Summary
Bildgebenden Massenspektrometrie (MSI) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das benutzt werden kann, um in intakten Geweben entdecken und identifizieren verschiedene chemische Spezies, die Erhaltung der Verbindungen in ihrer natürlichen Umgebung, die neue Einblicke in die biologischen Prozesse zur Verfügung stellen kann. Hierin eine für die Analyse von kleinen Molekülen entwickelt MSI Verfahren beschrieben.
Abstract
Die meisten Techniken verwendet, um kleine Moleküle, wie Medikamente oder endogene Metaboliten studieren, verwenden Gewebeextrakten, die die Homogenisierung des Gewebes von Interesse, die möglicherweise Änderungen in der Stoffwechselwege untersucht 1 verursachen könnte erfordern. Bildgebenden Massenspektrometrie (MSI) ist ein leistungsstarkes Analyse-Tool, das in intakten Scheiben von biologischen Gewebeproben 1-5 räumliche Informationen von Analyten zur Verfügung stellen kann. Diese Technik wurde ausgiebig verwendet, um verschiedene Arten von Verbindungen, einschließlich Proteine, Peptide, Lipide, kleine Moleküle wie Metaboliten endogenen studieren. Mit Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI)-MSI können räumliche Verteilungen mehrerer Metaboliten gleichzeitig detektiert werden. Hierbei wird eine speziell für die Durchführung von Metabolomics ungezielte MSI Experimente an Leguminosen Wurzeln und Wurzelknöllchen entwickelte Methode vorgestellt, das Einblicke in die biologischen Prozesse, die sich offenbaren konnte. Diehier vorgestellte Methode zeigt eine typische MSI Workflow, von der Probenvorbereitung bis zur Bildaufnahme, und konzentriert sich auf die Matrix-Anwendung Schritt und zeigt mehrere Matrix Anwendungstechniken, die nützlich für die Erkennung kleiner Moleküle sind. Sobald die MS Bilder erzeugt, wird die Analyse und Identifizierung von Metaboliten von Interesse diskutiert und gezeigt. Die hier vorgestellten Standard-Workflow kann leicht für verschiedene Gewebearten, Molekülarten, und Instrumentierung geändert werden.
Introduction
Die wachsenden Bereich der Metabolomics hat viele wichtige biologische Anwendungen, einschließlich der Entdeckung von Biomarkern, die Entschlüsselung Stoffwechselwege in Pflanzen und anderen biologischen Systemen und Toxikologie Profilierung 4,6-10. Eine große technische Herausforderung bei der Untersuchung biologischer Systeme ist es, Wege metabolomic sie ohne Unterbrechung 11 studieren. MALDI-MSI ermöglicht die direkte Analyse von intaktem Gewebe, die sensitive Detektion von Analyten in einzelnen Organen und sogar 12,13 14,15 Einzelzellen ermöglicht.
Probenvorbereitung ist ein entscheidender Schritt in der Herstellung reproduzierbare und zuverlässige Massenspektren Bilder. Die Qualität der Bilder hängt stark von Faktoren wie Gewebeeinbettungsmedium, Schichtdicke, MALDI-Matrix und Matrix-Anwendungstechnik. Bei bildgebenden Anwendungen ist ideal Schnittdicke die Breite einer Zelle (8-20 um je nach Probentyp). MALDI erfordert Abscheidung einer organischen, Crystalline Matrixverbindung, typischerweise eine schwache Säure, auf die Probe, um einen Analyten-Ablation und Ionisierung zu unterstützen. 16 verschiedene Matrizen bieten unterschiedliche Signalintensitäten, störenden Ionen und Ionisierungseffizienz von verschiedenen Klassen von Verbindungen.
Die Matrix Applikationstechnik spielt auch eine Rolle, in der Qualität der Massenspektren Bilder und verschiedene Techniken für die verschiedenen Klassen von Analyten geeignet sind. Drei Matrix Anwendungsmethoden werden in diesem Protokoll vorgestellt: Airbrush, Spritzautomaten und Sublimation. Airbrush-Matrix-Anwendung wurde vielfach in der MALDI-Bildgebung verwendet. Der Vorteil der Airbrush-Matrix-Anwendung ist, dass es relativ schnell und einfach ist. Allerdings ist die Qualität der Airbrush Matrix Anwendung hängt stark von der Geschicklichkeit des Benutzers und neigt weniger reproduzierbar und führen Diffusion von Analyten, insbesondere kleine Moleküle 17. Automatische Spritze Systeme haben ähnliche Mechanik Matrix Anwendung Airbrush, aber have entwickelt worden, um die Variabilität mit manueller Airbrush-Anwendung gesehen zu entfernen, so dass das Spray mehr reproduzierbar. Diese Methode kann manchmal mehr Zeit in Anspruch als herkömmliche Airbrush-Matrix-Anwendung sein. Sowohl manuelle Airbrush und Spritzautomaten Systeme sind lösemittelbasierten Matrix Anwendungsmethoden. Sublimation ist eine trockene Matrix Applikationstechnik, die immer mehr und mehr populär für die Massenspektrale Bildgebung von Metaboliten und kleinen Molekülen, weil es Analytdiffusion reduziert, aber es fehlt die notwendige Lösungsmittel zu extrahieren und zu beobachten, höhere Massen 18 Verbindungen.
Zuversichtlich Identifizierung von Metaboliten erfordert in der Regel präzise Massenmessungen an vermeintlichen Identifikationen gefolgt von Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) Experimente zur Validierung, mit MS / MS-Spektren, die verglichen werden, um Standards, Literatur oder theoretischen Spektren zu erhalten. In diesem Protokoll hoher Auflösung (Massenauflösungsvermögen von 60.000 bei m / z 400), Flüssigchromatographie (LC)-MS ist mit MALDI-MSI gekoppelt, die die Rauminformationen und zuversichtlich Identifikationen von endogenen Metaboliten zu erhalten, mit Medicago truncatula Wurzeln und Wurzelknollen als das biologische System. MS / MS-Experimente können direkt auf das Gewebe mit MALDI-MSI-oder Gewebeextrakten mit LC-MS durchgeführt und für die Validierung der Metabolit Identifikationen verwendet werden.
Dieses Protokoll bietet eine einfache Methode, um endogene Metaboliten in M. Karte truncatula, die angepasst und MSI von kleinen Molekülen in verschiedenen Gewebetypen und biologische Systeme angewandt werden kann.
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Protocol
1. Instrumentierung
- MALDI-TOF/TOF MSI. Verwenden Sie ein Massenspektrometer mit einer MALDI-Quelle für die Analyse von kleinen Molekülen ausgestattet (siehe Tabelle der Materialien / Geräte). Führen Akquisitionen im positiven oder negativen Ionen-Modus in Abhängigkeit von den Analyten von Interesse. Geben Sie einen Massenbereich von Interesse und sammeln Sie 500 Laserschüsse / Spot bei 50 Intervallen um sowohl in der x-und y-Richtung über die Oberfläche der Probe auf Ionen-Bilder zu erzeugen. Die Rasterweite und die Anzahl der Laserschüsse eingestellt werden, um eine höhere räumliche Auflösung und maximalen Signalintensität bzw. zu erhalten. Verwenden DHB Matrix Peaks oder der Folie oder direkt auf das Gewebe aufgebracht, um die Massenspektren kalibrieren internen Standards.
- Hohe Auflösung LC-MS. (Siehe Tabelle der Materialien / Geräte) Führen Probenextrakten mit LC-MS entweder mit Reversed-Phase (RP) LC mit einer C-18-Säule oder Normalphase (NP) mit einem HILIC Säule in Abhängigkeit von den Analyten von Interesse. Verwenden Sie mobile Phasen undGradienten für das entsprechende speziellen Probentyp. Führen Akquisitionen in positive oder negative Ionen-Modi, je nach Probentyp.
2. Gewebepräparation
- Schneiden Sie die Wurzelknöllchen aus der Pflanze, so dass 3-4 mm der Wurzel zum Knoten befestigt.
- Unmittelbar nach der Sektion, Zange verwenden, um das Gewebe in einem Kryostaten Tasse legen und decken mit Gelatine (100 mg / ml in VE-Wasser). Es ist für das Gewebe an der Unterseite der Schale ohne Luftblasen aufgeklebt werden.
- Blitzeis das Gewebe, indem Sie den Becher in einem Trockeneis / Ethanol-Bad, bis die Gelatine erstarrt und wird undurchsichtig. Proben bei -80 ° C bis zur Verwendung.
- Proben entfernen aus dem -80 ° C Gefrierschrank, schneiden Sie den Kunststoffbecher und-Kryostaten wegschneiden überschüssige Gelatine. Montieren Sie den eingebetteten Gewebe mit dem Kryostaten Spannfutter mit einer Dime-Größe Menge der optimale Schnitttemperatur (OCT) Medien, die zwar nicht gerade der Oktober berühren das Gewebe. Legen Sie in KryostatenBox, bis die Oktober erstarrt.
- Damit das Spannfutter und Gelatine in den Kryostaten Feld (auf -20 oder -25 ° C) für etwa 15 min äquilibrieren.
- Verwenden Sie den Kryostaten (siehe Tabelle der Materialien / Geräte), um Gewebeschnitt etwa die Dicke einer Zelle (8-20 um je nach Gewebetyp) und Tauwetter montieren jede Scheibe auf die ITO-beschichtetes Glas durch Erwärmen der Rückseite (nicht-ITO beschichtete Seite) einer ITO-beschichtete Glasträger auf der Rückseite der Hand. Legen Sie die ITO-beschichtete Seite der Folie erwärmt in der Nähe des eingefrorenen Gewebeschnitt und damit die Scheibe, um auf der Folie haften. Platzieren Sie die Abschnitte nahe beieinander auf der Folie wird die bessere Ausrichtung bei MSI bieten.
3. Matrix-Anwendung
- Airbrush Anwendung der MALDI-Matrix
- Alle Airbrush-Verfahren sollten in einem Abzug durchgeführt werden.
- Die Airbrush-Lösung Behälter und Düse (siehe Tabelle der Materialien / Geräte) mit Methanol gründlich reinigen undFüllen der Lösungsbehälter mit DHB-Matrix-Lösung (150 mg / ml in 50% methanol/0.1% TFA v / v).
- Halten der Spritzpistole etwa 35 cm von der Probe und anzuwenden 10-15 Schichten Matrix auf der Oberfläche des Objektträgers mit einer Dauer von 10 Sek. und 30 Sek. Spritztrockenzeit zwischen jeder Beschichtung.
- Gründlich die Airbrush wieder sauber, wenn Sie fertig mit Methanol, um zu vermeiden Verstopfung von der Matrix-Lösung.
- Automatische Sprayer Anwendung der MALDI-Matrix
- Folgen Sie den Start-up-Anleitungen der Hersteller von automatischen Spritzgerät System.
- Für MSI von Metaboliten in Wurzelknöllchen mit 40 mg / ml (in 50% methanol/0.1% TFA v / v) DHB als Matrix, die Temperatur auf ~ 80 ° C, Geschwindigkeit bis 1250 mm / min, Durchflussrate auf 50 ul / min, und die Anzahl der Durchgänge 24. Für beste Leistung wird empfohlen, um die Düse 90 und / oder versetzt die Düse von 1,5 mm zwischen jedem Durchlauf drehen. Starten Sprayer-Methode.
Als side Note, insbesondere die Spritzensystem verwendet hier heizt die Düse zur schnelleren Verdampfung des Lösungsmittels. Wenn das Lösungsmittel verdampft, wobei die Konzentration des Matrix schnell erhöht. Die mit der Airbrush und dem Spritzautomaten auf die Probe aufgebracht Matrix vergleichbare Konzentrationen. - Folgen Sie den Anweisungen Abschaltung der Hersteller von automatischen Spritzgerät System.
- Sublimation Anwendung der MALDI-Matrix
- Wiegen Sie 300 mg DHB in den Boden des Sublimationskammer (siehe Tabelle der Materialien / Geräte).
- Kleben Sie den Glasobjektträger zu der kalten Finger (obere Teil des Sublimationskammer) mit den Gewebeschnitten nach unten mit einem doppelseitigen, leitfähiges Band. Decken Sie die gesamte Rückseite der Folie mit dem doppelseitigen Klebeband selbst für Leitfähigkeit, wodurch auch Matrix-Abscheidung.
- Klemmen Sie die oberen und unteren Hälften der Sublimation Kammer zusammen mit der C-Klemme. Verbinden Sie den Vakuum-und Ad-d Eis und kaltes Wasser an die Spitze Reservoir.
- Platzieren Sublimationskammer in einem Heizmantel bei Raumtemperatur.
- Einschalten der Vakuumpumpe. Warten Sie 15 min und die Heizung andrehen Mantel. Der Heizmantel sollte 120 ° C im Verlauf von 10 min zu erreichen.
- Nach 10 min, schalten Sie die Hitze, in der Nähe der Vakuumventil (so das Innere der Kammer bleibt unter Vakuum), und schalten Sie die Vakuumpumpe.
- Lassen Sie die Kammer auf Raumtemperatur zu kommen, öffnen Sie das Ventil das Vakuum Druck und entfernen Sie die Probe. Die Größe der Kammer Sublimation wird die Höhe der Matrix zu dem Glasobjektträger sublimiert bestimmen. Die größeren Sublimation Kammern (die Größe einer 400 ml-Becherglas) werden ca. 300 mg HTB während die kleineren Kammern (die Größe einer 150 ml-Becherglas) werden ca. 100 mg HTB und erfordert Schneiden der Glasplatte, so dass es passt in die Kammer.
4. Image Acquisition
- <li> Mark a + Muster auf jeder Ecke der Probe mit einem WiteOut Korrekturflüssigkeit Stift als "lehren Punkte" verwendet werden. Setzen Sie den Glasobjektträger in die MALDI Dia-Adapterplatte und nehmen Sie ein optisches Bild der Probe mit Hilfe eines Scanners.
- Einrichten einer Bildaufnahme-Datei unter Verwendung der von der Firma Instrument mit einer Rasterschrittweite von 50 um und einer Laserdurchmesser gleich oder kleiner als die Rasterschrittweite vorgesehen Software. An diesem Instrument, der minimale Lasereinstellung gibt einen Laserdurchmesser von etwa 10 um und kleinen Lasereinstellung hat einen Durchmesser von 40 bis 50 um.
- Laden des optischen Bildes in die Software und Ausrichten der Platte mit dem optischen Bild.
- Kalibrieren Sie das Gerät vor Beginn der gemeinsamen Akquisition mit Matrix-Clusterionen, interne Standards oder eine Kalibrierung Mix.
- Geben die Bereiche des Gewebes mit MSI analysiert werden, einschließlich einer Stelle der reinen Matrix auf der Folie als "blank" verwendet werden.
- Beginnen acErwerb.
5. Bildgenerierung
- Öffnen Sie die Bilddatei in der handelsüblichen Software, die vom Hersteller bereitgestellt und extrahieren Sie die Ionen-Bilder. Andere Open-Source-Software ist für MSI 19 Datenverarbeitung zur Verfügung.
6. Identifizierung von Metaboliten
- Wählen Sie einen bestimmten m / z von Interesse aus dem Massenspektrum mit der herstellerspezifischen Software (siehe Tabelle der Materialien / Geräte). Ein Analyt kann aus einem Matrix-Ionen unterschieden werden, wenn ein Analyt ausgewählt ist aus Peak im Massenspektrum und Ionen Bilder erzeugt werden spezifisch an den Gewebeabschnitt zu lokalisieren.
- Erstellen Sie eine Liste von Analyten von Interesse und führen Sie MS / MS-Experimente. Siehe Tabelle 1 und Tabelle 2 in Repräsentative Ergebnisse für die Probenlisten von Analyten.
- Führen Sie gezielt LC-MS-Analyse auf einem hochauflösenden Massenspektrometer (oder hoher Auflösung MALDI-MS falls vorhanden) genau zu erhaltenMassenmessungen der Analyten von Interesse und führen auch LC-MS/MS der Ziel Analyten charakteristischen Fragmentierungsmuster zu erhalten.
- Führen Datenbank suchen, um vermeintliche Identifikationen für die Ziel Analyten zu bestimmen. Beispiele für Stoffwechsel Datenbanken enthalten: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG und HMDB.
- Um die vermeintlichen Identifikationen von genauen Massendatenbanksuche bestätigen, passen Sie die MS / MS von den gezielten Analyten MS / MS-Spektren von Standards, Literatur und / oder Splitter Vorhersage-Software.
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Representative Results
Ein Überblick über experimentelle MSI ist in Fig. 1 gezeigt. Am Anfang des Experiments ist die Probenvorbereitung ein kritischer Schritt. Knöllchen aus der Pflanzenwurzel geschnitten und in Gelatine eingebettet. Das Gewebe muss flach gegen den Kryostaten Tasse gedrückt werden, ohne Blasen, während es eingefroren wird, das wird einfacher und die richtige Ausrichtung des Gewebes zu gewährleisten, während es geschnitten ist. Wenn das Gewebe in Scheiben geschnitten wird, ist es wichtig, das Gewebe bei der richtigen Dicke geschnitten, zu dünn Abschnitte reißen, ruinieren die Gewebeintegrität, zu dick, während der Abschnitte wird die Anzahl der Analyten extrahiert und aus dem Gewebe erkannt zu reduzieren. Auswahl von Matrix-und Anwendungstechnik werden die Arten von Analyten detektiert bestimmen. Verwendung einer Kombination von Matrizen komplementäre Ergebnisse liefern könnte. Drei Matrix Anwendungstechniken werden in dieser Arbeit präsentiert. Die Airbrush-Technik ist schnell, aber in der Regel nicht für MSI kleiner Moleküle geeignetUrsache des Analyten Diffusion. Spritzautomaten Systeme und Sublimation bieten kleinere Matrixkristalle, bessere Reproduzierbarkeit und weniger Analytdiffusion. Fig. 2 zeigt ein optisches Bild eines Medicago truncatula Knöllchenschnitt. 3 zeigt ein optisches Bild, beispielsweise der Matrix Abdeckung und Kristallgrößen mit Luftbürste, automatische Sprayer, und Sublimation auf.
Konventionelle Matrizen, wie DHB, produzieren viele Ionen im unteren Massenbereich (m / z 100-400) 20. Diese Matrixionen können mit dem Nachweis von Stoffwechselprodukten in diesem Bereich behindern. Fig. 4 zeigt MS-Spektren nur DHB-Matrix im Vergleich zu Knöllchengewebe mit DHB-Matrix beschichtet ist. DHB-Matrix Spitzen werden in rot und Knöllchengewebe bedeckt mit DHB angegeben ist blau dargestellt. Neuartige Matrices wie TiO 2-Nanopartikel 21, 1,5-Diaminonaphthalin (DAN) 22, 2,3,4,5-Tetrakis (3 ', 4'-dihydroxylphenyl) thiophen (DHPT) 23, und 1,8-Bis (dimethylamino) naphthalin (DMAN) 24,25 berichtet worden, dass die Störung von Matrixionen im niedrigen Massenbereich zu reduzieren und verbessern auch die Erkennung von bestimmten Klassen 5 von Metaboliten. Matrix Spitzen können von echten Metaboliten mit den MS Bilder unterschieden werden. Wenn eine Spitze angeklickt, wird der Ionen Bild extrahiert und angezeigt Lappen des optischen Bildes. Diese Peaks, die Bilder erzeugen, mit deutlichen Lokalisierung an das Gewebe, und sind nicht in der Matrix nur Fläche abgebildet werden derzeit als Metaboliten. 5a zeigt verschiedene repräsentative Ionen Bilder von Metaboliten in Knöllchengewebe gefunden, während Fig. 5b zeigt Beispiele von Bildern MS entsprechend zugehörigen Spitzen Matrix. In 5a das Bild zeigt deutliche Lokalisierung auf die Knöllchengewebe und zum Verlust des Signals in der Matrix einzige Bereich, der abgebildet wurde. In 5b M. truncatula Knöllchengewebe Tabelle 2 (negativer Modus) 4 aufgeführt wird in Tabelle 1 (positiver Modus) und.
Das Endziel ungezielte Metabolomics Experimente ist es, die Verbindungen, die festgestellt wurden identifizieren. Bei der Durchführung von MSI auf einer mittleren Auflösung Instrument (MRMS), wie einem TOF / TOF, ist es notwendig, um eine genaue Massenmessung auf eine andere Weise zu erhalten. Dies kann mit einem facettenreichen Ansatz, bei dem MS MALDI-MSI Ergebnisse werden hochauflösende LC-MS-Daten mit Gewebeextrakten Vergleich durchgeführt werden. Es gibt viele mögliche Gewebeentnahme Protokolle von je nach den Analyten von Interesse zu wählen. Hochauflösende MS (HRMS) in die positive oder negative Ionisation mo durchgeführt werdenund des mit normaler oder Umkehrphasen-LC je nach den Analyten von Interesse. Sobald eine genaue Masse wird mit hoher Auflösung LC-MS erhalten werden, kann die resultierende Masse mit mehreren Datenbanken, die zuvor aufgeführten gesucht werden, um eine mutmaßliche Identifizierung zu erhalten. Weiter MS / MS-Daten gesammelt und die charakteristischen Fragmentierungsmuster des Analyten von Interesse zu Standards, Literatur-Spektren oder theoretische Fragmentierungsmustern verglichen werden. Fig. 6 zeigt ein Beispiel für eine der mit MSI-und LC-MS nachgewiesen Metaboliten. Dieser Metabolit wurde als Häm auf der Basis des MS / MS-Spektrum mit hoher Auflösung LC-MS gesammelt identifiziert. Diese MS / MS-Daten wurden an den MS / MS-Spektren zuvor Shimma und Setou 26 veröffentlichten verglichen. Die zwei MS / MS-Spektren übereinstimmen, damit die Identität des m / z 616,2 wurde als vertrauens Häm basierend auf der genauen Massendatenbanksuche und MS / MS-Daten im Vergleich zur Literatur MS / MS-Daten belegt.
Fig. 1 ist. Überblick über MSI Workflow. Wurzelknöllchen von der Pflanze, die in Gelatine eingebetteten, mit dem Kryostaten geschnitten geschnitten und auf ein ITO-beschichtete Glasobjektträger montiert. Matrix ist mit der Folie mit einem der drei Matrixausbringungstechniken angewandt. MSI Erwerb wird mit einem Massenspektrometer durchgeführt MALDI-TOF/TOF und MS-Spektren werden in Bilder mit MSI-Software erstellt.
2. Gewebeprobe optische Bild. Vertreter optische Bild einer Medicago truncatula Knöllchengewebeschnitt.
3. Beispiel Matrix Ablagerungen. Repräsentative Bilder zeigen die verschiedenen Konsistenzen von Matrixabscheidung mit a) Airbrush, b) Spritzautomaten, und c) Sublimation-Techniken. Die Airbrush-Anwendungsmethode erzeugt große und kleine Kristalle, während die automatische Sprayer Verfahren produziert kleine gleichgroße Kristalle. Sublimation erzeugt eine gleichmäßige Schicht der Matrix. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4. MS-Spektrum von plain DHB-Matrix vs Knöllchengewebe mit DHB bedeckt. DHB-Matrix Spitzen sind rot gekennzeichnet und Knöllchengewebe mit DHB abgedeckt ist blau dargestellt. Matrix Spitzen können von echten Metaboliten mit den MS Bilder unterschieden werden. Wenn eine Spitze angeklickt, wird der Ionen Bild extrahiert und angezeigt Lappen des optischen Bildes. Diese Spitzen, die Bilder erzeugen mit unterschiedlichen Lokalisierungs auf das Gewebe und sind nicht in der Matrix nur Fläche abgebildet werden derzeit als Metaboliten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
5. MS Bilder von M. truncatula Wurzelknöllchen. a) für Ionen Bilder von Metaboliten found in Wildtyp M. truncatula Wurzelknöllchen. b) für Ionen Bilder von Matrix-Arten, die nicht berücksichtigt werden würde Metaboliten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
6. B. MS / MS-Daten für die Identifizierung von Metaboliten. MS / MS-Spektrum m / z 616,2, wie Häm [M +] identifiziert. Die chemische Struktur dargestellt und Fragmentierung Strukturen zugeordnet sind. Die experimentelle MS / MS Daten an den MS / MS-Spektrum von Häm in der Literatur durch Shimma und Setou 26 gemeldet verglichen.
Tabelle 1. Analyten von Interesse -. Positiven Modus Probenliste der analenytes Interesse von M. truncatula Knöllchengewebe im positiven Ionenmodus 4.
| Name des Metaboliten | Theoretische [M + H] + | MRMS Gemessen [M + H] + | HRMS Gemessen [M + H] + | &Dgr; M (MDA) |
| γ-Aminobuttersäure ein | 104.0706 | 104,1 | 104.0706 | 0 |
| Cholin a, * | 104.1070 > | 104,1 | 104.1071 | 0,01 |
| Prolin | 116.0706 | 116,07 | 116.0706 | 0 |
| Valin | 118.0863 | 118.09 | 118.0865 | 0,02 |
| Leucin ein | 132.1019 | 132,1 | 132.1022 | 0,03 |
| Asparagin ein | h: 79px; "> 133,0608133,06 | 133.0602 | -0.06 | |
| Adenin ein | 136.0618 | 136,07 | NA | NA |
| proling Betain ein | 144.1019 | 144,1 | 144.1024 | 0,05 |
| Glutamin ein | 147.0764 | 147,09 | 147.0768 | 0,04 |
| 156.0768 | 156,06 | 156.0771 | 0,03 | |
| Arginin ein | 175.1190 | 175,13 | 175.1167 | -0,23 |
| Saccharose + K | 381.0794 | 381,05 | 381.0791 | -0,03 |
| Häm a, * | 616.1768 | 616,15 | NA | NA |
| ht = "25" style = "height: 26px; width: 173px;"> NAD ein | 664.1164 | 664,1 | NA | NA |
| Formononetin ein | 269.0808 | 269,08 | 269.0803 | 0,05 |
| chrysoseriol GlcA ein | 477.1028 | 477,1 | 477.1008 | 0,2 |
| Formononetin MalGlc ein | 517.1341 | 517,13 | 517.1337 | idth: 64px; "> 0.04|
| aformosin MalGlc ein | 547.1446 | 547,16 | 547.1427 | 0,19 |
* [M +]
eine MS / MS durchgeführt, für die Identifizierung.
Tabelle 2. Analyten von Interesse -. Negativen Modus Probenliste von Analyten von Interesse von M. truncatula Knöllchengewebe im Negativ-Ionen-Modus 4.
| Name des Metaboliten | Theoretische [MH] - | MRMS Mess [MH] - < / Sup> | HRMS Mess [MH] - | &Dgr; M (MDA) |
| Brenztraubensäure | 87,0077 | 87 | NA | NA |
| Alanin ein | 88,0393 | 88.01 | 88,0374 | -0.19 |
| Milchsäure ein | 89,0233 | 89.01 | 89,0296 | 0,63 |
| Phosphorsäure | 96,9685 | 96,96 | 96,9625 | -0,6 |
| 2-Ketobuttersäure | 101.0233 | 101,02 | 101.0191 | -0,42 |
| 102,055 | 102,04 | 102.0528 | -0.22 | |
| Serin | 104.0342 | 104,02 | 104.0228 | -1,14 |
| Maleinsäure / Fumarsäure ein | 115.0026 | 115.03 | 115 | -0,26 |
| Bernsteinsäure ein | 117.0182 | 117.01 | 117.0125 | -0,57 |
| Threonin | 118.0499 | 118,04 | 118.0456 | -0,43 |
| Oxalessigsäure | 130.9975 | 131,03 | 130,991 | -0.65 |
| Asparaginsäure ein | 132.0291 | 132,03 | 132.0256 | -0.35 |
| Apfelsäure ein | 133.0132 | 133,02 | 133.0221 | 0,89 |
| Salicylsäure | 137.0233 | 137,02 | 137.0349 | 1,16 |
| α-Ketoglutarsäure | 145.0132 | 145.02 | 145.0063 | -0,69 |
| Glutaminsäure ein | 146.0448 | 146,01 | 146.0408 | -0,4 |
| Pentose | 149.0445 | 149.04 | 149.0414 | -0,31 | </ Tr>
| Aconitinsäure ein | 173.0081 | 173,03 | 173.0057 | -0,24 |
| Ascorbinsäure ein | 175.0237 | 175,05 | 175.0341 | 1,04 |
| Hexose | 179,055 | 179,05 | 179.0484 | -0,66 |
| Zitronensäure / Isozitronensäure ein | 191.0186 | 191,02 | 191.0166 | -0,2 |
| Palmitinsäure | 255.2319 | 255,22 | 255.2246 | -0,73 |
| Hexose-6-phosphat ein | 259.0213 | 259,04 | 259,014 | -0,73 |
| Stearinsäure | 283.2632 | 283,26 | 283.2552 | -0,8 |
| Saccharose ein | 341.1078 | 341,07 | 341.0972 | -1,06 |
eine MS / MS durchgeführt, für die Identifizierung.
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Discussion
Wie oben diskutiert, ist die Probenvorbereitung der wichtigste Schritt in der MSI Workflow. Die Einbettung des Gewebes verursachen ungleichmäßig Schneiden schwierig oder in einigen Fällen nicht möglich zu sein. Der Abschnitt Größe und angemessene Ausgleichszeit sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gewebeintegrität und Vermeidung von Falten und Tränen. Auswahl der Matrix-und Applikationstechnik eine Rolle bei der Bestimmung der Arten von Analyten zu erfassen ist, die räumliche Auflösung und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu spielen. Verwendung einer Kombination von Matrizen oder Anwendungstechniken könnten komplementäre Ergebnisse.
Diese Methode wurde speziell für ungezielte MSI endogener Metaboliten in M. entworfen truncatula Knöllchengewebe, kann aber leicht auf andere Gewebetypen und biologische Fragestellungen angepasst werden. Die empfohlenen Matrix Anwendungsmethoden für kleine Molekül MSI sind Sublimation und Spritzautomaten. Erhöhung der Menge des Lösungsmittels auf die tissu hinterlegte, durch Einstellen des automatischen Sprüher Verfahren wird die Extraktion von Analyten zu erhöhen und damit zum Nachweis von Verbindungen mit höherer Masse sollte man wählen, MSI Lipide, Peptide, etc. durchzuführen. Bei der Verwendung von anderen Arten von Gewebe, wird die Haupteinstellung der Schnittdicke sein. Idealerweise sollte das Gewebe in die Dicke einer Zelle in Scheiben geschnitten werden, daher dickere Abschnitte vielleicht für Pflanzengewebe und dünneren Abschnitten tierischem Gewebe geeignete geeignet. Wenn Falten oder Reißen auftritt, in der Regel eine längere Ausgleichszeit vor dem Schneiden benötigt wird oder eine Verdickung Größe könnte notwendig sein. Bei der Durchführung von LC-MS, um genaue Massen, das Gewebe Extraktionsprotokoll, mobile Phase Lösungsmittel und Farbverlauf, Spalte stationären Phase, und MS-Ionisations-Modus erhalten alle eingestellt und für den Analyten optimiert werden.
Der Hauptvorteil der MALDI-MSI ist die Fähigkeit, nicht nur Massen Informationen zu liefern, sondern auch räumliche Informationen für eine gegebene Probeohne vorherige Kenntnis der Zielanalyten. Andere bildgebende Verfahren erfordern den Einsatz von Derivatisierungen 5 oder Tags. Wie zuvor diskutiert, ist eine Einschränkung dieser Technik die Fülle der störende Matrixionenpeaks. Roman Matrizen wurde berichtet, dass diese Einschränkung. Alternativ ist Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS)-MSI eine matrixfreie Bildgebung Option, aber weniger Empfindlichkeit als MALDI-MSI-3 hat. Eine weitere Einschränkung dieser Technik ist die untere Massenauflösung von MALDI-TOF/TOF Instrumenten. Aufgrund der geringen Massenauflösungsvermögen, ist es notwendig, führen auch hochauflösende MS, um die Massen für genaue Identifizierung von Metaboliten, die mehr Experimente und mehr Zeit bedeutet, zu erhalten. Dieses Problem könnte durch die Durchführung der MALDI-MSI auf einem hochauflösenden Instrumentenplattform wie das MALDI-Orbitrap gelöst werden. Die endgültige Beschränkung der Durchführung MSI Experimente ist der Mangel an Software-Tools für die Analyse von MSI Daten vorhanden, although einige der jüngsten Fortschritte in der MSI-Software vorgenommen wurden 27,28. Typischerweise ist das MS-Spektrum für jeden Abbildungsbereich manuell analysiert und Ionen Bilder von Hand extrahiert. MSI Experimente produzieren eine Fülle von Daten und kann unglaublich zeitaufwendig zu analysieren. Insgesamt bietet die MALDI-MSI einzigartige Vorteile für den Erhalt von räumlichen Informationen von vielen Verbindungen gleichzeitig in einem einzigen Experiment, das sehr nützlich für das ungezielte Analyse von kleinen Molekülen und anderen Verbindungen mit vielen biologischen Anwendungen sein kann.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Jean-Michel Ané in der Abteilung für Pflanzenbau an der UW-Madison für die Bereitstellung von Medicago truncatula Proben bestätigen. Diese Arbeit wurde zum Teil aus Mitteln der National Science Foundation (NSF) unterstützt Zuschuss CHE-0957784, der Universität von Wisconsin Graduate School und der Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) und Romnes Fakultät Research Fellowship-Programm (LL). EG quittiert eine NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1256259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
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