有用。
在与DSS的模型比较，DNBS和TNBS诱导的结肠炎的优点包括成本低，结肠炎的快速发展（通常需要1-3天以示重现性溃疡和发炎）和远端结肠一致的局部破坏。但其缺点是对于一个要求更高水平的技术知识，对二硝基苯磺酸/ TNBS剂量优化，以及需要麻醉直肠给药。
在此方法的论文中，我们研究了不同浓度的N-6和n-3上使用的植物油红花油（SO）的改变结肠黏膜响应DNBS诱导的结肠炎大鼠多不饱和脂肪酸的效果和低芥酸菜子油（CO）的和鱼油（FO）。它已被证明是n-6和n-3脂肪酸是肠道炎性疾病的重要介质，通过其作为细胞膜phosopholipids 9酰基部分的作用。在对比中的n-6脂肪酸的促炎细胞电位，n-3脂肪酸的酸在足够高的摄取是潜在有效的抗炎剂。为n-3脂肪酸的抗炎作用是直接通过更换花生四烯酸作为花生酸类基板的介导，通过改变proinfl的抑制花生四烯酸代谢和间接ammatory基因表达和细胞信号传导。在n-3脂肪酸也引起的resolvins，家庭中的抗炎介质。摄入大量的n-3脂肪酸与在生产中促炎细胞花生酸，细胞因子，趋化因子，活性氧和粘附分子的表达的减少有关。在这项研究中，大鼠自由进食饲料相同的所有营养物质，除了脂肪酸，具有作为从脂肪，20％的二氧化硫，20％CO，18％的鱼油加2％红花油（FO）10-11％的一个能量。作为每日能量的百分比，则SO饮食提供15％的亚油酸（LA），与<0.06％的α-亚麻酸（ALA）和无二十碳五烯酸（EPA）或二十二碳六烯酸（DHA）时，CO饮食有4.2洛杉矶％和1.9％的ALA与不含EPA或DHA和FO的饮食提供1.4％的EPA，4.9％的DHA，0.32％LA和0.12％的ALA。脂类饮食引发三周后，将小鼠给药直肠内DNBS或50％乙醇和处死5天后。该INFLammatory反应是减肥，组织学损伤评分和组织髓过氧化物酶活性的考核评估。
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Protocol
涉及动物主题程序遵循机构动物护理和使用委员会（IACUC）在英属哥伦比亚大学概述动物护理指引。
在此协议中提到的程序将用于大鼠和小鼠进行描述，而代表性的结果将从SD大鼠呈现。
1。 DNBS和直肠内给药的制备
- 为DNBS大鼠直肠滴注，新鲜制备15-30毫克DNBS/250微升50％乙醇中。对于小鼠，准备2-6毫克DNBS/100微升50％乙醇。注意：优化的确切DNBS的浓度在每个设施来进行给药。雄性Sprague-Dawley大鼠，小鼠和C57BL / 6小鼠是优选用于诱导DNBS结肠炎，然而其他小鼠和大鼠品系都可以使用。小鼠和大鼠只用50％乙醇处理，可作为对照组却给出乙醇的影响是轻微的或不存在，可以OMIt为纳入本组的研究12。
- 附加1ml注射器给19号针头，其具有聚乙烯导管（PE-90 - 大鼠或PE-50 - 小鼠）固定到其末端。
- 轻轻麻醉在加热垫的大鼠或小鼠休息（ 例如，通过经鼻锥给予1.5％异氟醚，动物应该还是有眨眼和吞咽反射和显示定时呼吸）。适用撕裂凝胶它的眼睛，避免眼睛干燥。
- 轻轻涂抹用指尖压力施加到动物的后端，以消除任何粪便可存在于远端结肠。
- 轻轻插入导管直肠，与导管达到大约8 cm肛门近端大鼠或小鼠3-4厘米。注入少量溶液的同时插入导管，以润滑，允许更容易地插入。注：如果同时插入导管任何感觉到阻力，不要继续插入，因为这可能导致穿孔肠壁。取出导管并尝试重新插入轻轻，再次润滑冒号作为诉讼。
- 慢慢地注入250（只）或100（小鼠）微升DNBS的，或等体积或50％乙醇的控制。注射DNBS后，放置90秒的动物头低位，以避免DNBS的损失。
- DNBS给药后，给动物喂食8％的蔗糖水0.2％的盐水，以防止在第一周脱水。
- 仔细观察动物，每天监测体重下降和脱水或痛苦的实验期间的迹象。注：减肥可迅速接近最大允许的减肥廉署建议。因为这大部分是从脱水而得，体重减轻应该被用作用于管理乳酸林格氏液来限制脱水的指标。请务必与健康问题的适当设施兽医咨询。
2。合作llecting组织和评估DNBS攻击小鼠组织学损伤
- 在与DNBS攻击后所需的时间点，通过与异氟醚麻醉室补充足够的氧气过量安乐死的动物。观察动物直至不再上升或下降的胸部被看见，并且没有可触知的心跳。确认动物已被正确地缺乏应对脚趾捏或角膜的感人，其次是颈椎脱位处死。
- 打开腹腔，取出整个大肠。纵向打开肠;宏观粘膜溃疡应观察从大鼠结肠（2-3厘米的小鼠）的前端约5-6厘米近端。注：去掉大肠后，如果需要评估的宏观损伤分数。从对照组动物相应的解剖位置收集结肠段。注：个人得分的组织进行宏观损伤分数应蒙蔽到各治疗组的身份。严重程度和溃疡的程度（0-10），总结与分数缺席或腹泻的存在（0或1），粘连（0，1或2）和最大结肠壁厚：使用以下或类似标准得分的组织切片以毫米为单位11。
- 收集0.5厘米部分近端的最大宏观损伤的部位。急速冷冻在液氮中10.5厘米部到后评估的髓过氧化物酶（MPO）活性（中性粒细胞浸润的测量），并放置在10％中性缓冲福尔马林中用于组织学分析的其他部分。注意：快速冷冻组织中髓过氧化物酶测定法可以储存在-80℃下长达1个月。
- 允许在步骤2.3收集组织学分析的组织以福尔马林中固定过夜，然后洗净用70％乙醇。在石蜡中嵌入组织，并切成所需厚度（3-5微米），染色用苏木精和伊红（HE）进行组织学评分。 有两个观察者评分从各动物在光学显微镜下至少3的组织切片，以确定组织学损伤评分为每个组。注：个人得分的组织进行组织学损伤分数应失明的治疗组的身份。炎症性细胞浸润的程度（0 =不存在，3 =透壁），粘膜结构的损耗（0 =不存在，3 =重度），存在或不存在隐窝脓肿（0-1）：利用以下或类似标准得分的组织切片以及杯状细胞耗竭（0-3）。确定组织学损伤评分为这些分数11的总和。
3。上DNBS表演髓过氧化物酶（MPO）含量挑战肠组织
- 检测MPO活性在步骤2.3中获得的0.5厘米结肠段。均匀化在MPO匀浆缓冲液的组织（0.5％十六烷基三甲基溴化铵在50mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0）），得到50毫克结肠segmeNT /毫升匀浆缓冲液悬浮。
- 在10000等分的匀浆溶液为1毫升，离心分离机，在4℃下进行2分钟×克。
- 混合100μl的各等分试样的2.9毫升50含有邻dianisidinedihydrochloride的0.167毫克/毫升和0.0005％过氧化氢在反应杯mM磷酸盐缓冲液（pH 6.0）。
- 测量吸光度，用分光光度计在460nm处的速率。注意：MPO活性定义为酶的降解的H 2 O 2 1微摩尔/分钟至H 2 O在室温下的数量，然后用每组织毫克单位。
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Representative Results
大鼠（的Sprague-Dawley）或小鼠（C57BL / 6）与二硝基苯磺酸的挑战通常会导致瞬时体重减轻，腹泻，有时与存在于粪便血。然而，因素如遗传，饮食和肠道菌群可以修改易感性二硝基苯磺酸诱导的结肠炎。因此，包括在实验动物应来自同一机构，在本地衍生或从一个动物供应商订购的。所有的动物都应该为减肥而苦恼结肠炎期间遭受症状的程度进行认真的监测。
在图1-4中给出的结果表示在其中三个膳食油的影响的实验：红花油，菜籽油，和鱼油对所得到的二硝基苯磺酸结肠炎的严重程度进行评估。组间统计学差异用ANOVA随后事后Tukey检验，使用数据分析软件程序来确定。为<0.05 P值是considered显著。
以下用二硝基苯磺酸（20毫克DNBS/250微升50％乙醇），直肠内的挑战，观察到显著重量损失48小时的大鼠补充了FO和CO和72小时的大鼠补充有SO（P <0.05）。最大重量损失在大鼠补充与CO和SO看到在48小时大鼠补充FO和72小时。 72小时后体重增加恢复，5天后DNBS，FO和SO组显示体重相似的基线值。对照组大鼠辅以饮食和挑战与直肠乙醇继续长胖了5天的研究期间。
引起的DNBS的肠损伤可以是普遍，然而的最大损害的面积一般是本地化的远侧6厘米大鼠的结肠，远端3厘米的小鼠。宏观此可以观察到结肠壁增厚，粘膜溃疡，和在dist偶尔粘附人结肠至邻近器官，如膀胱。仔细学评价，广泛的上皮损伤，在某些地区导致溃疡，免疫细胞浸润（主要是中性粒细胞和淋巴细胞），窦炎，粘液枯竭，形成水肿观察。虽然炎症和组织损伤的这些组织学迹象是明显的在所有三个膳食补充油基团在与DNBS挑战，其中最严重的损害被认为是红花油组，随后是低芥酸菜子油基中，而大鼠鱼油组中表现出最小的上皮损伤和炎症细胞的有限渗透到粘膜（ 图2）。
在组织学损害区别可以被量化，以便群体之间更好的比较。用于评价组织学损害的标准包括炎性细胞浸润，粘膜结构的损失，杯状细胞耗竭，和密码学的存在的程度吨脓肿。 如图3所示，是组织学损害分数在二硝基苯磺酸结肠炎三个膳食油基团。如可见于图2中的H＆E染色的切片中，红花油补充组具有损伤的最大程度，接着是低芥酸菜子油基，而鱼油组显示出最少量的破坏。
炎症性细胞浸润的程度特别的嗜中性粒细胞，可以通过执行髓过氧化物酶（MPO）活性测定法作进一步研究。 MPO被认为是炎症的标志物，因为它是在嗜中性粒细胞和骨髓系的其他细胞的颗粒中发现的酶。在MPO后第5天DNBS曝光活性在大鼠结肠的评估显示增加了活动的所有三组（ 图4）。最大的MPO活性的红花油组，随后是低芥酸菜子油基团中观察到的，而最低的MPO活性被认为是在鱼油组中，对应于组织学损伤评分在图3中进行评估。
图1。体重变化（基线％）以下的50％乙醇（控制），或在成年雌性SD大鼠喂食SO，CO或FO二硝基苯磺酸（DNBS）（250-500克）直肠内给药，大鼠是那么对于身体消瘦从第1天到第5天治疗后的监测。体重的百分比损失暗算后DNBS治疗天。值是平均值±SEM，N = 5 /组。相较于非DNBS对待同行，大鼠与CO和FO喂早一天1篇文章DNBS治疗有显著减少其初始体重，而在第3天的所有三组大鼠有SIG相对于基线体重（P <0.01）着的减肥效果。所有结肠炎组展示体重增加72小时后，用体重恢复到基线的FO和SO喂养组。在乙醇对照组大鼠表现出体重增加超过5天的研究期间。 点击这里查看大图 。
图2。具有代表性的H＆E染色结肠组织切片的50％乙醇的直肠内给药（CTL）或DNBS到成年雌性大鼠后5天的组织学外观送入SO，CO，或FO的组织被收集在10％福尔马林，并使其固定为最小24小时，随后组织切片和HE染色。该从大鼠组织切片喂食SO和CO展示了不同上皮损伤程度上皮的完整性显著破坏，隐窝辍学，溃疡形成和透免疫细胞浸润，可见有与SO更为显着的变化。在CO喂养的老鼠，上皮再生和恢复原状的证据能够被看见。与此相反，大鼠喂食FO维持上皮完整性和有炎症细胞局限在固有层的有限浸润。 （M-黏膜，SM-亚黏膜和U-溃疡;原来的放大倍数100倍;标尺：100微米）。 点击这里查看大图 。
图3。组织学损伤评分结肠组织5天50％乙醇（清晰条）或DNBS（实心棒）成年雌性大鼠折后直肠内给药喂二氧化硫，一氧化碳，或FO。组织切片进行评分由经验丰富的调查员，失明的治疗方法，使用基于组织了一组标准损伤。用于该研究的标准包括：炎症细胞浸润（0 =不存在，3 =透壁），粘膜完整性的丧失（0 =不存在，3 =严重），隐窝脓肿形成（0 =无，1 =有）杯状细胞耗竭（0 =无，3 =高）。组织学损害得分确定为通过计分最低从每只动物3片组织切片得到的分数的总和。结果清楚地表明在FO喂养大鼠降低的病理损害时相比，SO和CO喂养大鼠。值是平均值±SEM，N = 5 /组。与各自的乙醇对照组相比，DNBS管理与损害评分（P <0.05）显著增加有关;结肠炎组，不同的符号显著差异（P <; 0.01） 点击此处查看大图 。
图4。在结肠组织中的50％乙醇（清晰条）或二硝基苯磺酸（实心棒），以供给SO，CO，或FO成年雌性大鼠的直肠内给药后5天的MPO活性。发炎的结肠组织被快速冷冻在液氮中，并测定髓过氧化物酶活性如粒细胞浸润的指标。结肠炎大鼠喂食FO秀降低MPO活性相比，SO和CO。值为平均值±标准差，N = 5 /组。与相应的乙醇对照组相比，给药DNBS与在MPO活性（P <0.001）显著增加相关联;结肠炎组具有不同的码元是significantlŸ差异（P <0.05）。 点击这里查看大图 。
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Discussion
在这个协议中描述的DNBS模型是可以用来研究IBD的各个方面是有价值的，廉价的，重现性结肠炎模型。当给药直肠内给大鼠或小鼠，二硝基苯磺酸诱导的炎症和组织损伤的结肠相当程度，类似人类克罗恩病中的它的各种组织学特征，包括多形核细胞的浸润透和主要的NF-κB依赖Th1细胞的活化期。
该模型已被用于研究认为对IBD的影响，如紧张，抑郁，和饮食，以及肠神经系统受累，损伤修复机制，透壁炎症，临床前治疗的各种因素。的DNBS模型也是合适的替代品，以在小鼠和大鼠TNBS诱导的炎症，并提供一个较为便宜的替代性结肠炎的其它通常使用的化学模型，例如DSS。在这个P列出的步骤rotocol将允许一个成功执行这种模式。
符合结肠炎13-16其它实验模型，目前的研究加强食物中的脂肪对肠黏膜免疫反应，其中大量摄入EPA和DHA的消耗之前和之后DNBS曝光衰减变量的影响，而高摄入量的ARA以最小的n -3脂肪酸加剧了结肠炎。在这项研究中观察到饲料中n-3脂肪酸的有益效果是，部分原因为n-3脂肪酸既通过抑制合成从洛杉矶的ARA，并通过与EPA和DHA ARA更换有效地降低组织磷脂ARA。这种变化转变为可用版本和后续类花生酸合成朝着促炎较少的环境中脂肪酸底物。与此相反，高摄入的n-6脂肪酸与高结肠ARA与随后合成那些使粘膜免疫应答促炎介质的关联。在坚持着我们最近的研究中啮齿类柠檬酸杆菌诱导的结肠炎克，老鼠喂食菜籽油比红花油ARA少，但用n-3 ALA和不含EPA或DHA有一个中间的炎症反应16。
有迹象表明，可以在成功实施DNBS模型的影响的几个关键步骤。不同的研究使用不同DNBS的浓度范围为3-6毫克/鼠标或15-30毫克/大鼠建立结肠炎。因此，对于个别研究者优化DNBS的用量为他们的研究中，由于最佳的剂量可以变化从一个动物设施中的其他是很重要的。同样重要的是要注意，DNBS的浓度将根据动物的该调查员使用（例如：某些菌株可能更容易和他人DNBS更耐）的类型和种类不同。应注意，以确保DNBS的浓度不太高，因为这可能会导致动物迅速死亡RESU从肠穿孔和败血症lting。另一个关键步骤，使用该模型被开发用于直肠内导管插入到该动物的远端结肠适当的方法。粪便在结肠的存在可阻止滴注期间导管的适当插入。为了避免这种情况，轻轻施加压力，在轻轻麻醉小鼠的肛门后端，以消除任何粪便在结肠/直肠。建议在插入导管从肛门约3-4厘米，但它可以扩展到最多6-8厘米，直到大鼠脾曲（横，降结肠之间的急弯）7。要注意，在滴注过程中，通过注入二硝基苯磺酸/乙醇在小体积将使导管更容易地插入润滑导管是重要的。为了避免DNBS的逆行回流出来的肛门，关键是要保持这些动物在90秒的头部向下的位置或备选地，老鼠可以保持15分钟的垂头仰卧位（其中脚放在高过头顶15-30°仰卧位）。
组织可以收集在选定的时间点取决于研究者的利益，该项研究的重点是急性或慢性炎症。另外，组织也可以被用来研究肠ENS和先天免疫和适应性免疫系统。然而，它是必不可少的，以确保组织被正确采样。建议将收集在10％福尔马林的量充裕组织在5毫升的小瓶，而不是更小体积的小瓶以确保正确固定。样品的适当固定是一个关键研究目标分子在这两个组织中的病理损伤和可视化由H＆E和免疫染色，分别。组织病理评分应该谁是失明的实验条件有经验的人来执行，使用经t设置固定标准他个人调查11,17。髓过氧化物酶（MPO）作为炎症，组织损伤和中性粒细胞浸润进入胃肠组织11的一个良好标志物。要执行MPO分析，建议以急速冷冻在液氮中，并在分析当天的组织，建议用新鲜配制的缓冲和解决方案，努力取得最好的和最准确的结果。该模型也可以用于研究炎性细胞浸润肠腔，涉及趋化炎症细胞及参与活化和所涉及的组织损伤等炎症介质以及参与调节介质的释放的各种途径和轮回的机制炎症反应和组织修复。
目前被使用免疫抑制药物或只针对一种促炎细胞因子如TNF-α的临床缺点应该鼓励investigators开发更好的治疗策略来管理IBD患者。模型，如DNBS模式，允许调查人员提高我们的IBD的发病机制的认识，有可能发现新的治疗靶点和开发/完善战略，通过采用新颖的炎症途径和新疗法控制炎症。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由运营补助KJ从加拿大自然科学和工程研究理事会（NSERC）和克罗恩和加拿大结肠炎基金会（CCFC）的支持。 VM由CFRI奖学金和GB从加拿大卫生研究院（CIHR）的毕业生奖学金支持。 BAV是儿童肠道和肝脏疾病儿科IBD的研究和加拿大研究主席在儿科胃肠病学和KJ基金会（儿）主席是儿童和儿童与家庭研究所（CFRI）临床科学家奖励计划所支持的高级临床科学家，加拿大英属哥伦比亚大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 19 G Needle | BD Biosciences | 305187 | |
| Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intrarectal administration in mice |
| Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intrarectal administration in rat |
| DNBS | MP Bio | 150959 | |
| Tear gel | Novartis | 63601662596 | |
| 10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| Warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
| Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
| Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
| Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
| o-Dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
| 30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
| Spectrophotometer | BioRad | Benchmarker Plus | |
| Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
| Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | www.graphpad.com |
References
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