التصوير MALDI الكتلة الطيفي للتحقيق في المستقلبات في<em> Medicago truncatula</em> الجذر العقيدات
Summary
الكتلة الطيفي التصوير (MSI) هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لاكتشاف وتحديد الأنواع الكيميائية المختلفة في أنسجة سليمة، والحفاظ على المركبات في بيئاتها المحلية، والتي يمكن أن توفر رؤى جديدة في العمليات البيولوجية. هنا يتم وصف أسلوب MSI وضعت لتحليل جزيئات صغيرة.
Abstract
معظم التقنيات المستخدمة لدراسة الجزيئات الصغيرة، مثل العقاقير الدوائية او نواتج الذاتية، وتوظيف مقتطفات الأنسجة التي تتطلب تجانس الأنسجة من الاهتمام التي يمكن أن تسبب تغيرات في المسارات الأيضية التي تجري دراستها 1. الكتلة الطيفي التصوير (MSI) هو أداة تحليلية قوية التي يمكن أن توفر المعلومات المكانية من analytes داخل شرائح سليمة من عينات الأنسجة البيولوجية 1-5. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة أنواع مختلفة من المركبات بما في ذلك البروتينات والببتيدات، والدهون، والجزيئات الصغيرة مثل الأيض الذاتية. مع بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين (MALDI) MSI، التوزيعات المكانية من نواتج متعددة في وقت واحد يمكن اكتشافه. هنا، يتم تقديم وسيلة وضعت خصيصا لإجراء التجارب غير مستهدفة الايض MSI على جذور البقوليات والعقد الجذرية التي يمكن أن تكشف عن نظرة ثاقبة العمليات البيولوجية التي تحدث. الالطريقة المعروضة هنا يبين سير العمل MSI نموذجي، من إعداد العينات إلى الحصول على الصور، ويركز على خطوة تطبيق المصفوفة، مما يدل على تطبيق عدة تقنيات المصفوفة التي هي مفيدة للكشف عن جزيئات صغيرة. مرة واحدة يتم إنشاء الصور MS، ويناقش تحليل وتحديد نواتج الأيض من الاهتمام وبرهن. سير العمل القياسية المعروضة هنا يمكن تعديلها بسهولة لأنواع مختلفة الأنسجة، والأنواع الجزيئية، والأجهزة.
Introduction
مجال متزايد من الايض العديد من التطبيقات البيولوجية الهامة بما في ذلك اكتشاف العلامات البيولوجية، فك رموز المسارات الأيضية في النباتات وغيرها من النظم البيولوجية، وعلم السموم التنميط 4،6-10. ويتمثل أحد التحديات التقنية الكبرى عند دراسة النظم البيولوجية هو دراسة مسارات metabolomic دون تعطيل لهم 11. MALDI-MSI يسمح للتحليل المباشر للأنسجة سليمة تمكن من analytes كشف حساسة في أجهزة احد 12،13 وحتى 14،15 الخلايا واحد.
إعداد نموذج هو خطوة حاسمة في إنتاج الصور الطيفية الشامل استنساخه وموثوق بها. جودة الصور تعتمد إلى حد كبير على عوامل مثل الأنسجة التضمين المتوسطة، شريحة سمك، MALDI مصفوفة، وتقنية تطبيق المصفوفة. لتطبيقات التصوير، قسم مثالية سمك هو العرض من خلية واحدة (8-20 ميكرون اعتمادا على نوع العينة). يتطلب MALDI ترسب عضوي، غلوبولين العدسةه مصفوفة مركب، وعادة حمض ضعيف، على عينة لتحليلها ومساعدة الاجتثاث التأين. توفير 16 مصفوفات مختلفة كثافات مختلفة إشارة، أيونات التدخل، والكفاءة التأين من فئات مختلفة من المركبات.
تقنية تطبيق مصفوفة يلعب أيضا دورا في نوعية الصور الطيفية الشامل والتقنيات المختلفة المناسبة لفئات مختلفة من التحاليل. يتم عرض ثلاثة أساليب تطبيق المصفوفة في هذا البروتوكول: البخاخة، بخاخ التلقائي، والتسامي. وقد استخدم على نطاق واسع البخاخة تطبيق مصفوفة في مجال التصوير MALDI. ميزة البخاخة تطبيق مصفوفة هو أنه سريع نسبيا وسهلة. ومع ذلك، فإن نوعية تطبيق مصفوفة البخاخة يعتمد إلى حد كبير على مهارة المستخدم ويميل إلى أن يكون أقل استنساخه وتسبب نشر التحاليل، خصوصا جزيئات صغيرة 17. نظم الرش التلقائي ديك ميكانيكا مماثلة لالبخاخة تطبيق مصفوفة، ولكن هفه تم تطويرها لإزالة التباين ينظر مع دليل تطبيق البخاخة، مما يجعل من رذاذ أكثر استنساخه. هذا الأسلوب يمكن أن يكون في بعض الأحيان أكثر تستغرق وقتا طويلا من التقليدية البخاخة تطبيق المصفوفة. كلا البخاخة اليدوية وأنظمة الرش التلقائي وسائل تطبيق مصفوفة المذيبات. التسامي هو جاف مصفوفة تقنية التطبيقات التي أصبحت أكثر وأكثر شعبية للتصوير الطيفي الشامل من المركبات والجزيئات الصغيرة لأنها تقلل الحليلة نشرها، إلا أنها تفتقر إلى ما يلزم من المذيبات لاستخراج ومراقبة المركبات الشامل أعلى 18.
تحديد واثق من المركبات عادة ما يتطلب قياسات دقيقة الشامل للحصول على هويات المفترضة تليها جنبا إلى جنب الشامل (MS / MS) للتحقق من صحة التجارب، مع MS / MS الأطياف يجري مقارنة للمعايير والأدب، أو أطياف النظرية. في هذا البروتوكول عالية الدقة (حل شامل قوة 60،000 في م / ض 400)، اللوني السائل (ويقترن LC)-MS لMALDI-MSI إلى الحصول على كل المعلومات المكانية والتعرف على ثقة من نواتج الأيض الذاتية، وذلك باستخدام Medicago truncatula الجذور والعقد الجذرية مثل النظام البيولوجي. تجارب MS / MS يمكن القيام بها مباشرة على النسيج مع MALDI-MSI أو على مقتطفات الأنسجة مع LC-MS وتستخدم للتحقق من هويات الأيض.
يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة لرسم خريطة نواتج الأيض الذاتية في M. truncatula، والتي يمكن تكييفها وتطبيقها على MSI من الجزيئات الصغيرة في مختلف أنواع الأنسجة والنظم البيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما نوقش أعلاه، وإعداد العينات هي الخطوة الأكثر أهمية في سير العمل MSI. سوف تضمين الأنسجة بشكل غير متساو تسبب باجتزاء ليكون من الصعب أو غير الممكن في بعض الحالات. حجم القسم والوقت الكافي موازنة ضرورية للحفاظ على سلامة الأنسجة وتجنب للطي والدموع. واختيار مصفوفة وتقنية ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه الدكتور جان ميشيل مرة في قسم الهندسة الزراعية في جامعة ويسكونس ماديسون لتقديم عينات truncatula Medicago. وأيد هذا العمل في جزء من التمويل من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) منحة CHE-0957784، ومدرسة جامعة ويسكونسن العليا ومؤسسة ولاية ويسكونسن الخريجين بحوث (وارف) وبرنامج زمالة Romnes بحوث كلية (ليرة لبنانية). يقر EG زمالة أبحاث الدراسات العليا NSF (DGE-1256259).
Materials
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25-75-0.8 mm (width-length-thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1×10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
- Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, 130-145 (2013).
- Ye, H., Gemperline, E., Li, L. A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics. Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).
- Wei, R. Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry. Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).
- Kobayashi, T., et al. A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer. Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).
- West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics. Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).
- Spegel, P., et al. Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release. Biochem. J. 450, 595-605 (2013).
- Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics. J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).
- Prell, J., Poole, P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).
- Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation. Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).
- Stemmler, E. A., et al. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).
- Neupert, S., Predel, R. Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect. Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).
- Northen, T. R., et al. Clathrate nanostructures for mass spectrometry. Nature. 449, (2007).
- Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Chen, S., et al. 2,3,4,5-Tetrakis(3′,4′-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).
- Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
- Shroff, R., Svatos, A. Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).
- Shimma, S., Setou, M. Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).
- Paschke, C., et al. Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).
- Parry, R. M., et al. omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).
