質量分析イメージング（MSI）は、生物学的プロセスに新たな洞察を提供することができ、ネイティブ環境で化合物を保持し、無傷の組織内の様々な化学種を発見し、識別するために使用することができる強力なツールです。本明細小分子の分析のために開発MSI方法が記載されている。
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この記事について
サマリー
要約
そのような医薬品または内因性代謝産物などの小分子を研究する潜在的に1検討されて代謝経路の変化を引き起こす可能性が目的の組織の均質化を必要とする組織抽出物を使用するために使用される大部分の技術を含む。質量分析イメージング（MSI）は、生物学的組織サンプル1-5の完全なスライス内の分析物の空間的な情報を提供することができる強力な分析ツールです。この技術は、タンパク質、ペプチド、脂質、および内因性代謝産物などの小分子を含む様々なタイプの化合物を研究するために広く使用されている。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI）-MSIでは、複数の代謝物質の空間分布を同時に検出することができる。ここでは、マメ科植物の根と根粒に非標的メタボロミクスのMSI実験を行うために特別に開発された方法が行われている生物学的プロセスへの洞察を明らかにする可能性が提示されている。ザ·ここに提示した方法は、サンプル調製からの画像取得のために、典型的なMSIワークフローを示し、および小分子を検出するために有用であるいくつかのマトリックス適用技術を実証行列適用工程に焦点を当てている。 MS画像が生成されると、関心のある代謝物の分析および同定は議論され示されている。ここに提示標準ワークフローを容易に異なる組織型、分子種、および計測のために修飾することができる。
概要
メタボロミクスの成長分野は、バイオマーカーの発見、植物や他の生物系における代謝経路を解読、および毒性プロファイリング4,6-10を含む多くの重要な生物学的なアプリケーションを持っています。生物学的システムを研究の主要な技術的な課題は、彼らに11を中断することなく、メタボローム経路を研究することです。 MALDI-MSIは、単一臓器12,13、さらには単一細胞14,15中の分析物の高感度検出を可能にし、無傷の組織の直接的な分析を可能にする。
試料調製は、再現可能かつ信頼性の高い質量スペクトル画像を生成する上で重要なステップである。画像の品質が大きく、組織包埋媒体、スライス厚、MALDIマトリックス、およびマトリックス適用技術などの要因に依存する。撮像用途のために、理想的な断面の厚さは一つのセル（試料の種類に応じて8〜20ミクロン）の幅である。 MALDIは、有機、クリスタリンの堆積を必要とする検体アブレーションおよびイオン化を支援するために、試料上の電子のマトリックス化合物、典型的には、弱酸、16の異なる行列が異なる信号強度、干渉イオン、および化合物の異なるクラスのイオン化効率を提供する。
行列適用技術は、質量分光画像の品質の役割を果たし、異なる技術が、分析物の異なるクラスに適している。三つの行列の適用方法は、この....
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プロトコル
1。計装
- MALDI-TOF/TOF MSI。 （材料/機器の表を参照）の小分子の分析のためのMALDI源を備えた質量分析装置を使用してください。目的の分析に応じて、正または負イオンモードでの買収を実行します。関心の質量範囲を指定し、イオン画像を生成するために、サンプルの表面を横切って、XとYの両方の次元が50μm間隔で500レーザーショット/スポットを集める。レーザーショットのラスタ幅及び数は、それぞれ、より高い空間分解能と最大信号強度を得るために調整することができる。 DHBマトリックスピークまたは質量スペクトルを校正するためにスライドに直接組織に適用される内部標準を使用してください。
- 高分解能LC-MS。 HILICカラムは目的の分析に依存して、C-18列、または順相（NP）のいずれかで逆相（RP）LCを用いたLC-MSで実行サンプル抽出物（材料/機器の表を参照）。移動相を使用し、特定のサンプルの種類に応じてグラデーション。試料の種類に応じて正又は負イオンモードでの取得を行う。
2。組織標本
- 結節に付着し、ルート3-4ミリメートル残して、植物からの根粒をトリミング。
- すぐに解剖した後、クライオスタットカップに組織を配置し、ゼラチン（脱イオン水に100ミリグラム/ ml）でカバーするために鉗子を使用しています。組織が無気泡とのカップの底に貼付される....
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結果
MSIの実験の概要を図1に示す。実験の最初に、サンプル調製は重要な工程である。結節は、植物の根からトリミングし、ゼラチン中に埋設されている。それが凍結されている間組織は、無気泡、クライオスタットカップに対して平らにプレスされている必要があり、それが区分されている間、これは組織のより容易かつ適切な整合性を確保します。組織はスライスされている場合には、適切な厚さで組織を切断することが重要である。切片の薄すぎ切片の厚すぎる組織から抽出され、検出された検体の数を減少する一方、組織の完全性を台無しに、裂ける。マトリックスおよび適用技術の選択は、検出された検体の種類を決定する。行列の組み合わせを使用すると、相補的な結果を提供することができる。三つの行列適用技術はこの研究で提示されている。エアブラシ技術は高速で、そうである低分子のMSIのために典型的には適切ではありません分析対象物の拡散の原因。自動噴霧器システムおよび昇華がより小さなマトリックス結晶、より良好な再現性、少ない検体の拡散を提供する。2 ウマゴヤシtruncatula根粒部の光学像を示.......
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ディスカッション
上述のように、試料調製は、MSIのワークフローの中で最も重要な工程である。不均一な組織を埋め込むと、いくつかのケースでは困難または不可能であることが切片なります。セクションのサイズ及び適切な平衡時間は、組織の完全性を維持し、折り畳みおよび涙を避けるために重要である。マトリックスおよび適用技術の選択は、検出されるべき分析対象物の種類を決定する役割、空間分解能、及び結果の再現性を再生する。マトリックスまたは塗布技術の組み合わせを使用すると、相補的な結果を提供することができる。
このメソッドは、Mの内因性代謝物の非標的MSIのために特別に設計されましたtruncatula根粒組織が 、容易に他の組織型および生物学的質問に適合させることができる。小分子MSIのための推奨行列適用方法は昇華し、自動噴霧器である。 TISSU上に堆積された溶媒の量を増加させる一つは、脂質、ペプチドなどのMSIを実行するように選択する必要があり、eは、自動噴霧器法を調整することにより、分析物の抽出を増加し、より高い質量化合物の検出を可能にする。他のタイプの.......
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開示事項
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
謝辞
著者は、 ウマゴヤシtruncatulaサンプルを提供するためのウィスコンシン大学マディソン校での栽培の部門の博士ジャン=ミシェル·ANEを承認したいと思います。この作品は、全米科学財団（NSF）からの資金によって部分的にサポートされていた補助金哲0957784、ウィスコンシン大学大学院ウィスコンシン同窓会研究財団（WARF）とRomnes学部研究フェローシッププログラム（LLまで）。 EGは、NSF大学院研究フェローシップ（DGE-1256259）を認めている。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ゼラチン | Difco | 214340 | 熱で溶解 |
| クライオスタット- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| 酸化インジウム錫 (ITO) コーティング スライドガラス | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (幅 x 長さ x 厚さ) |
| 2,5-ジヒドロキシ安息香酸 (DHB) マトリックス | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| エアブラシ | Paasche エアブラシ会社 | TG-100D | と 75 ml スチール容器 |
| 自動マトリックス噴霧器システム - TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSPです。H021-U | 装置を設置すると、特定の起動とシャットダウンの指示が与えられます |
| 昇華装置 | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vacucumポンプ- Alcatel 2008理想的な | 真空製品 | P10976 | 究極の圧力= 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | ブルカーダルトニクス | 276601 | |
| FlexImaging | ブルカーダルトニクス | 269841 | 「ベンダー専用ソフトウェア」の一例 |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | 高精度質量測定のための高解像度 MALDI 装置 |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | 精密質量測定のための高分解能 LC-MS 装置 |
参考文献
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217....
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再版と許可
