Summary
Kitle spektometrik görüntüleme (MSI), biyolojik süreçler içine yeni anlayışlar sağlayabilir kendi doğal ortamlarında bileşikleri koruyarak, sağlam dokularda çeşitli kimyasal türler keşfetmek ve tanımlamak için kullanılan güçlü bir araçtır. Burada küçük moleküllerin analizi için geliştirilmiş bir MSI yöntem tarif edilmektedir.
Abstract
, Bu tür ilaçlar ya da endojen metabolit olarak küçük moleküller, çalışma potansiyel olarak 1 çalışılmaktadır metabolik yollar değişikliklere neden olabilir, ilgi konusu doku homojenizasyon gerektiren doku özleri istihdam için kullanılan çoğu teknikleri. Kitle spektometrik görüntüleme (MSI) biyolojik doku örneklerinin 1-5 bozulmamış dilimleri içinde Analitlerin mekansal bilgi verebilir güçlü bir analitik araçtır. Bu teknik, proteinler, peptitler, lipidler ve bu endojen metabolitler gibi küçük moleküller de dahil olmak üzere bileşiklerin çeşitli incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI)-MSI ile, birden fazla metabolit uzaysal dağılımı, aynı anda tespit edilebilir. Burada, baklagil kök ve kök üzerindeki nodüllerde hedefsiz metabolomiks MSI deneyler için özel olarak geliştirilmiş bir yöntem gerçekleşen biyolojik süreçlerin içine anlayışlar ortaya koyabilir sunulmuştur.yöntem Burada sunulan numune hazırlama görüntü edinimi, tipik bir MSI iş akışını gösterir ve küçük molekülleri tespit için yararlı birçok matris uygulama tekniklerini gösteren, matris uygulama adım üzerinde duruluyor. MS görsel üretildikten sonra, ilgi konusu metabolitlerin analizi ve tanımlanması tartışılan ve gösterilmiştir. Burada sunulan standart iş akışı kolayca farklı doku tiplerinin moleküler türler ve enstrümantasyon için modifiye edilebilir.
Introduction
Metabolitler ve büyüyen alan biyobelirtecin keşif, bitki ve diğer biyolojik sistemlerde metabolik yolları deşifre ve toksikoloji profil 4,6-10 dahil olmak üzere birçok önemli biyolojik uygulamalar vardır. Biyolojik sistemleri inceleyerek önemli teknik zorluk onlara 11 aksatmadan metabolomic yolları incelemektir. MALDI-MSI tek organlar 12,13 ve hatta tek hücre 14,15 analitlerin hassas algılama sağlar dokulara doğrudan analizi sağlar.
Örnek hazırlama, güvenilir ve tekrarlanabilir kütle spektral görüntüler üretiminde çok önemli bir adımdır. Görüntülerin kalitesi büyük ölçüde, doku gömme ortamı, dilim kalınlığı, MALDI matris ve matris uygulama tekniği gibi faktörlere bağlıdır. Görüntüleme uygulamaları için ideal bir kesit kalınlığı bir hücre (numune tipine bağlı olarak 8-20 um) genişliğidir. MALDI bir organik, kristalinin birikimi gerektirene matris bileşimi, analit ablasyon ve iyonizasyon yardımcı olmak için numune üzerine tipik olarak bir zayıf asit,. 16 farklı matrisler farklı sinyal yoğunlukları, müdahale iyonları ve bileşikleri farklı sınıflarının iyonizasyon verimliliği sağlar.
Matris aynı zamanda uygulama tekniği kütle spektrum görüntü ve farklı teknikler kalitesinde bir rol analitlerin farklı sınıflar için uygun oynar. Üç matris uygulama yöntemleri bu protokolü sunulmuştur: Pistole, otomatik püskürtücü, ve yüceltme. Airbrush matris uygulaması yaygın MALDI görüntülemede kullanılmıştır. Airbrush matris uygulamanın avantajı, nispeten hızlı ve kolay olmasıdır. Bununla birlikte, matris airbrush uygulamanın kalitesi büyük ölçüde kullanıcının beceri bağlıdır ve daha az tekrarlanabilir ve analitlerin difüzyon, özellikle de küçük moleküller 17 neden olma eğilimindedir. Otomatik püskürtücü sistemler ve matris uygulama airbrush benzer mekaniği var, ama have püskürtme daha tekrarlanabilir hale manuel pistole uygulamasıyla görülen farklılığı yok etmek için geliştirilmiştir. Bu yöntem bazen daha fazla zaman tüketen geleneksel airbrush matris uygulaması daha olabilir. Manuel airbrush ve otomatik püskürtücü sistemleri hem de solvent bazlı matris uygulaması yöntemlerdir. Ancak, özü ve yüksek kütle bileşikleri 18 gözlemlemek için çözücü gerekli yoksun; Sublime bu analit yayılmasını azaltır çünkü metabolitleri ve küçük moleküllerin kütle spektrum görüntüleme için daha popüler hale geliyor, kuru bir matris uygulaması tekniğidir.
Metabolitleri Emin kimlik genellikle tandem kütle MS / MS spektrumları standartları, edebiyat, veya teorik spektrumları karşılaştırılır ile doğrulama için (MS / MS) deneyleri, ardından varsayılan kimlik elde etmek için doğru bir kitle ölçümler gerektirir. Bu protokol, yüksek çözünürlükte (kütle m / z 400 at 60.000 çözme gücü), sıvı kromatografisi (LC)-MS Medicago biyolojik sistem olarak kökler ve kök nodüller truncatula kullanarak uzamsal bilgiler ve endojen metabolitlerin emin kimlik elde etmek üzere her ikisi de MALDI-MSI kuple edilir. MS / MS deneyler MALDI-MSI veya LC-MS ile doku özleri ile ilgili doku üzerine direkt olarak gerçekleştirilen ve metabolit özdeşimlerin doğrulama için kullanılabilir.
Bu protokol, M. endojen metabolitleri eşlemek için basit bir yöntem sağlar uyarlanmış ve çeşitli doku tipleri ve biyolojik sistemlerde küçük moleküllerin MSI uygulanabilir truncatula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Aletler
- MALDI-TOF/TOF MSI. Küçük moleküllerin analizi için bir MALDI kaynağı ile donatılmış bir kütle spektrometresi (Malzeme / Ekipmanları bkz. Tablo) kullanın. Ilgi Analitlerin bağlı olarak pozitif ya da negatif iyon modunda satın almalar gerçekleştirin. Ilgi konusu bir kitle aralığını belirleme ve iyon görüntüleri oluşturmak için numunenin yüzeyi boyunca x ve y boyutları hem de 50 um aralıklarla 500 lazer vuruşla / nokta toplar. Lazer çekim raster genişliği ve sayısı, sırasıyla daha yüksek uzamsal çözünürlük ve maksimum sinyal yoğunluğu elde etmek için ayarlanabilir. DHB matris tepe ya da kütle spektrumu kalibre etmek için slayt ya da doğrudan dokuya uygulanan iç standartları kullanarak.
- Yüksek Çözünürlüklü LC-MS. (Malzeme / Ekipmanları bkz. Tablo) LC-MS HILIC bir sütun ilgi analitlerle bağlı olan bir C-18 kolonu, veya normal faz (NP) ile ters faz (RP) LC kullanarak Çalıştır örnek özler. Mobil fazları ve kullanınözel numune türüne uygun olarak geçişlerini. Numune türüne bağlı olarak pozitif ya da negatif iyon modlarında satın almalar gerçekleştirin.
2. Doku Hazırlanması
- Nodüle bağlı kök 3-4 mm bırakarak, bitki kök nodül kesin.
- Hemen ayrıldıktan sonra, bir kriyostat fincan doku yerleştirin ve jelatin (deiyonize su içinde 100 mg / ml) ile karşılamak için forseps kullanır. Doku hava kabarcıkları ile fincanın alt tutulmak için bu gereklidir.
- Flaş jelatin sertleşir ve opak hale gelinceye kadar bir kuru buz / etanol banyosu içerisinde fincan yerleştirerek doku dondurma. -80 ° C'de kullanıma kadar saklayın örnekleri.
- Numuneler kaldırmak -80 ° C derin dondurucuya, plastik karyostat fincan kesip ve aşırı jelatin uzak trim. Ekim doku dokunmak icar değil iken, optimum kesim sıcaklığında (Ekim) medya bir kuruş büyüklüğünde bir miktar ile karyostat aynasının için gömülü doku monte edin. Kriostat koyunuzEkim katılaşıncaya kadar kutu.
- Ayna ve jelatin yaklaşık 15 dakika boyunca (-20 veya -25 ° C'ye set) karyostat kutusuna gelmesini sağlayınız.
- Arkasını (non-ITO ısıtarak ITO kaplı cam üzerine her dilim montaj sirostat (Malzeme / Ekipmanları bkz. Tablo) bölüm dokuya yaklaşık bir hücrenin kalınlığı (8-20 mikron doku tipine bağlı olarak) ve çözülme kullanın elinizin arkasında bir ITO kaplı cam slayt tarafı) kaplı. Dondurulmuş doku dilim yakın ısındı slayt ITO kaplı tarafı yerleştirin ve dilim slayt üzerine sopa sağlar. Slayt üzerinde birbirine yakın bölümlere yerleştirerek MSI sırasında daha iyi uyum sağlayacaktır.
3. Matrix Uygulama
- MALDI Matrix Airbrush Uygulama
- Tüm prosedürler pistole bir çeker ocak içinde yapılmalıdır.
- Iyice airbrush çözüm kabı ve memeyi (Malzeme / Ekipmanları bkz. Tablo) metanol ile temizleyin veDHB matris çözelti ile çözelti kabı doldurmak (% 50 methanol/0.1% TFA v 150 mg / ml / h).
- Yaklaşık 35 cm numuneden airbrush tutun ve 10 saniye püskürtme süresi ve her bir kat arasında 30 saniye kurutma süresi ile sürgünün yüzeyinde matris 10-15 kat uygulanır.
- Matris çözeltisinden tıkanmasını önlemek için bittiğinde metanol ile iyice tekrar airbrush temizleyin.
- MALDI Matrix Otomatik Püskürtme Uygulama
- Otomatik püskürtücü sistem üreticileri tarafından sağlanan start-up talimatları izleyin.
- 40 mg / ml 'si kullanılarak kök nodüllerde metabolitlerin MSI (% 50 methanol/0.1% TFA in v / v) DHB matris olarak, ~ 80 ° C, hızı 1250 mm / dk, 50 akış hızı için, sıcaklığı ayarlamak için ul / dakika, ve 24 geçiş sayısı. En iyi kapsama alanı için, bu ağızlık 90 ° ve / veya her bir geçiş arasında meme 1,5 mm ofset döndürmek için tavsiye edilir. Püskürtücü yöntemini başlatın.
Bir si olarakde not, burada kullanılan özel püskürtme sistemi, çözücünün buharlaştırılması için daha hızlı bir memeyi ısıtır. Çözücü buharlaşır olarak, matrisin hızlı konsantrasyonu artar. Hava püskürtmeli ve otomatik püskürtme ile numuneye uygulanan matris konsantrasyonları karşılaştırılabilir. - Otomatik püskürtücü sistem üreticileri tarafından sağlanan kapatma talimatları izleyin.
- MALDI Matrix Sublime Uygulama
- (Malzeme / Ekipmanları bkz. Tablo) yüceltme odasının dibine 300 mg DHB dışarı tartılır.
- Doku bölümleri çift taraflı iletken bant ile aşağı bakacak soğuk parmağı (yüceltme odasının üst kısmı) için cam slayt sopa. Hatta matriks birikimi üreten, hatta iletkenlik için çift taraflı bant ile slayt tüm geri örtün.
- Birlikte C-kelepçe ile süblimasyon haznesinin üst ve alt yarıları sıkıştırma parçası. Vakum ve reklam bağlayınüst rezervuar d buz ve soğuk su.
- Oda sıcaklığında, bir ısıtma gömleği içerisinde süblime odası yerleştirin.
- Vakum pompası açın. 15 dakika bekleyin ve ısıtma manto açın. Isıtma ceketi, 10 dakika boyunca, 120 ° C'ye ulaşması gerekir.
- 10 dakika sonra, ısı, vakum yakın valfi (yani odasının iç vakum altında kalır) kapatmak ve vakum pompası kapatın.
- Vakum basıncı serbest vanayı açmak ve numunenin çıkarılması, odacık oda sıcaklığına izin verir. Süblimasyon odasının büyüklüğü cam slayt süblimleştirilerek matris miktarını belirler. Küçük odalar (150 ml'lik bir cam kaba büyüklüğü) DHB 'yaklaşık 100 mg kullanır ve cam slayt kesim gerektirir ise daha büyük bir süblimasyon odalar (bir 400 ml çanak büyüklüğü) DHB' nin yaklaşık olarak 300 mg kullanır, böylece odacık uyar.
4. Image Acquisition
- <li> Mark "öğretmek noktaları" olarak kullanılacak bir WiteOut düzeltme sıvısı kalem ile numunenin her köşesinde bir + desen. MALDI slayt adaptör plaka içine cam slayt yerleştirin ve bir tarayıcı kullanarak örnek bir optik görüntü almak.
- 50 mikron bir raster adım büyüklüğü ve eşit veya raster adım boyutundan daha küçük bir lazer çaplı enstrüman şirket tarafından sağlanan yazılımı kullanarak bir görüntü elde etme dosyayı kurmak. Bu özel alet üzerinde, en az bir lazer ayarı 40-50 um bir çapa sahip yaklaşık olarak 10 um ve küçük lazer ayarı bir lazer çapı verir.
- Yazılımın içine optik görüntü yüklemek ve optik görüntü ile plaka hizalayın.
- Yaygın matris küme iyonları, iç standartları, veya bir kalibrasyon karışımını kullanarak satın başlamadan önce aleti kalibre.
- , Bir "boşluk" olarak kullanılmak üzere slayt üzerinde saf matris bir nokta da dahil olmak üzere MSI ile analiz edilecek doku alanı, belirtin.
- Ac başlayınedinirken karşılaşılan.
5. Görüntü Üretimi
- Satıcı tarafından sağlanan ticari yazılım olarak görüntüleme dosyayı açın ve iyon görüntüleri ayıklayın. Diğer açık kaynak yazılım MSI veri işleme 19 için kullanılabilir.
6. Metabolit Tanımlama
- Satıcıya özel yazılımını kullanarak kütle spektrumu ilgi belirli bir m / z (Malzeme / Ekipmanları bkz. Tablo) seçin. Bir analit tepe kütle spektrumu seçilmektedir ve iyon görsel özellikle doku bölümünde lokalize oluştuğunda bir analit, bir matris iyonu ayırt edilebilir.
- Bunlar analit bir listesini oluşturmak ve MS / MS deneyler. Analit numune listeleri için Temsilcisi Sonuçları Tablo 1 ve Tablo 2 bakınız.
- Doğru elde etmek için (varsa veya yüksek çözünürlükte MALDI-MS), bir yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile hedefli LC-MS analizi yapınkütle, ilgi konusu analitlerin ölçümleri ve ayrıca karakteristik parçalanma desenleri elde etmek için, hedef analitlerin LC-MS/MS gerçekleştirin.
- Hedef analitler için varsayılan kimlik belirleme için arama veri tabanı yapın. Metabolit veri tabanları arasında şunlar vardır: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG ve HMDB.
- Doğru kitle veritabanı araştırma gelen varsayılan kimlik doğrulamak için, standartlar, edebiyat, ve / veya parçalanma tahmini yazılım MS / MS spektrumları için hedeflenen analitlerden MS / MS maç.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MSI Deneysel bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir. Deneyin başında, numune hazırlama kritik bir adımdır. Nodüller bitki kökünden kesilmiş ve jelatin gömülür. Dondurulmuş edilirken doku, herhangi bir kabarcıkları ile, kriyostat fincan karşı bastırılmış olması gerekir, bu bölümlere edilirken bu doku daha kolay ve düzgün hizalama temin edecektir. Doku dilimlenmiş edilirken, bu, uygun kalınlıkta doku kesmek için önemli olan, çok kalın bölümden çıkarılan ve doku tespit analitlerin sayısını azaltacaktır bölme, çok ince doku bütünlüğünü bozma, gözyaşı. Matris ve uygulama tekniği seçimi tespit Analitlerin türlerini belirleyecek. Matrislerin bir arada kullanarak tamamlayıcı sonuçlar verebilir. Üç matris uygulama teknikleri bu işte sunulmuştur. Havalı fırça tekniği hızlı, ama küçük moleküllerin MSI olmak için, tipik olarak uygun değildirAnalit difüzyon neden olur. Otomatik püskürtme sistemleri ve süblimasyon küçük matris kristaller, daha iyi tekrarlanabilirlik ve daha az analit difüzyon sağlar. 2, Medicago truncatula kök nodül bölümünün bir optik görüntüsünü göstermektedir. 3 otomatik, boya tabancası kullanılarak matris kapsamı ve kristal boyutlarının bir optik görüntü örneğini göstermektedir sırasıyla püskürtücü, ve yüceltme.
DHB gibi geleneksel matrisleri, düşük kütle aralığı (m / z 100-400) 20 birçok iyonlar üretir. Bu matriks iyonlar bu aralıktaki metabolitlerin tespiti engelleyebilir. Şekil 4, sadece DHB matris MS spektrumları DHB matris ile kaplanmış nodül kök dokusuna kıyasla gösterir. DHB matris tepe mavi renkte gösterilir DHB kaplı kırmızı ve kök dokusunda nodül gösterilir. Örneğin TiO 2 nanopartiküller 21, 1,5-diaminonapthalene (DAN) 22, 2,3,4,5-tetrakis-(3 ', 4'-as Novel matrislerdihydroxylphenyl) tiofen (DHPT) 23 ve 1,8-bis (dimetil-amino) naftalin (DMAN) 24,25 düşük kütle aralığı matris iyonlarının paraziti azaltmak olduğunu bildirdi, ve aynı zamanda bazı sınıfların tespiti arttırmak olmuştur 5 metabolitler. Matris zirveleri MS görüntülerini kullanarak gerçek metabolitleri ayırt edilebilir. Bir tepe üzerine tıklandığında, iyon görüntü ayıklanır ve optik görüntü örtüşen görüntülenir. Dokuya ayrı lokalizasyonu ile görüntüler oluşturmak ve tek alan görüntüsü matris içinde mevcut olmayan bu pikler, metabolitler olarak kabul edilir. Şekil 5a nodül kök dokusunda bulunan metabolitlerin birkaç temsili iyon görüntü gösterir, Şekil 5b MS görüntü örneklerini gösterirken ilgili tepe matris karşılık gelir. Şekil 5a olarak görüntü kök nodül doku ve görüntüsü alınmıştır sadece alan matrisi içinde sinyalin eksikliğine ayrı lokalizasyonunu göstermektedir. Şekil 5B'de M. ilgi analitlerin örnek listesi truncatula kök nodül doku Tablo 1'de listelenen (pozitif mod) ve Tablo 2 (negatif mod) 4. edilir.
Hedeflenmemiş metabolomiks deneylerin nihai hedef tespit edilmiştir bileşikleri tanımlamaktır. Bir orta çözünürlükte alet bir TOF / TOF olarak (MKYS) ilgili MSI gerçekleştirirken, farklı bir şekilde doğru kütle ölçümleri elde etmek için gereklidir. Bu MALDI-MSI sonuçları doku özleri kullanarak yüksek çözünürlükte LC-MS verileri ile karşılaştırıldığında edildiği çok yönlü bir MS yaklaşım ile yapılabilir. Ilgi Analitlerin bağlı olarak seçim için birçok olası doku ekstraksiyon protokolleri vardır. Yüksek çözünürlüklü MS (HRMS), pozitif veya negatif iyonizasyon ay içinde yapılabilirdes ve normal veya ters faz LC ilgilenilen analit bağlı olan. Doğru bir kütle yüksek çözünürlüklü LC-MS ile elde edildikten sonra, elde edilen kütle, bir varsayılan kimlik elde etmek için, daha önce sıralanan çeşitli veri tabanları, aranabilir. Sonraki MS / MS verileri toplanır ve ilgilenilen bir analit 'in karakteristik fragmentasyon örneği standartları, literatür spektrumları, ya da teorik parçacık örnekleri ile karşılaştırılabilir. Şekil 6, MSI ve LC-MS ile tespit edilen metabolitlerin birinin bir örneğini göstermektedir. Bu metabolitin yüksek çözünürlüklü LC-MS ile toplanan MS / MS spektrum göre heme olarak tespit edilmiştir. Bu, MS / MS verileri ve daha önce Shimma Setou 26 tarafından yayınlanan MS / MS spektrumları ile karşılaştırılmıştır. İki MS / MS spektrumları maç, bu nedenle m / z 616.2 kimlik güvenle edebiyat MS / MS verilerine göre doğru kütle veritabanı araştırma ve MS / MS verilere dayalı heme olarak atandı.
Şekil 1. MSI akışı. Kök nodül Bakış kriostat ile kesitli jelatin gömülü bitki, gelen kesilmiş ve ITO kaplı cam slayt üzerine monte edilir. Matrix matrix üç uygulama tekniklerinden birini kullanarak slayt uygulanır. MSI edinimi bir MALDI-TOF/TOF kütle spektrometresi ile yapılır ve MS spektrumları MSI yazılım ile görüntülere derlenir.
Şekil 2. Doku örneği optik görüntü. Bir Medicago truncatula kök nodül doku bölümünde Temsilcisi optik görüntü.
Şekil 3,. Örnek matris depolanmaları a.) Hava tabancasıyla, b) otomatik püskürtücü, ve c) süblimasyon teknikleri ile matris birikimi farklı tutarlılığının Örnek gösteren görüntüler. Otomatik püskürtücü yöntem, küçük eşit büyüklükte kristaller üretir iken Pistole uygulaması yöntemi, büyük ve küçük kristaller oluşturur. Sublime bir matris hatta katman oluşturur. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Pla MS spektrumuDHB ile kaplı kök nodül dokusu vs DHB matris içinde. DHB matris tepe kırmızı gösterilir ve DHB ile kaplı kök nodül doku mavi renkte gösterilmiştir. Matrix zirveleri MS görüntüleri kullanarak gerçek metabolitleri ayırt edilebilir. Bir tepe üzerine tıklandığında, iyon görüntü ayıklanır ve optik görüntü örtüşen görüntülenir. Dokuya farklı lokalizasyonu ile görüntü oluşturmak ve bu zirveleri, sadece alan görüntülü matrisi içinde mevcut olmayan metabolitleri kabul edilir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 5,. M. MS images truncatula kök nodüller. a) metabolitleri f Temsilcisi iyon görüntüleriound yabani tip M. truncatula kök nodüller. b) metabolitleri kabul olmaz matris türün Temsilcisi iyon görüntüleri. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 6,. Metabolit tanımlanması için örnek MS / MS verileri. Heme [M +] olarak tanımlanan m / z 616.2, MS / MS spektrumudur. Kimyasal yapısı gösterilmiştir ve parçalanma yapıları atanır. Deneysel MS / MS verileri ve Shimma Setou 26 tarafından literatürde bildirilen Heme MS / MS spektrum ile karşılaştırılır.
Tablo 1. Ilgi Analitler -. Anal pozitif mod örnek listeM. ilgi Ytes pozitif iyon modunda 4 truncatula kök nodül doku.
| Metaboliti Adı | Teorik: [M + H] + | [M + H] + ölçüm MKYS | [M + H] + ölçüm HRMS | Δm (MDA) |
| γ-aminobütirik asit a | 104.0706 | 104.1 | 104.0706 | 0 |
| kolin a * | 104.1070 > | 104.1 | 104.1071 | 0.01 |
| prolin | 116.0706 | 116.07 | 116.0706 | 0 |
| valin | 118.0863 | 118.09 | 118.0865 | 0.02 |
| lösin | 132.1019 | 132.1 | 132.1022 | 0.03 |
| asparagin bir | h: 79px; "> 133,0608133.06 | 133.0602 | -0.06 | |
| adenin bir | 136.0618 | 136.07 | NA | NA |
| proling betain a | 144.1019 | 144.1 | 144.1024 | 0.05 |
| bir glutamin | 147.0764 | 147.09 | 147.0768 | 0.04 |
| 156.0768 | 156.06 | 156.0771 | 0.03 | |
| Bir arginin | 175.1190 | 175,13 | 175.1167 | -0.23 |
| sükroz + K | 381.0794 | 381,05 | 381.0791 | -0.03 |
| heme a * | 616.1768 | 616,15 | NA | NA |
| ht = "25" style = "height: 26px; width: 173px;"> NAD a | 664.1164 | 664,1 | NA | NA |
| Formononetin bir | 269.0808 | 269.08 | 269.0803 | 0.05 |
| chrysoseriol Glca bir | 477.1028 | 477.1 | 477.1008 | 0.2 |
| Formononetin MalGlc bir | 517.1341 | 517,13 | 517.1337 | idth: 64px; "> 0.04|
| aformosin MalGlc bir | 547.1446 | 547,16 | 547.1427 | 0.19 |
* [M +]
MS / MS tanımlama için gerçekleştirilir.
Tablo 2. Ilgi analitler -. M. ilgi analitlerin negatif mod örnek listesi Negatif iyon modunda 4 truncatula kök nodül doku.
| Metaboliti Adı | Teorik [MH] - | Ölçülen MKYS [MH] - < / Sup> | HRMS [MH] Ölçülen - | Δm (MDA) |
| piruvik asit | 87,0077 | 87 | NA | NA |
| alanin | 88,0393 | 88.01 | 88,0374 | -0.19 |
| laktik asit, | 89,0233 | 89.01 | 89,0296 | 0.63 |
| fosforik asit | 96,9685 | 96.96 | 96,9625 | -0.6 |
| 2-ketobutyric asit | 101.0233 | 101.02 | 101.0191 | -0.42 |
| 102,055 | 102.04 | 102.0528 | -0.22 | |
| serin | 104.0342 | 104.02 | 104.0228 | -1.14 |
| maleik / fumarik asit, | 115.0026 | 115.03 | 115 | -0.26 |
| süksinik asit, | 117.0182 | 117.01 | 117.0125 | -0.57 |
| treonin | 118.0499 | 118.04 | 118.0456 | -0.43 |
| oksalasetik asit | 130.9975 | 131.03 | 130,991 | -0.65 |
| aspartik asit, | 132.0291 | 132.03 | 132.0256 | -0.35 |
| malik asit, | 133.0132 | 133.02 | 133.0221 | 0.89 |
| salisiklik asit | 137.0233 | 137.02 | 137.0349 | 1.16 |
| α-ketoglutarik asit | 145.0132 | 145.02 | 145.0063 | -0.69 |
| glutamik asit, | 146.0448 | 146.01 | 146.0408 | -0.4 |
| pentoz | 149.0445 | 149.04 | 149.0414 | -0.31 | </ Tr>
| akonitik asit, | 173.0081 | 173.03 | 173.0057 | -0.24 |
| askorbik asit, | 175.0237 | 175.05 | 175.0341 | 1.04 |
| heksoz | 179,055 | 179.05 | 179.0484 | -0.66 |
| sitrik / izositrik asit, | 191.0186 | 191,02 | 191.0166 | -0.2 |
| palmitik asit | 255.2319 | 255.22 | 255.2246 | -0.73 |
| heksoz-6-fosfat | 259.0213 | 259,04 | 259,014 | -0.73 |
| stearik asit | 283.2632 | 283.26 | 283.2552 | -0.8 |
| sakaroz | 341.1078 | 341,07 | 341.0972 | -1.06 |
MS / MS tanımlama için gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda tartışıldığı gibi, örnek hazırlama MSI akışı en kritik adımdır. Dengesiz doku gömme bazı durumlarda olası zor ya da olmamak Kesit neden olacaktır. Kesit boyutu ve yeterli dengeleme zamanı doku bütünlüğünün korunması ve katlama ve gözyaşları kaçınarak için çok önemlidir. Matris ve uygulama tekniği seçimi tespit edilecek analitlerin türlerini belirlenmesinde rol, uzamsal çözünürlük ve sonuçların tekrar elde edilebilirliğini oynayacaktır. Matrisler veya uygulama teknikleri bir arada kullanmak tamamlayıcı sonuçlar verebilir.
Bu yöntem, M. endojen metabolitlerin hedeflenmeyen MSI için özel olarak tasarlanmıştır truncatula nodül kök dokusu, ama kolayca, diğer doku türleri ve biyolojik sorulara uyarlanabilir. Küçük molekül MSI için önerilen matris uygulama metodları yüceltme ve otomatik püskürtücü vardır. Tissu'nun üzerinde biriken çözücü miktarını artırmake, otomatik püskürtme yöntemi ayarlayarak, analitlerin çıkarma artacak ve bir vb lipidler, peptitler, MSI gerçekleştirmek için tercih edilmelidir yüksek kütle bileşiklerin tespiti için verir. Diğer doku tiplerini kullanırken, ana ayar kesit kalınlığı olacaktır. İdeal olarak, bir hücre, doku kalınlığına dilimlenmiş olmalıdır; bitki dokusu ve hayvan dokusu için uygun olan daha ince bölümler için bu nedenle daha kalın bölümler belki uygun. Katlama veya yırtılma meydana gelirse, tipik olarak daha uzun bir dengeleme süresi kesit önce gerekli olan veya daha kalın bir bölüm boyutu gerekli olabilir. Doğru kütleleri, doku çıkarma protokolü, mobil faz gradyanı çözücüler ve sütun bir durağan fazı ve MS iyonizasyon modu elde etmek için LC-MS gerçekleştirirken her ayarlandı ve ilgilenilen analit için optimize edilebilir.
MALDI-MSI ana avantajı kitle bilgi değil sadece sağlamak için yetenek değil, aynı zamanda belirli bir numune için mekansal bilgiHedef analit hakkında önceden bilgi sahibi için gerek kalmadan. Diğer görüntüleme teknikleri türevleştirmeler veya etiketleri 5 kullanılmasını gerektirir. Daha önce ele alındığı gibi, bu tekniğin bir sınırlama matrisi iyon pikleri müdahale bolluktur. Roman matrisler bu sınırlama adrese bildirilmiştir. Alternatif olarak, ikincil iyon kütle spektrometrisi (SIMS)-MSI bir matris içermeyen görüntüleme seçeneği, fakat MALDI-MSI 3 daha az hassastır. Bu tekniğin diğer bir sınırlama MALDI-TOF/TOF araçların düşük kütle çözünürlüğü olduğunu. Çünkü düşük kütle çözme güç, aynı zamanda daha fazla deneyler zaman anlamına gelir, metabolit tespiti için, doğru kitleleri elde etmek için yüksek çözünürlüklü MS gerçekleştirmek gereklidir. Bu sorun, MALDI-Orbitrap gibi yüksek çözünürlüklü bir enstrüman platform üzerinde MALDI-MSI yapılarak çözülebilir. MSI deneyler son sınırlama MSI verilerin analizi için mevcut yazılım araçları eksikliği, alt olduğuhough MSI yazılım bazı son gelişmeler 27,28 yapılmıştır. Tipik olarak her bir görüntüleme bölgesi için MS spektrum manuel olarak analiz edilmesi ve iyon görüntüleri elle ekstre edilmiştir. MSI deneyler veri bolluğu üreten ve inanılmaz zaman analiz alıcı olabilir. Genel olarak, MALDI-MSI birçok biyolojik uygulamalar ile küçük moleküller ve diğer bileşiklerin hedeflenmeyen analiz için son derece yararlı olabilir, tek bir deneyde bir çok aynı anda bileşiklerin uzamsal bilgiler elde etmek için benzersiz avantajlar sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar Medicago truncatula örnekleri sağlamak için UW-Madison Tarla Bitkileri Bölümü'nde Dr Jean-Michel Ane kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (NSF) fon tarafından kısmen desteklenen hibe CHE-0957784, Wisconsin Üniversitesi Enstitüsü ve Wisconsin Mezunlar Araştırma Vakfı (warf) ve Romnes Fakültesi Araştırma Bursu programı (LL). EG, bir NSF Lisansüstü Araştırma Bursu (DGE-1256259) kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
- Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, 130-145 (2013).
- Ye, H., Gemperline, E., Li, L. A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics. Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).
- Wei, R. Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry. Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).
- Kobayashi, T., et al. A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer. Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).
- West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics. Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).
- Spegel, P., et al. Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release. Biochem. J. 450, 595-605 (2013).
- Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics. J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).
- Prell, J., Poole, P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).
- Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation. Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).
- Stemmler, E. A., et al. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).
- Neupert, S., Predel, R. Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect. Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).
- Northen, T. R., et al. Clathrate nanostructures for mass spectrometry. Nature. 449, (2007).
- Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Chen, S., et al. 2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).
- Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
- Shroff, R., Svatos, A. Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).
- Shimma, S., Setou, M. Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).
- Paschke, C., et al. Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).
- Parry, R. M., et al. omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).
