Summary
ההדמיה ספקטרומטריה (MSI) היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בם כדי לגלות ולזהות תרכובות כימיות שונות ברקמות שלמות, שמירה על התרכובות בסביבות האם שלהם, אשר יכול לספק תובנות חדשות על תהליכים ביולוגיים. להלן שיטת MSI פיתחה לניתוח של מולקולות קטנות, הוא תאר.
Abstract
רוב הטכניקות המשמשות ללמוד מולקולות קטנות, כגון תרופות סמים או מטבוליטים אנדוגני, להעסיק תמציות רקמה הדורשות הומוגניות של הרקמות של עניין שעלול לגרום לשינויים במסלולים מטבוליים נחקרים 1. ההדמיה ספקטרומטריה (MSI) היא כלי אנליטי רב עוצמה שיכול לספק מידע המרחבי של analytes בתוך פרוסות שלמות של דגימות רקמה ביולוגיות 1-5. טכניקה זו נעשתה שימוש נרחב ללמוד סוגים שונים של תרכובות כוללים חלבונים, פפטידים, שומנים, ומולקולות קטנות, כגון מטבוליטים אנדוגני. עם desorption / יינון לייזר בסיוע מטריקס (MALDI)-MSI, הפצות המרחבי של מטבוליטים רבים ניתן לאתר בו זמנית. בזאת, שיטה שפותחה במיוחד עבור ביצוע ניסויי MSI metabolomics לא ממוקדים בשורשי קטניות וגושי שורש מוצגת שיכול לחשוף תובנות התהליכים הביולוגיים המתרחשים.שיטה שהוצגה כאן מראה זרימת עבודה MSI טיפוסית, מהכנת מדגם לרכישת תמונה, ומתמקדת בשלב יישום מטריקס, הוכחת כמה טכניקות יישום מטריצה כי הם שימושיים לאיתור מולקולות קטנות. ברגע שהתמונות של הטרשת הנפוצה שנוצרו, הניתוח וזיהוי של מטבוליטים של העניין נדון והפגינו. זרימת העבודה סטנדרטית שהוצגה כאן ניתן לשנות בקלות לסוגי רקמות שונים, מינים מולקולריים, ומכשור.
Introduction
השדה הולך וגדל של metabolomics יש יישומים ביולוגיים חשובים רבים, כולל גילוי סמן ביולוגי, פענוח מסלולים מטבוליים בצמחים ומערכות ביולוגיות אחרות, ופרופיל טוקסיקולוגיה 4,6-10. אתגר טכני עיקרי כאשר לומדים במערכות ביולוגיות הוא ללמוד מסלולי metabolomic מבלי לשבשם 11. MALDI-MSI מאפשר ניתוח ישיר של רקמות שלמות המאפשר זיהוי רגיש של analytes באיברים בודדים 12,13 ואפילו תאים בודדים 14,15.
הכנת מדגם היא צעד חיוני בייצור דימויי רפאים המוניים לשחזור ואמינים. האיכות של התמונות מאוד תלויה בגורמים כגון בינוני רקמות הטבעה, עובי פרוס, מטריקס MALDI, ויישום טכניקת מטריצה. עבור יישומי הדמיה, עובי סעיף אידיאלי הוא הרוחב של תא אחד (8-20 מיקרומטר תלוי בסוג המדגם). MALDI דורש תצהיר של אורגני, Crystallinמתחם מטריצת דואר, בדרך כלל חומצה חלשה, על המדגם כדי לסייע אבלציה ויינון אנליטי. 16 מטריצות שונות מספקים עוצמות שונות אות, יונים מפריעים, ויעילות יינון של סוגים שונים של תרכובות.
טכניקת יישום המטריצה גם משחקת תפקיד באיכות של מסת תמונות רפאים וטכניקות שונות מתאימים לסוגים שונים של analytes. שלוש שיטות יישום מטריצה מוצגות בפרוטוקול זה: מברשת אוויר, מרסס אוטומטי, ומראה. יישום מטריצת Airbrush כבר בשימוש נרחב בתחום ההדמיה MALDI. היתרון של יישום מטריצת מברשת אוויר הוא שזה הוא יחסית מהיר וקל. עם זאת, האיכות של יישום מטריצת airbrush מאוד תלויה במיומנות של המשתמש ונוטה להיות פחות לשחזור ולגרום לדיפוזיה של analytes, במיוחד מולקולות קטנות 17. יש מערכות מרסס אוטומטיות מכניקה דומה לairbrush יישום מטריצה, אבל havדואר פותחו כדי להסיר את ההשתנות ראו עם יישום airbrush ידני, מה שהופך את ספריי לשחזור יותר. שיטה זו יכולה לפעמים להיות יותר זמן רב יותר מאשר יישום מטריצת מברשת האוויר מסורתי. שני airbrush הידני ומערכות מרסס אוטומטיות שיטות יישום מטריצה ממיסים מבוססות. העידון הוא טכניקת יישום מטריצה יבשה שהופכת יותר ויותר פופולרי עבור ההדמיה ספקטרלי המונית של מטבוליטים ומולקולות קטנות משום שהיא מפחיתה דיפוזיה אנליטי, עם זאת, היא חסרה את צורך ממס כדי לחלץ ולבחון תרכובות מסה גבוהות יותר 18.
זיהוי בטוח של מטבוליטים בדרך כלל דורש מדידות מסה מדויקות כדי להשיג הזדהויות המשוערות אחריו מסת טנדם ניסויים (MS / MS) עבור אימות, עם MS / MS ספקטרום שהשוואה לסטנדרטים, ספרות, או ספקטרום תיאורטי. , כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציה גבוהה פרוטוקול זה (מסת פתרון כוח של 60,000 במ '/ z 400) (LC)-MS הוא מצמידים את MALDI-MSI לקבל גם מידע במרחב ובהזדהויות בטוחים של מטבוליטים אנדוגני, באמצעות Medicago truncatula שורשים וגושי שורש כמערכת הביולוגית. ניתן לבצע ניסויי MS / MS ישירות על הרקמה עם MALDI-MSI או על תמציות רקמה עם LC-MS ומשמשים לאימות של הזדהויות המטבוליט.
פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה למפה מטבוליטים אנדוגני בתוך: מ ' truncatula, אשר יכול להיות מותאם ומיושם על MSI של מולקולות קטנות בסוגי רקמות שונים ומערכות ביולוגיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מכשור
- MSI MALDI-TOF/TOF. השתמש ספקטרומטר מסה מצויד במקור MALDI לניתוח של מולקולות קטנות (ראה טבלה של חומרים / ציוד). לבצע רכישות במצב יון חיובי או שלילי בהתאם לanalytes של עניין. ציין טווח המוני של עניין ולאסוף 500 יריות / כתם לייזר ב50 מיקרומטר מרווחים בשני x והממדים y על פני השטח של המדגם כדי ליצור תמונות ביון. רוחב סריקה ומספר יריות לייזר יכולים להיות מותאם כדי להשיג רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ועוצמת אות מקסימלי בהתאמה. השתמש פסגות מטריצת DHB או סטנדרטים פנימיים מוחלים על השקופית או ישירות לרקמה לכייל את הספקטרום ההמוני.
- ההחלטה LC-MS גבוה. (ראה טבלה של חומרים / ציוד) מדגם תמציות הפעלה עם LC-MS או באמצעות LC שלב הפוך (RP) עם עמודת C-18, או שלב נורמלי (NP) עם עמודת HILIC בהתאם analytes של עניין. השתמש בשלבים וניידיםשיפועים מתאימים כמו לסוג מדגם המסוים. לבצע רכישות במצבי יון חיוביים או שליליים בהתאם לסוג המדגם.
2. הכנת רקמה
- חתוך את גולה שורש מהצמח, ומשאיר 3-4 מ"מ של שורש מחובר לגולה.
- מייד לאחר נתיחה, להשתמש במלקחיים כדי למקם את הרקמה בכוס cryostat ולכסות עם ג'לטין (100 מ"ג / מיליליטר במי deionized). זה חיוני לרקמה להיות דבוקה לתחתית הכוס ללא בועות אוויר.
- פלאש להקפיא את הרקמה על ידי הנחת הכוס באמבט קרח / אתנול יבש עד ג'לטין מתקשה והופך להיות אטום. דגימות חנות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- הסר דגימות ממקפיא -80 מעלות צלזיוס, לחתוך את כוס cryostat פלסטיק ולקצץ משם ג'לטין העודף. הר הרקמות המשובצים לצ'אק cryostat עם כמות בגודל מטבע של טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) בתקשורת, ואילו לא לתת לאוקטובר לגעת ברקמה. הנח בcryostatתיבה עד מתמצק OCT.
- לאפשר לצ'אק וג'לטין לאזן בתיבת cryostat (סט ל-20 או -25 מעלות צלזיוס) במשך כ 15 דקות.
- השתמש cryostat (ראה טבלה של חומרים / ציוד) לרקמות סעיף כ העובי של תא אחד (8-20 מיקרומטר תלוי בסוג הרקמה) והפשרת הר כל פרוסה על גבי הזכוכית המצופה-איטו ידי ההתחממות בחזרה (לא איטו מצופה בצד) של שקופיות זכוכית מצופים איטו על גב היד שלך. הנח את הצד המצופה איטו של השקופית התחממה ליד פרוסת הרקמה הקפואה ולאפשר הפרוסה להיצמד לשקופית. הצבת החלקים קרוב זה לזה בשקופית תספק התאמה טובה יותר במהלך MSI.
3. מטריקס יישום
- יישום מברשת אוויר של MALDI מטריקס
- יש לבצע את כל הליכי מברשת האוויר במנדף.
- לנקות ביסודיות את מיכל airbrush פתרון וזרבובית (ראה טבלה של חומרים / ציוד) עם מתנול ולמלא את מיכל הפתרון עם פתרון מטריצת DHB (150 מ"ג / מיליליטר ב50%% methanol/0.1 v TFA / V).
- החזק את מברשת האוויר כ 35 סנטימטר מהמדגם ולהחיל 10-15 שכבות של מטריקס על פני השטח של השקופית עם משך 10 תרסיס שניות ו30 זמן ייבוש שניות בין כל מעיל.
- לנקות ביסודיות את מברשת האוויר שוב עם מתנול כאשר סיימתי, כדי למנוע סתימה מפתרון המטריצה.
- אוטומטי מרסס יישום של MALDI מטריקס
- בצע את ההוראות הזנק המסופקות על ידי היצרנים של מערכת המרסס האוטומטית.
- עבור MSI של מטבוליטים בגושי שורש באמצעות 40 מ"ג / מיליליטר (ב50%% methanol/0.1 v TFA / V) DHB כמטריצה, הגדר את הטמפרטורה ל ~ 80 מעלות צלזיוס, מהירות ל1,250 מ"מ / דקה, קצב זרימה ל50 μl / min, ומספר עובר ל24. לקבלת הכיסוי הטוב ביותר, מומלץ לסובב את הזרבובית 90 מעלות ו / או לקזז את מ"מ זרבובית 1.5 בין כל מעבר. התחל בשיטת ריסוס.
כsiהערה דה, מערכת מרסס המסוימת משמשת כאן מחממת את הזרבובית לאידוי מהיר יותר של הממס. כממס מתאדה, הריכוז של המטריצה מגביר מהירות. יש המטריצה מוחלת על המדגם עם מברשת האוויר והמרסס האוטומטי ריכוזים דומים. - בצע את הוראות הכיבוי שסופקו על ידי היצרנים של מערכת המרסס האוטומטית.
- יישום העידון של MALDI מטריקס
- לשקול את 300 DHB מ"ג לחלק התחתון של חדר סובלימציה (ראה טבלה של חומרים / ציוד).
- היצמד שקופיות זכוכית לאצבע הקרה (חלק העליון של חדר סובלימציה) עם סעיפי הרקמות כלפי מטה עם קלטת דו צדדית, מוליך. מכסה את כל החלק האחורי של השקופית עם הסרט דו צדדי לאף מוליכות, ייצור אפילו מטריצה בתצהיר.
- הצמד את החצאים העליונים ותחתונים של חדר סובלימציה יחד עם ה-C-המהדק. חבר את הוואקום ומודעותקרח ד ומים קרים למאגר העליון.
- הנח קאמרי סובלימציה במעטפת חימום שהיא בטמפרטורת חדר.
- הפעל את משאבת הוואקום. חכה 15 דקות ולהדליק את מעטפת החימום. מעטפת החימום צריכה להגיע 120 מעלות צלזיוס במהלך 10 דקות.
- לאחר 10 דקות, מכבה את האש, קרוב לשסתום ואקום (כך הפנימי של החדר נשאר תחת ואקום) ולכבות את משאבת הוואקום.
- לאפשר החדר כדי להגיע לטמפרטורת חדר, פתח את שסתום שחרור לחץ הוואקום ולהסיר את המדגם. הגודל של חדר סובלימציה יקבע את הסכום של מטריצה בסובלימציה לשקופית הזכוכית. תאי סובלימציה גדולים יותר (בגודל של כוס מיליליטר 400) ישתמשו כ 300 מ"ג DHB תוך התאים הקטנים (בגודל של כוס מיליליטר 150) ישתמשו כ 100 מ"ג DHB וידרשו חיתוך שקופיות הזכוכית, כך שהוא מתאים בתא.
4. רכישת תמונה
- <li> מארק דפוס + בכל פינה של המדגם עם עט נוזל תיקון WiteOut כדי לשמש "נקודות ללמד". מניחים את שקף הזכוכית לתוך צלחת מתאם שקופיות MALDI ולקחת תמונה אופטית של המדגם באמצעות סורק.
- הגדר את קובץ תמונת רכישה באמצעות התוכנה המסופקת על ידי חברת המכשיר עם גודל סריקה צעד של 50 מיקרומטר וקוטר לייזר שווה או קטן יותר מגודל צעד סריקה. במכשיר הספציפי הזה, הגדרת לייזר המינימום נותנת קוטר לייזר של הגדרת לייזר כ 10 מיקרומטר וקטן בעל קוטר 40-50 מיקרומטר.
- טען את התמונה האופטית לתוך התוכנה וליישר את הצלחת עם התמונה האופטית.
- לכייל את המכשיר לפני תחילת הרכישה באמצעות יונים נפוצים מטריצת אשכול, סטנדרטים פנימיים, או שילוב כיול.
- ציין את האזורים של רקמה להיות מנותחים עם MSI, כולל מקום של מטריצה טהורה בשקופית כדי לשמש "ריק".
- בגין acquisition.
5. דור תמונה
- פתח את קובץ ההדמיה בתוכנה זמינה באופן מסחרי הניתנת על ידי הספק ולחלץ את תמונות יון. תוכנות קוד פתוח אחרות זמינה עבור עיבוד נתונים MSI 19.
6. זיהוי המטבוליט
- בחר מ '/ z ספציפי של עניין מהספקטרום ההמוני באמצעות התוכנה ספציפית הספק (ראה טבלה של חומרים / ציוד). אנליטי ניתן להבחין בין יון מטריצה כאשר שיא אנליטי נבחר מהספקטרום ההמוני ותמונות יון נוצרות במיוחד מקומית לקטע הרקמה.
- ליצור רשימה של analytes של עניין ולבצע ניסויי MS / MS. ראה טבלת 1 וטבלה 2 בנציג תוצאות עבור רשימות מדגם של analytes.
- ביצוע ניתוח LC-MS ממוקד בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה המוני (או ברזולוציה גבוהה MALDI-MS אם זמין) כדי להשיג מדויקמדידות מסה של analytes של עניין וגם לבצע LC-MS/MS של analytes היעד להשיג דפוסי פיצול אופייניים.
- בצע חיפוש באתר כדי לקבוע הזדהויות המשוערת לanalytes הממוקד. דוגמאות למאגרי מידע המטבוליט כוללים: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG, וHMDB.
- כדי לאשר את ההזדהויות המשוערת מחיפוש מסד הנתונים מסה מדויק, להתאים את MS / MS מanalytes הממוקד לMS / MS הספקטרום של סטנדרטים, ספרות, ו / או תוכנת חיזוי פיצול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה ניסיונית של MSI מוצגת באיור 1. בתחילת הניסוי מאוד, הכנת מדגם היא שלב קריטי. גושים הם גזומים משורש הצמח ומשובץ בג'לטין. הרקמה חייבת להיות לחוצה אל כוס cryostat, ללא בועות, בזמן שהוא קפוא, זה יהיה להבטיח יישור קל ותקין של הרקמות בזמן שהוא מחולק. כאשר הרקמה נמצאת בפרוס, חשוב לחתוך את הרקמה בעובי הנכון; רזה מדי סעיפים יקרעו, הורס את שלמות הרקמות, ואילו עבים מדי סעיפים יפחית את מספר analytes חילוץ וזוהה מהרקמות. בחירה של מטריצה ואת טכניקת יישום תהיה לקבוע את סוגי analytes זוהה. באמצעות שילוב של מטריצות יכולים לספק תוצאות משלימות. שלוש טכניקות יישום מטריצה מוצגות בעבודה זו. טכניקת airbrush היא מהירה, אך בדרך כלל אינו מתאימה לMSI של מולקולות קטנות להיותסיבה לדיפוזיה אנליטי. מערכות מרסס אוטומטיות וסובלימציה לספק גבישים קטנים יותר מטריקס, שחזור טוב יותר, ודיפוזיה אנליטי פחות. איור 2 מראה תמונה אופטית של סעיף גולה שורש truncatula Medicago. איור 3 מראה דוגמא תמונה אופטית של גדלי כיסוי המטריצה וגביש באמצעות מברשת אוויר, אוטומטי מרסס, וסובלימציה בהתאמה.
מטריצות קונבנציונליות, כמו DHB, מייצרות יונים רבים בטווח המסה נמוך יותר (מ '/ z 100-400) 20. יוני מטריצה אלה יכולים להפריע לזיהוי של מטבוליטים בטווח זה. איור 4 מראה MS ספקטרום של מטריצה רק DHB לעומת רקמה גולה שורש מצופה במטריצת DHB. פסגות מטריצת DHB מסומנות ברקמה אדומה וגולה שורש מכוסה DHB מוצגת בכחול. מטריצות רומן כגון Tio 2 חלקיקים 21, 1,5-diaminonapthalene (דן) 22, 2,3,4,5-Tetrakis (3 ', 4'-dihydroxylphenyl) thiophene (DHPT) 23, ו1,8-BIS נפטלין (דימתיל-אמינו) (dman) 24,25 כבר דיווח כי להפחית את ההתערבות של יוני מטריקס בטווח המסה הנמוך, וגם לשפר את זיהוי של קבוצות מסוימות מטבוליטים 5. ניתן להבחין בין פסגות מטריקס ממטבוליטים אמת באמצעות תמונות הטרשת הנפוצה. כאשר שיא הוא לחץ על, תמונת יון מופק ומוצגת חופפים התמונה האופטית. פסגות אלה שיוצרים תמונות עם לוקליזציה שונה לרקמות, ואינן נוכחים במטריצה רק אזור צילם, נחשבות מטבוליטים. 5a איור מראה כמה תמונות יון נציג של מטבוליטים נמצאים ברקמה גולה שורש, ואילו איור 5 מציגה דוגמאות של תמונות MS מתאים למטריצת פסגות קשורות. בציור 5a התמונה מראה לוקליזציה שונה לרקמות גולה שורש וחוסר האות במטריצה רק השטח שצלמה. באיור 5 ממ ' הרקמה גולה שורש truncatula מופיעה בטבלה 1 (מצב חיובי) וטבלה 2 (מצב שלילי) 4.
המטרה הסופית של ניסויי metabolomics לא ממוקדים היא לזהות את התרכובות שזוהו. בעת ביצוע MSI על מכשיר ברזולוציה בינוני (MRMS), כגון TOF / TOF, יש צורך להשיג מדידות מסה מדויקות בצורה שונה. ניתן לעשות זאת עם גישת MS רבת פנים שבו תוצאות MALDI-MSI הן בהשוואה לנתונים ברזולוציה גבוהה LC-MS באמצעות תמציות רקמה. ישנם פרוטוקולים אפשריים רבים מיצוי רקמה לבחירה בהתאם לanalytes של עניין. רזולוציה גבוהה MS (HRMS) יכול להתבצע במו היינון החיובי או שלילי des ועם LC שלב נורמלי או הפוך בהתאם analytes של עניין. ברגע שמסה מדויקת מתקבלת עם רזולוציה גבוהה LC-MS, המסה וכתוצאה מכך ניתן חיפשה בכמה מאגרי מידע, המפורטים בעבר, כדי להשיג זיהוי משוער. נתונים MS / MS הבא נאספו ודפוס הפיצול האופייני של אנליטי של עניין יכול להיות בהשוואה לסטנדרטים, ספקטרה ספרות, או דפוסי פיצול תיאורטי. איור 6 מציג דוגמא של אחד המטבוליטים זוהו עם MSI וLC-MS. מטבוליט זה זוהה כheme המבוסס על ספקטרום MS / MS נאסף עם רזולוציה גבוהה LC-MS. נתונים MS / MS זה בהשוואה לספקטרום MS / MS שפורסם בעבר על ידי Shimma וSetou 26. שתי ההתאמה MS / MS הספקטרום, ולכן זהותו של m / z 616.2 הצטרף בביטחון כheme המבוסס על החיפוש מדויק ההמוני מסד הנתונים ונתונים MS / MS בהשוואה לנתונים MS / MS ספרות.
ther.within-page = "תמיד"> 
איור 1. סקירה כללית של MSI זרימת עבודה. גושי שורש הם גזומים מהמפעל, המשובץ בג'לטין, מחולק עם cryostat ורכובה על גבי שקופיות זכוכית מצופים איטו. מטריקס מוחל על השקופית באמצעות אחת משלוש שיטות יישום מטריצה. רכישת MSI מתבצעת עם ספקטרומטר מסת MALDI-TOF/TOF וספקטרום MS מופקים לתוך תמונות עם תוכנה של MSI.
איור 2. דגימת רקמת תמונה אופטית. תמונה אופטית נציג של קטע רקמת Medicago truncatula גולה שורש.
איור 3. תצהירי מטריצת ירושלים. נציג תמונות המראות את consistencies השונים של מטריקס בתצהיר עם) מברשת אוויר, ב) מרסס אוטומטי, וג) טכניקות סובלימציה. שיטת יישום airbrush יוצרת גבישים גדולים וקטנים ואילו שיטת המרסס האוטומטית מייצרת גבישים באופן שווה בגודל קטן. העידון מייצר אחד אפילו שכבה של מטריצה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. ספקטרום MS של PLAבמטריצת DHB לעומת הרקמה גולה שורש מכוסה DHB. פסגות מטריצת DHB מסומנות באדום והרקמה גולה שורש מכוסה DHB מוצגת בכחול. ניתן להבחין בין פסגות מטריקס ממטבוליטים אמת באמצעות תמונות הטרשת הנפוצה. כאשר שיא הוא לחץ על, תמונת יון מופק ומוצגת חופפים התמונה האופטית. פסגות אלה שיוצרים תמונות עם לוקליזציה שונה לרקמות, ואינן נוכחים במטריצה רק אזור צילם, נחשבות מטבוליטים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. תמונות MS של מ ' גושי שורש truncatula.) תמונות יון נציג של f מטבוליטיםound בפרא מהסוג מ ' גושי שורש truncatula. ב) תמונות יון נציג של מיני מטריצה שלא ייחשבו מטבוליטים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. נתוני הדוגמא MS / MS לזיהוי המטבוליט. ספקטרום MS / MS של m / z 616.2 שנוצר כheme [M +]. המבנה הכימי מוצג ומבני פיצול מוקצים. נתונים MS / MS הניסיוניים בהשוואה לספקטרום MS / MS של heme שדווח בספרות על ידי Shimma וSetou 26.
טבלת 1. Analytes של עניין -. מצב לדוגמא חיובי רשימה של אנאליytes של ריבית ממ ' רקמה גולה שורש truncatula במצב יון חיובי 4.
| שמו של המטבוליט | תיאורטי [M + H] + | MRMS נמדד [M + H] + | HRMS נמדד [M + H] + | Δm (מד"א) |
| γ-aminobutyric חומצה | 104.0706 | 104.1 | 104.0706 | 0 |
| כולין, * | 104.1070 > | 104.1 | 104.1071 | 0.01 |
| פרולין | 116.0706 | 116.07 | 116.0706 | 0 |
| לין | 118.0863 | 118.09 | 118.0865 | 0.02 |
| לאוצין | 132.1019 | 132.1 | 132.1022 | 0.03 |
| asparagine | שעות: 79px; "> 133.0608133.06 | 133.0602 | -0.06 | |
| אדנין | 136.0618 | 136.07 | NA | NA |
| betaine proling | 144.1019 | 144.1 | 144.1024 | 0.05 |
| גלוטמין | 147.0764 | 147.09 | 147.0768 | 0.04 |
| 156.0768 | 156.06 | 156.0771 | 0.03 | |
| ארגנין | 175.1190 | 175.13 | 175.1167 | -0.23 |
| סוכרוז + K | 381.0794 | 381.05 | 381.0791 | -0.03 |
| heme, * | 616.1768 | 616.15 | NA | NA |
| HT = בסגנון "25" = "גובה: 26px; רוחב: 173px;"> NAD | 664.1164 | 664.1 | NA | NA |
| formononetin | 269.0808 | 269.08 | 269.0803 | 0.05 |
| chrysoseriol GlcA | 477.1028 | 477.1 | 477.1008 | 0.2 |
| formononetin MalGlc | 517.1341 | 517.13 | 517.1337 | idth: 64px; "> 0.04|
| aformosin MalGlc | 547.1446 | 547.16 | 547.1427 | 0.19 |
* [M +]
MS / MS שבוצע לצורך זיהוי.
טבלה 2. Analytes של עניין -. מצב שלילי רשימה לדוגמא של analytes של ריבית ממ ' רקמה גולה שורש truncatula במצב יונים שלילי 4.
| שמו של המטבוליט | תיאורטי [MH] - | MRMS נמדד [MH] - < / Sup> | HRMS נמדד [MH] - | Δm (מד"א) |
| חומצת pyruvic | 87.0077 | 87 | NA | NA |
| אלנין | 88.0393 | 88.01 | 88.0374 | -0.19 |
| חומצה לקטית | 89.0233 | 89.01 | 89.0296 | 0.63 |
| חומצה זרחתית | 96.9685 | 96.96 | 96.9625 | -0.6 |
| חומצת 2-ketobutyric | 101.0233 | 101.02 | 101.0191 | -0.42 |
| 102.055 | 102.04 | 102.0528 | -0.22 | |
| סרין | 104.0342 | 104.02 | 104.0228 | -1.14 |
| חומצת maleic / fumaric | 115.0026 | 115.03 | 115 | -0.26 |
| חומצת succinic | 117.0182 | 117.01 | 117.0125 | -0.57 |
| תראונין | 118.0499 | 118.04 | 118.0456 | -0.43 |
| חומצת oxalacetic | 130.9975 | 131.03 | 130.991 | -0.65 |
| חומצה אספרטית | 132.0291 | 132.03 | 132.0256 | -0.35 |
| חומצת מאלית | 133.0132 | 133.02 | 133.0221 | 0.89 |
| חומצת salicyclic | 137.0233 | 137.02 | 137.0349 | 1.16 |
| α-ketoglutaric חומצה | 145.0132 | 145.02 | 145.0063 | -0.69 |
| חומצה גלוטמית | 146.0448 | 146.01 | 146.0408 | -0.4 |
| פנטוז | 149.0445 | 149.04 | 149.0414 | -0.31 | </ Tr>
| חומצת aconitic | 173.0081 | 173.03 | 173.0057 | -0.24 |
| חומצה אסקורבית | 175.0237 | 175.05 | 175.0341 | 1.04 |
| hexose | 179.055 | 179.05 | 179.0484 | -0.66 |
| לימון / חומצה האיזוציטרית | 191.0186 | 191.02 | 191.0166 | -0.2 |
| חומצה פלמיטית | 255.2319 | 255.22 | 255.2246 | -0.73 |
| hexose-6-phosphate | 259.0213 | 259.04 | 259.014 | -0.73 |
| חומצה סטארית | 283.2632 | 283.26 | 283.2552 | -0.8 |
| סוכרוז | 341.1078 | 341.07 | 341.0972 | -1.06 |
MS / MS שבוצע לצורך זיהוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאמור לעיל, הכנת מדגם היא השלב הקריטי ביותר בתהליך העבודה של MSI. הטבעת הרקמה בצורה לא אחידה תגרום חתך להיות קשה או בלתי אפשרי במקרים מסוימים. גודל הסעיף וזמן איזון נאות הם קריטיים לשמירה על שלמות הרקמה וההימנעות מתקפל ודמעות. בחירה של מטריצה ואת טכניקת יישום תשחק תפקיד בקביעת הסוגים של analytes כדי להתגלות, ברזולוציה מרחבית, ושחזור של התוצאות. באמצעות שילוב של מטריצות או טכניקות יישום יכול לספק תוצאות משלימות.
שיטה זו תוכננה במיוחד עבור MSI לא ממוקד של מטבוליטים אנדוגני בתוך: מ ' רקמה גולה שורש truncatula, אבל יכול בקלות להיות מותאם לסוגי רקמות אחרים ושאלות ביולוגיות. שיטות יישום מטריצה המומלצת למולקולה קטנה MSI הן סובלימציה ומרסס אוטומטי. הגדלת כמות הממס שהופקדה על Tissuדואר, על ידי התאמת שיטת המרסס האוטומטית, יגדיל את החילוץ של analytes ולאפשר זיהוי של תרכובות מסה גבוהות יותר יש לבחור לבצע MSI של שומנים, פפטידים, וכו '. בעת שימוש בסוגים אחרים של רקמות, ההתאמה העיקרית תהיה עובי הסעיף. באופן אידיאלי הרקמה צריכה להיות פרוס לעובי של תא אחד, ולכן חלקים עבים אולי מתאימים לרקמות צמח וחתכים דקים יותר מתאימים לרקמות בעלי חיים. אם קיפול או קריעה מתרחשת, בדרך כלל זמן ארוך יותר יש צורך באיזון לפני חתך או גודל סעיף עבה יכול להיות נחוץ. בעת ביצוע LC-MS להשיג המונים מדויקים, פרוטוקול מיצוי רקמה, ממסים שלב נייד ושיפוע, שלב נייח טור, ומצב יינון MS כולם יכול להיות מותאם ומותאם במיוחד לanalytes של עניין.
היתרון העיקרי של MALDI-MSI הוא היכולת שלה לספק לא רק מידע המוני, אלא גם מידע מרחבי למדגם נתוןללא הצורך בידע מוקדם בanalytes היעד. שיטות הדמיה אחרות דורשות השימוש בderivatizations או תגים 5. כאמור, מגבלה אחת של טכניקה זו היא השפע של פסגות מתערבים יון מטריצה. מטריצות רומן דווחו לתת מענה למגבלה זו. לחלופין, ספקטרומטריית מסת יון משנית (SIMS)-MSI הוא אפשרות הדמיה ללא מטריצה, עם זאת, יש לו פחות רגיש מאשר MALDI-MSI 3. מגבלה נוספת של שיטה זו היא ברזולוציה נמוכה יותר ההמונית של מכשירי MALDI-TOF/TOF. בגלל הכוח המוני פתרון הנמוך, יש צורך גם לבצע ברזולוציה גבוהה MS להשיג המונים מדויקים לזיהוי המטבוליט, מה שאומר שיותר ניסויים ויותר זמן. בעיה זו ניתן לפתור על ידי ביצוע MALDI-MSI על פלטפורמת מכשיר ברזולוציה גבוהה כגון MALDI-Orbitrap. המגבלה הסופית של ביצוע ניסויי MSI היא חוסר של כלי תוכנה לניתוח נתונים MSI, altהאף קצת ההתקדמות שחלה באחרונה בתוכנה של MSI נעשה 27,28. בדרך כלל ספקטרום MS לכל איזור הדמיה חייב להיות מנותח באופן ידני ותמונות יון שחולצו על ידי יד. ניסויי MSI לייצר שפע של נתונים ויכולים להיות זמן רב מאוד כדי לנתח. בסך הכל, MALDI-MSI מציע יתרונות ייחודיים לקבלת מידע המרחבי של תרכובות רבות בו זמנית תוך ניסוי יחיד שיכול להיות מאוד שימושי לניתוח ממוקד של מולקולות קטנות ותרכובות אחרות עם הרבה יישומים ביולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות ד"ר ז'אן מישל Ane במחלקה לאגרונומיה בUW-Madison עבור מתן דגימות truncatula Medicago. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון מהקרן הלאומית למדע (NSF) מענק מל"ג-0,957,784, בית הספר למוסמכים באוניברסיטת ויסקונסין והקרן ויסקונסין בוגרי המחקר (WARF) ותכנית Romnes הפקולטה מלגת מחקר (לLL). EG מכיר בוגר מחקר אחוות NSF (DGE-1,256,259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
- Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, 130-145 (2013).
- Ye, H., Gemperline, E., Li, L. A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics. Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).
- Wei, R. Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry. Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).
- Kobayashi, T., et al. A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer. Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).
- West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics. Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).
- Spegel, P., et al. Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release. Biochem. J. 450, 595-605 (2013).
- Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics. J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).
- Prell, J., Poole, P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).
- Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation. Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).
- Stemmler, E. A., et al. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).
- Neupert, S., Predel, R. Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect. Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).
- Northen, T. R., et al. Clathrate nanostructures for mass spectrometry. Nature. 449, (2007).
- Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Chen, S., et al. 2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).
- Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
- Shroff, R., Svatos, A. Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).
- Shimma, S., Setou, M. Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).
- Paschke, C., et al. Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).
- Parry, R. M., et al. omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).
