Summary
Massaspectrometrische imaging (MSI) is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om verschillende chemische stoffen ontdekken en identificeren intacte weefsels behoud van de verbindingen in hun eigen omgeving, waarin nieuwe inzichten in biologische processen kunnen leveren. Hierin een MSI werkwijze ontwikkeld voor de analyse van kleine moleculen beschreven.
Abstract
De meeste technieken die worden gebruikt om kleine moleculen te bestuderen, zoals farmaceutische middelen of endogene metabolieten, weefselextracten gebruiken die de homogenisering van het weefsel van belang dat mogelijke veranderingen in de metabole routes onderzochte 1 veroorzaken vereisen. Massaspectrometrie imaging (MSI) is een krachtige analytische tool die ruimtelijke informatie van analyten kan bieden binnen intact plakjes biologisch weefsel monsters 1-5. Deze techniek is uitgebreid gebruikt om verschillende soorten verbindingen zoals eiwitten, peptiden, lipiden en kleine moleculen zoals endogene metabolieten bestuderen. Met matrix-assisted laser desorptie / ionisatie (MALDI)-MSI, kan ruimtelijke verdelingen van verschillende metabolieten gelijktijdig worden gedetecteerd. Hierin wordt een werkwijze speciaal ontwikkeld voor het uitvoeren irrelevante metabolomics MSI experimenten peulvrucht wortels en wortelknollen voorgelegd die inzicht in de biologische processen die kunnen onthullen. Dehier gepresenteerde methode toont een typische MSI workflow, van monstervoorbereiding tot beeldopname, en richt zich op de matrix toepassing stap demonstreren verschillende matrix applicatie technieken die nuttig zijn voor het opsporen van kleine moleculen zijn. Zodra de MS afbeeldingen worden gegenereerd, wordt de analyse en identificatie van metabolieten plaats besproken en aangetoond. De standaardwerkstroom hier gepresenteerde kan eenvoudig worden aangepast voor verschillende weefseltypen, moleculaire species en instrumentatie.
Introduction
De groeiende gebied van metabolomics heeft veel belangrijke biologische toepassingen, waaronder de ontdekking van biomarkers, het ontcijferen van metabole routes in planten en andere biologische systemen, en toxicologie profilering 4,6-10. Een belangrijke technische uitdaging bij het bestuderen van biologische systemen is om metabolomic trajecten studeren zonder verstoring van hen 11. MALDI-MSI zorgt voor een directe analyse van intacte weefsels die gevoelige detectie van analyten in staat stelt in enkele organen 12,13 en zelfs enkele cellen 14,15.
Monstervoorbereiding is een cruciale stap in het produceren van reproduceerbare en betrouwbare massaspectrale beelden. De kwaliteit van de beelden is sterk afhankelijk van factoren zoals weefsel inbeddingsmedium, plakdikte, MALDI matrix en matrix applicatietechniek. Voor grafische toepassingen, ideaal snijdikte is de breedte van een cel (8-20 micrometer afhankelijk van het monster). MALDI vereist depositie van een organische, crystallinee matrix bevatten, typisch een zwak zuur, de monster analyt verdamping en ionisatie helpen. 16 verschillende matrices verschillende signaalintensiteiten, storende ionen en ionisatie-efficiëntie van verschillende klassen van verbindingen.
De matrix applicatietechniek speelt ook een rol in de kwaliteit van massaspectrum afbeeldingen en verschillende technieken geschikt zijn voor verschillende soorten analyten. Drie matrix applicatie methoden worden in dit protocol: airbrush, automatische sproeier, en sublimatie. Airbrush matrix toepassing is op grote schaal gebruikt in de MALDI beeldvorming. Het voordeel van airbrush matrix toepassing is dat het relatief gemakkelijk. De kwaliteit van de matrix airbrush toepassing sterk afhankelijk van de vaardigheid van de gebruiker en de neiging minder reproduceerbaar en verspreiding van analyten, in het bijzonder kleine moleculen 17 veroorzaken. Automatische spuit systemen hebben vergelijkbare mechanica aan matrix toepassing airbrush, maar have ontwikkeld om de variabiliteit gezien met handmatige airbrush toepassing verwijderen, waardoor de nevel beter reproduceerbaar. Deze methode kan soms meer tijd in beslag dan de traditionele airbrush matrix toepassing zijn. Zowel handmatige airbrush en automatische spuit systemen zijn solvent-gebaseerde matrix applicatie methoden. Sublimatie is een droge matrix applicatie techniek die meer en meer populair wordt steeds voor de massa spectrale beeldvorming van metabolieten en kleine moleculen, want het vermindert analyt diffusie, maar het het oplosmiddel nodig ontbeert te halen en te observeren grotere massa verbindingen 18.
Zelfverzekerd identificatie van metabolieten vereist meestal accurate massa metingen om vermeende identificaties gevolgd door tandem massa (MS / MS)-experimenten voor validatie, met MS / MS-spectra worden vergeleken met de normen, literatuur, of theoretische spectra te verkrijgen. In dit protocol hoge resolutie (massa oplossend vermogen van 60.000 bij m / z 400), vloeistofchromatografie (LC)-MS wordt gekoppeld aan MALDI-MSI zowel ruimtelijke informatie en zelfverzekerd identificaties van endogene metabolieten te krijgen, met behulp van Medicago truncatula wortels en wortelknollen als het biologische systeem. MS / MS experimenten kunnen direct worden uitgevoerd op het weefsel met MALDI-MSI of weefselextracten met LC-MS en gebruikt voor de validatie van metaboliet identificaties.
Dit protocol biedt een eenvoudige methode om endogene metabolieten in M. kaart truncatula, die aangepast en toegepast op MSI van kleine moleculen in verschillende soorten weefsel en biologische systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Instrumentatie
- MALDI-TOF/TOF MSI. Gebruik een massaspectrometer uitgerust met een MALDI bron voor de analyse van kleine moleculen (zie tabel van Materialen / Equipment). Voer acquisities in positieve of negatieve ionen-modus, afhankelijk van de te bepalen analyten. Geef een massabereik plaats en laat 500 laserschoten / vlek bij 50 um intervallen in zowel de x en y dimensies op het oppervlak van het monster ionen beelden te genereren. De raster breedte en het aantal laserschoten kan worden aangepast aan hogere ruimtelijke resolutie en maximale signaalintensiteit respectievelijk te verkrijgen. Gebruik DHB matrix pieken of interne standaarden toegepast voor de dia of direct naar het weefsel om de massaspectra kalibreren.
- Hoge resolutie LC-MS. (Zie tabel van Materialen / Equipment) Ren monsterextracten met LC-MS met behulp van omgekeerde fase (RP) LC met een C-18 kolom, of normale fase (NP) met een kolom HILIC afhankelijk van de te bepalen analyten. Gebruik mobiele fasen engradiënten in voorkomend geval voor het specifieke type monster. Voer acquisities in positieve of negatieve ion modus afhankelijk van het type monster.
2. Tissue Voorbereiding
- Snijd de wortel knobbel van de plant, waardoor er 3-4 mm van de wortel die aan de knobbel.
- Onmiddellijk na sectie tang om het weefsel te plaatsen in een cryostaat kop en bedek met gelatine (100 mg / ml in gedeïoniseerd water). Het is essentieel om het weefsel vast te zitten aan de bodem van de beker zonder luchtbellen.
- Flash bevriezen het weefsel door het plaatsen van de beker in een droogijs / ethanol bad totdat de gelatine verhardt en ondoorzichtig. WINKEL monsters bij -80 ° C tot gebruik.
- Haal monsters uit de -80 ° C vriezer, snijd het plastic cryostaat beker en trim overtollige gelatine. Monteer de ingebed weefsel aan de cryostaat boorkop met een dubbeltje kleine hoeveelheid van optimale snijtemperatuur (oktober) media, terwijl niet latende oktober raken het weefsel. Plaats in cryostaatvak totdat het oktober stolt.
- Laat de boorkop en gelatine in evenwicht in de cryostaat doos (ingesteld op -20 of -25 ° C) gedurende ongeveer 15 minuten.
- Gebruik de cryostaat (zie Tabel Materiaal / Apparatuur) naar weefselsectie ongeveer de dikte van een cel (8-20 micrometer afhankelijk van het weefseltype) en dooi zet elk segment op de ITO bekleed glas door verwarming de achterkant (niet-ITO -gecoate zijde) van een ITO-gecoate glasplaatje op de rug van je hand. Plaats de ITO-gecoate zijde van de verwarmde glijbaan nabij het bevroren weefsel slice en laat het schijfje te plakken op de dia. Het plaatsen van de onderdelen dicht bij elkaar op de dia zal een betere afstemming te bieden tijdens MSI.
3. Matrix Application
- Airbrush Toepassing van MALDI Matrix
- Alle airbrush procedures moeten worden uitgevoerd in een zuurkast.
- De airbrush oplossing container en het mondstuk (zie tabel van materialen / apparatuur) met methanol grondig te reinigen envul de container met DHB matrix oplossing (150 mg / ml in 50% TFA methanol/0.1% v / v).
- Houd de airbrush ongeveer 35 cm van het monster en 10-15 lagen matrix passen op het oppervlak van de schuif met een duur van 10 seconden spray en 30 seconden droogtijd tussen elke laag.
- Nogmaals grondig reinigen van de airbrush met methanol als u klaar bent om te voorkomen dat verstopping van de matrix oplossing.
- Automatische Sproeier Toepassing van MALDI Matrix
- Volg de start-up instructies van de fabrikant van de automatische sproeisysteem.
- Voor MSI metabolieten in wortelknolletjes met 40 mg / ml (in 50% TFA methanol/0.1% v / v) DHB als matrix, de temperatuur tot ~ 80 ° C, snelheid tot 1250 mm / min, stroomsnelheid 50 pl / min en aantal passages tot 24. Voor de beste dekking, is het raadzaam om het mondstuk 90 ° en / of compensatie van de nozzle 1,5 mm tussen elke pas draaien. Start spuit methode.
Als side opmerking, de specifieke sproeisysteem hier gebruikt verwarmt de nozzle voor snellere verdamping van het oplosmiddel. Als het oplosmiddel verdampt, de concentratie van de matrix snel toe. De op het monster met de airbrush en de automatische spuit matrix hebben vergelijkbare concentraties. - Volg de shut-down instructies van de fabrikant van de automatische sproeisysteem.
- Sublimatie Toepassing van MALDI Matrix
- Weeg 300 mg DHB in de bodem van de sublimatie kamer (zie tabel van Materialen / Equipment).
- Plak het glaasje aan de koude vinger (bovenste gedeelte van de sublimatie kamer) met het weefsel secties naar beneden met dubbelzijdig, geleidende tape. Bedek de hele achterkant van de dia met de dubbelzijdige tape, zelfs voor geleidbaarheid, produceren zelfs matrix depositie.
- Klem de bovenste en onderste helften van de sublimatie kamer samen met de C-klem. Sluit de vacuüm en add ijs en koud water naar boven reservoir.
- Plaats sublimatie kamer in een verwarmings-mantel die op kamertemperatuur is.
- Schakel de vacuümpomp. Wacht 15 minuten en zet de verwarming mantel. De verwarming mantel moet bereiken 120 ° C in de loop van 10 minuten.
- Na 10 minuten, zet het vuur uit, sluit het ventiel bij vacuüm (zodat de binnenkant van de kamer blijft onder vacuüm) en schakel de vacuümpomp.
- Laat de kamer op kamertemperatuur te komen, open de kraan het loslaten van de onderdruk en verwijder het monster. De grootte van de sublimatie kamer wordt de hoeveelheid matrix gesublimeerde het glasplaatje bepalen. De grotere sublimatie kamers (de grootte van een bekerglas van 400 ml) wordt ongeveer 300 mg DHB gebruiken terwijl de kleinere kamers (de grootte van een bekerglas van 150 ml) gebruikt ongeveer 100 mg DHB en vereist snijden het glaasje zodat past in de kamer.
4. Image Acquisition
- <li> Mark een + patroon op elke hoek van het monster met een WiteOut correctievloeistof pen om te worden gebruikt als "les points". Plaats het glaasje in de MALDI dia adapterplaat en neem een optisch beeld van het monster met behulp van een scanner.
- Maak een beeldacquisitie bestand met de software van het instrument bedrijf met een raster stapgrootte van 50 urn en een laser diameter gelijk aan of kleiner dan de raster stapgrootte. Op dit instrument, de minimale laserinstelling geeft een laser diameter van ongeveer 10 urn en kleine laser instelling heeft een 40-50 urn diameter.
- Plaats het optische beeld in de software en zet de plaat met het optische beeld.
- Kalibreer het instrument voor het begin van de overname het gebruik van gemeenschappelijke matrix cluster ionen, interne standaarden, of een kalibratie-mix.
- Geef de weefselgebieden worden geanalyseerd MSI, waaronder een plek van pure matrix op de dia te gebruiken als "blanco".
- Begin acinquisitie.
5. Afbeelding Generation
- Open de beeldbestanden in de handel verkrijgbare software die door de verkoper en haal de ionen beelden. Andere open-source software is beschikbaar voor MSI gegevensverwerking 19.
6. Metaboliet Identificatie
- Selecteer een bepaald m / z van belangstelling van de massa-spectrum met behulp van de vendor specifieke software (zie tabel van Materialen / Equipment). Een analyt kan worden onderscheiden van een matrix ion wanneer een analyt piek is gekozen uit het massaspectrum en ionen beelden gegenereerd specifiek gelokaliseerd in de weefselsectie.
- Genereer een lijst van analyten en MS / MS experimenten uit te voeren. Zie tabel 1 en tabel 2 in Representatieve resultaten voor het monster lijsten van analyten.
- Voer gerichte LC-MS analyse op een hoge resolutie massaspectrometer (of hoge resolutie MALDI-MS indien beschikbaar) om nauwkeurige verkrijgenmassa metingen van de analyten en ook LC-MS/MS van de doelwitanalyten voeren om karakteristieke fragmentatiepatronen verkrijgen.
- Voer databank zoeken naar mogelijke identificaties voor de doelgerichte analyten te bepalen. Voorbeelden van metaboliet databases zijn: Metlin, Farmacotherapeutisch Kompas, PubChem, KEGG, en HMDB.
- Om het vermoedelijke identificatie van nauwkeurige massa zoeken in gegevensbanken bevestigen overeen met de MS / MS van het beoogde analyten MS / MS spectra van normen literatuur en / of fragmentatie predictie software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een experimentele overzicht van MSI is weergegeven in figuur 1. Helemaal aan het begin van het experiment, monstervoorbereiding is een cruciale stap. Knobbeltjes worden bijgesneden uit de plant met wortel en ingebed in gelatine. Het weefsel moet plat tegen de cryostaat kop worden ingedrukt, zonder bubbels, terwijl het wordt ingevroren, dit zal zorgen voor eenvoudiger en juiste uitlijning van het weefsel terwijl het wordt doorgesneden. Wanneer het weefsel wordt gesneden, is het belangrijk dat het weefsel op de juiste dikte gesneden, te dunne secties zal scheuren, tast het weefsel integriteit, terwijl een te dikke secties wordt het aantal analyten geëxtraheerd en gedetecteerd uit het weefsel te verminderen. Selectie van matrix en applicatietechniek de soorten analyten gedetecteerd bepalen. Met een combinatie van matrices kunnen aanvullende resultaten. Drie matrix applicatie technieken worden in dit werk. De airbrush techniek is snel, maar meestal niet geschikt voor MSI van kleine moleculenoorzaak van analyt diffusie. Automatische spuit systemen en sublimatie bieden kleinere matrix kristallen, betere reproduceerbaarheid, en minder analyt diffusie. Figuur 2 toont een optische afbeelding van een Medicago truncatula wortel knobbel sectie. Figuur 3 toont een optische afbeelding voorbeeld van de matrix dekking en kristal maten met behulp van airbrush, automatische spuitmachine, en sublimatie respectievelijk.
Conventionele matrices, zoals DHB, produceren vele ionen in het kleinere massa (m / z 100-400) 20. Deze matrix ionen kunnen interfereren met de detectie van metabolieten in dit gebied. Figuur 4 toont MS spectra van slechts DHB matrix vergelijking wortel knobbel weefsel bedekt met DHB matrix. DHB matrix pieken zijn aangegeven in rood en wortel knobbel weefsel bedekt met DHB wordt weergegeven in blauw. Nieuwe matrices zoals TiO 2 nanodeeltjes 21, 1,5-diaminonapthalene (DAN) 22, 2,3,4,5-tetrakis (3 ', 4'-dihydroxylphenyl) thiofeen (DHD) 23, en 1,8-bis (dimethyl-amino) naftaleen (DMAN) 24,25 gemeld dat de inmenging van matrix-ionen te verminderen in de lage massa bereik, en ook verbetering van de opsporing van bepaalde klassen van metabolieten 5. Matrix pieken te onderscheiden van echte metabolieten met MS afbeeldingen. Wanneer een piek wordt geklikt, wordt het imago van de ion gehaald en weergegeven overlappende het optische beeld. Die pieken die beelden te genereren met verschillende lokalisatie aan het weefsel, en zijn niet in de matrix enige gebied afgebeeld, beschouwd metabolieten. Figuur 5a toont verscheidene representatieve ionen beelden van metabolieten in wortel knobbel weefsel, terwijl figuur 5b toont voorbeelden van MS afbeeldingen overeenkomende met verwante pieken matrix. In figuur 5a toont het beeld duidelijke lokalisatie aan de wortel knobbel weefsel en een gebrek aan signaal in de matrix enige gebied dat werd in beeld gebracht. In figuur 5b M. truncatula wortel knobbel weefsel is opgenomen in tabel 1 (positieve modus) en tabel 2 (negatieve modus) 4.
Het einddoel van irrelevante metabolomics experimenten is om de verbindingen die werden gedetecteerd identificeren. Bij het uitvoeren van MSI op een gemiddelde resolutie instrument (mrms), zoals een TOF / TOF noodzakelijk is om nauwkeurige massa metingen vinden op een andere manier. Dit kan een veelzijdige MS benadering waarbij MALDI-MSI resultaten vergeleken met hoge resolutie LC-MS-gegevens met weefselextracten. Er zijn veel mogelijk weefsel extractieprotocollen om uit te kiezen, afhankelijk van de te bepalen analyten. Hoge resolutie MS (HRMS) kan in de positieve of negatieve ionisatie mo worden uitgevoerddes en met normale of omgekeerde fase LC, afhankelijk van de te bepalen analyten. Zodra een nauwkeurige massa is verkregen met een hoge resolutie LC-MS, kan de resulterende massa worden gezocht met diverse databases, eerder vermeld, een vermeende identificatie te verkrijgen. Volgende MS / MS gegevens worden verzameld en de karakteristieke fragmentatiepatroon van de analyt kan worden vergeleken met normen literatuur spectra of theoretische fragmentatiepatronen. Figuur 6 toont een voorbeeld van een van de gedetecteerde MSI en LC-MS metabolieten. Deze metaboliet werd geïdentificeerd als heem basis van de MS / MS-spectrum verzameld met hoge resolutie LC-MS. De MS / MS-gegevens vergeleken met de MS / MS spectra vroeger door Simea en Setou 26. De twee MS / MS spectra match derhalve de identiteit van m / z 616,2 vol is toegewezen als heem basis van nauwkeurige massa zoeken in gegevensbanken en MS / MS-gegevens vergeleken met literatuur MS / MS gegevens.
Figuur 1. Overzicht van MSI workflow. Wortelknolletjes zijn afgezet uit de plant, ingebed in gelatine, coupes met de cryostaat en gemonteerd op een ITO-gecoate glasplaatje. Matrix wordt toegepast op de dia via een van de drie matrix toepassingstechnieken. MSI overname wordt uitgevoerd met een MALDI-TOF/TOF massaspectrometer en MS-spectra worden gecompileerd in beelden met MSI software.
Figuur 2. Weefselmonster optisch beeld. Vertegenwoordiger optisch beeld van een Medicago truncatula wortel knobbel weefsel sectie.
Figuur 3. Voorbeeld matrix depositie. Representatieve beelden die de verschillende consistenties van matrix afzetting met) airbrush, b) automatische sproeier en c) sublimatietechnieken. De airbrush toepassing methode genereert grote en kleine kristallen, terwijl de automatische spuit methode produceert kleine gelijkmatig gerangschikte kristallen. Sublimatie produceert een gelijkmatige laag van matrix. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. MS spectrum van plain DHB matrix vs wortel knobbel weefsel bedekt met DHB. worden DHB matrix pieken aangegeven in rood en wortel knobbel weefsel bedekt met DHB wordt weergegeven in blauw. Matrix pieken te onderscheiden van echte metabolieten met MS afbeeldingen. Wanneer een piek wordt geklikt, wordt het imago van de ion gehaald en weergegeven overlappende het optische beeld. Die pieken die beelden te genereren met verschillende lokalisatie aan het weefsel, en zijn niet in de matrix enige gebied in beeld gebracht, worden beschouwd als metabolieten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. MS beelden van M. truncatula wortelknolletjes. a) Vertegenwoordiger ionen beelden van metabolieten found in wild-type M. truncatula wortelknolletjes. b) Vertegenwoordiger ionen beelden van matrix soorten die niet zou worden beschouwd als metabolieten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Voorbeeld MS / MS-gegevens voor identificatie metaboliet. MS / MS spectrum van m / z 616,2, geïdentificeerd als heem [M +]. De chemische structuur wordt getoond en fragmentatie structuren worden toegewezen. De experimentele MS / MS gegevens wordt vergeleken met het MS / MS spectrum van heem in de literatuur door Simea en Setou 26.
Tabel 1. Analyten -. Positieve modus Sample lijst van analeYtes belangstelling van M. truncatula wortel knobbel weefsel in positieve ion mode 4.
| Naam van de metaboliet | Theoretische [M + H] + | Mrms Gemeten [M + H] + | HRMS Gemeten [M + H] + | Δm (MDA) |
| γ-aminoboterzuur een | 104.0706 | 104.1 | 104.0706 | 0 |
| choline een, * | 104.1070 > | 104.1 | 104.1071 | 0.01 |
| proline | 116.0706 | 116,07 | 116.0706 | 0 |
| valine | 118.0863 | 118,09 | 118.0865 | 0.02 |
| leucine een | 132.1019 | 132,1 | 132.1022 | 0.03 |
| asparagine een | h: 79px; "> 133,0608133,06 | 133.0602 | -0.06 | |
| adenine een | 136.0618 | 136,07 | NA | NA |
| proling betaïne een | 144.1019 | 144.1 | 144.1024 | 0.05 |
| glutamine een | 147.0764 | 147,09 | 147.0768 | 0.04 |
| 156.0768 | 156,06 | 156.0771 | 0.03 | |
| arginine een | 175.1190 | 175,13 | 175.1167 | -0,23 |
| sucrose + K | 381.0794 | 381,05 | 381.0791 | -0.03 |
| heem een, * | 616.1768 | 616,15 | NA | NA |
| ht = "25" style = "height: 26px; width: 173px;"> NAD een | 664.1164 | 664,1 | NA | NA |
| formononetine een | 269.0808 | 269,08 | 269.0803 | 0.05 |
| chrysoseriol GlcA een | 477.1028 | 477,1 | 477.1008 | 0.2 |
| formononetine MalGlc een | 517.1341 | 517,13 | 517.1337 | idth: 64px; "> 0,04|
| aformosin MalGlc een | 547.1446 | 547,16 | 547.1427 | 0.19 |
* [M +]
een MS / MS uitgevoerd voor de identificatie.
Tabel 2. Analyten -. Negatieve modus Sample lijst van analyten uit M. truncatula wortel knobbel weefsel in negatieve ionen-modus 4.
| Naam van de metaboliet | Theoretische [MH] - | Mrms Gemeten [MH] - < / Sup> | HRMS Gemeten [MH] - | Δm (MDA) |
| pyrodruivenzuur | 87,0077 | 87 | NA | NA |
| alanine een | 88,0393 | 88.01 | 88,0374 | -0,19 |
| melkzuur een | 89,0233 | 89.01 | 89,0296 | 0,63 |
| fosforzuur | 96,9685 | 96.96 | 96,9625 | -0.6 |
| 2-ketobutyric zuur | 101.0233 | 101,02 | 101.0191 | -0,42 |
| 102,055 | 102,04 | 102.0528 | -0.22 | |
| serine | 104.0342 | 104.02 | 104.0228 | -1,14 |
| maleïnezuur / fumaarzuur a | 115.0026 | 115,03 | 115 | -0,26 |
| barnsteenzuur een | 117.0182 | 117,01 | 117.0125 | -0.57 |
| threonine | 118.0499 | 118,04 | 118.0456 | -0.43 |
| oxaalazijnzuur | 130.9975 | 131.03 | 130,991 | -0.65 |
| asparaginezuur een | 132.0291 | 132,03 | 132.0256 | -0.35 |
| appelzuur een | 133.0132 | 133,02 | 133.0221 | 0,89 |
| salicylzuur | 137.0233 | 137,02 | 137.0349 | 1.16 |
| α-ketoglutaarzuur | 145.0132 | 145,02 | 145.0063 | -0.69 |
| glutaminezuur een | 146.0448 | 146,01 | 146.0408 | -0.4 |
| pentose | 149.0445 | 149,04 | 149.0414 | -0.31 | </ Tr>
| aconietzuur een | 173.0081 | 173,03 | 173.0057 | -0,24 |
| ascorbinezuur een | 175.0237 | 175,05 | 175.0341 | 1.04 |
| hexose | 179,055 | 179,05 | 179.0484 | -0,66 |
| citroenzuur / isocitroenzuur een | 191.0186 | 191,02 | 191.0166 | -0,2 |
| palmitinezuur | 255.2319 | 255,22 | 255.2246 | -0,73 |
| hexose-6-fosfaat een | 259.0213 | 259,04 | 259,014 | -0,73 |
| stearinezuur | 283.2632 | 283,26 | 283.2552 | -0.8 |
| sucrose een | 341.1078 | 341,07 | 341.0972 | -1.06 |
een MS / MS uitgevoerd voor de identificatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals hierboven besproken, monstervoorbereiding is de meest kritische stap in de MSI workflow. Verankering van weefsel ongelijk veroorzaken snijden moeilijk of onmogelijk in sommige gevallen. Het gedeelte grootte en voldoende equilibratietijd zijn cruciaal voor het behoud van het weefsel integriteit en het vermijden van vouwen en scheuren. Selectie van matrix en applicatietechniek een rol bij het bepalen van de typen analyten te detecteren, de ruimtelijke resolutie en reproduceerbaarheid van de resultaten spelen. Met een combinatie van matrices of toepassingstechnieken kunnen aanvullende resultaten.
Deze methode is speciaal ontworpen voor ongerichte MSI van endogene metabolieten in M. truncatula wortel knobbel weefsel, maar kan gemakkelijk worden aangepast aan andere weefsels en biologische vragen. De aanbevolen matrix toepassing van methoden voor kleine molecule MSI zijn sublimatie en automatische sproeier. Het verhogen van de hoeveelheid oplosmiddel afgezet op de tissue, door het aanpassen van de automatische spuit methode, zal de extractie van analyten te verhogen en zorgen voor detectie van een hoger massa verbindingen moet men kiezen voor MSI uitvoeren van lipiden, peptiden, enz. Bij het gebruik van andere soorten weefsel, zal de belangrijkste aanpassing de sectie dikte. Idealiter het weefsel moet worden gesneden om de dikte van een cel, dus dikkere gedeelten misschien geschikt voor plantenweefsel en dunnere gedeelten geschikt voor dierlijk weefsel. Als vouwen of scheuren optreedt, meestal een langere equilibratietijd nodig is voordat het snijden of een dikkere vakmaat kan noodzakelijk zijn. Bij het uitvoeren van LC-MS om nauwkeurige massa, het weefsel extractieprotocol, mobiele fase oplosmiddelen en gradiënt, kolom stationaire fase en MS ionisatiemodus vinden kunnen allemaal worden aangepast en geoptimaliseerd voor de analyten.
Het belangrijkste voordeel van MALDI-MSI is de mogelijkheid om niet alleen massa informatie, maar ook ruimtelijke informatie voor een gegeven monsterzonder voorafgaande kennis van de doelanalyten. Andere beeldvormende technieken vereisen het gebruik van derivatiseringen of labels 5. Zoals eerder besproken, een beperking van deze techniek is de overvloed aan interfererende matrix ionen pieken. Nieuwe matrices gemeld om deze beperking te pakken. Als alternatief secundaire ionen massaspectrometrie (SIMS)-MSI is een matrixvrije imaging optie, maar het is minder gevoelig dan MALDI-MSI 3. Een andere beperking van deze techniek is de kleinere massa resolutie van MALDI-TOF/TOF instrumenten. Vanwege de lage massa oplossend vermogen, is het noodzakelijk om ook het uitvoeren van hoge resolutie MS om de nauwkeurige massa krijgen voor metaboliet identificatie, die meer experimenten en meer tijd betekent. Dit probleem kan worden opgelost door MALDI-MSI op een hoge resolutie instrumentplatform zoals MALDI-Orbitrap. De laatste beperking van het uitvoeren MSI experimenten is het gebrek aan beschikbare software voor de analyse van MSI data, although enkele recente ontwikkelingen in MSI software zijn gemaakt 27,28. Typisch de MS spectrum voor elke imaging regio moet handmatig worden geanalyseerd en ionen beelden geëxtraheerd met de hand. MSI experimenten produceren een overvloed aan gegevens en kan ongelooflijk tijdrovend om te analyseren. Kortom, MALDI-MSI biedt unieke voordelen voor het verkrijgen van ruimtelijke informatie van vele verbindingen tegelijkertijd binnen een experiment dat uiterst nuttig voor de irrelevante analyse van kleine moleculen en andere verbindingen met veel biologische toepassingen kunnen worden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr Jean-Michel Ane erkennen in de afdeling Agronomy op UW-Madison voor het verstrekken van Medicago truncatula monsters. Dit werk werd mede ondersteund door de financiering van de National Science Foundation (NSF) subsidie CHE-0957784, de Universiteit van Wisconsin Graduate School en de Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) en Romnes Faculteit Research Fellowship-programma (LL). EG erkent een NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1256259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
- Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, 130-145 (2013).
- Ye, H., Gemperline, E., Li, L. A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics. Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).
- Wei, R. Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry. Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).
- Kobayashi, T., et al. A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer. Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).
- West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics. Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).
- Spegel, P., et al. Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release. Biochem. J. 450, 595-605 (2013).
- Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics. J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).
- Prell, J., Poole, P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).
- Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation. Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).
- Stemmler, E. A., et al. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).
- Neupert, S., Predel, R. Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect. Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).
- Northen, T. R., et al. Clathrate nanostructures for mass spectrometry. Nature. 449, (2007).
- Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Chen, S., et al. 2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).
- Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
- Shroff, R., Svatos, A. Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).
- Shimma, S., Setou, M. Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).
- Paschke, C., et al. Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).
- Parry, R. M., et al. omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).
