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Biology

में मेटाबोलाइट्स के जांच के लिए MALDI-बड़े पैमाने पर spectrometric इमेजिंग Published: March 5, 2014 doi: 10.3791/51434
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Wisconsin- Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin- Madison

Summary

बड़े पैमाने पर spectrometric इमेजिंग (एमएसआई) जैविक प्रक्रियाओं में नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं जो अपने मूल वातावरण में यौगिकों के संरक्षण बरकरार ऊतकों में विभिन्न रासायनिक प्रजातियों की खोज और पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली उपकरण है. इस के साथ साथ छोटे अणुओं के विश्लेषण के लिए विकसित की एक MSI विधि वर्णित है.

Abstract

, ऐसी दवाइयों या अंतर्जात मेटाबोलाइट्स के रूप में छोटे अणुओं का अध्ययन संभवतः 1 अध्ययन किया जा रहा चयापचय मार्ग में परिवर्तन का कारण बन सकता है कि ब्याज की ऊतक के homogenization की आवश्यकता होती है जो ऊतकों के अर्क को रोजगार के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल तकनीक. बड़े पैमाने पर spectrometric इमेजिंग (एमएसआई) जैविक ऊतक के नमूने 1-5 बरकरार स्लाइस भीतर analytes की स्थानिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं कि एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण है. इस तकनीक को प्रोटीन, पेप्टाइड, लिपिड, और इस तरह के अंतर्जात मेटाबोलाइट्स के रूप में छोटे अणुओं सहित यौगिकों के विभिन्न प्रकार के अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण (MALDI) MSI, कई मेटाबोलाइट्स के स्थानिक वितरण एक साथ पाया जा सकता है. इस के साथ साथ, फली जड़ों और जड़ पिंड पर अलक्षित metabolomics MSI प्रयोगों के संचालन के लिए विशेष रूप से विकसित एक विधि जगह लेने जैविक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि बता सकता है जो प्रस्तुत किया है.विधि यहाँ प्रस्तुत नमूना तैयार करने से छवि अधिग्रहण करने के लिए, एक ठेठ MSI कार्यप्रवाह से पता चलता है, और छोटे अणुओं का पता लगाने के लिए उपयोगी होते हैं कि कई मैट्रिक्स आवेदन तकनीकों का प्रदर्शन, मैट्रिक्स आवेदन कदम पर केंद्रित है. एमएस छवियों को उत्पन्न कर रहे हैं, ब्याज की मेटाबोलाइट्स के विश्लेषण और पहचान पर चर्चा की और प्रदर्शन किया है. यहाँ प्रस्तुत मानक कार्यप्रवाह आसानी से विभिन्न प्रकार के ऊतकों, आणविक प्रजातियों, और इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए संशोधित किया जा सकता है.

Introduction

metabolomics के बढ़ते क्षेत्र biomarker खोज, पौधों और अन्य जैविक प्रणालियों में चयापचय मार्ग का गूढ़ रहस्य, और विष विज्ञान रूपरेखा 4,6-10 सहित कई महत्वपूर्ण जैविक आवेदन किया है. जैविक प्रणालियों का अध्ययन करते समय एक प्रमुख तकनीकी चुनौती उन्हें 11 में खलल न डालें बिना metabolomic रास्ते का अध्ययन करना है. MALDI-MSI एकल अंगों 12,13 और भी एकल कक्षों 14,15 में analytes की संवेदनशील पता लगाने में सक्षम बनाता है बरकरार ऊतकों के प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.

नमूना तैयार करने प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय जन वर्णक्रमीय छवियों के निर्माण में एक महत्वपूर्ण कदम है. छवियों की गुणवत्ता में काफी ऐसे ऊतक एम्बेडिंग मध्यम, टुकड़ा मोटाई, MALDI मैट्रिक्स, और मैट्रिक्स आवेदन तकनीक जैसे कारकों पर निर्भर करता है. इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए, आदर्श अनुभाग मोटाई एक सेल (नमूना प्रकार के आधार पर 8-20 माइक्रोन) की चौड़ाई है. MALDI एक कार्बनिक, crystallin के बयान की आवश्यकताई मैट्रिक्स परिसर, analyte पृथक और आयनीकरण की सहायता के लिए नमूना पर आम तौर पर एक कमजोर एसिड,. 16 विभिन्न matrices अलग संकेत तीव्रता, दखल आयनों, और यौगिकों के विभिन्न वर्गों के आयनीकरण क्षमता प्रदान करते हैं.

मैट्रिक्स आवेदन तकनीक भी जन वर्णक्रमीय छवियों और विभिन्न तकनीकों की गुणवत्ता में एक भूमिका analytes की विभिन्न कक्षाओं के लिए उपयुक्त हैं निभाता है. तीन मैट्रिक्स आवेदन तरीकों इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत कर रहे हैं: airbrush, स्वचालित स्प्रेयर, और उच्च बनाने की क्रिया. एयरब्रश मैट्रिक्स आवेदन व्यापक रूप से MALDI इमेजिंग में इस्तेमाल किया गया है. airbrush मैट्रिक्स आवेदन का लाभ यह अपेक्षाकृत तेज और आसान है. हालांकि, airbrush मैट्रिक्स आवेदन की गुणवत्ता बहुत उपयोगकर्ता के कौशल पर निर्भर करता है और कम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होना और analytes की प्रसार, विशेष रूप से छोटे अणुओं 17 पैदा करता है. स्वचालित स्प्रेयर सिस्टम मैट्रिक्स आवेदन airbrush के समान यांत्रिकी है, लेकिन हवलदारई स्प्रे अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाने, पुस्तिका airbrush आवेदन के साथ देखा परिवर्तनशीलता को दूर करने के लिए विकसित किया गया. इस विधि कभी कभी अधिक समय लेने वाली पारंपरिक airbrush मैट्रिक्स आवेदन की तुलना में किया जा सकता है. पुस्तिका airbrush और स्वचालित स्प्रेयर सिस्टम दोनों विलायक आधारित मैट्रिक्स आवेदन तरीके हैं. हालांकि, इसे निकालने और उच्च द्रव्यमान यौगिकों 18 निरीक्षण करने के लिए विलायक आवश्यक अभाव है, उच्च बनाने की क्रिया यह analyte प्रसार को कम कर देता है क्योंकि मेटाबोलाइट्स और छोटे अणुओं की जन वर्णक्रमीय इमेजिंग के लिए अधिक से अधिक लोकप्रिय होता जा रहा है कि एक सूखी मैट्रिक्स आवेदन तकनीक है.

मेटाबोलाइट्स की आत्मविश्वास से लबरेज पहचान आम तौर पर मिलकर जन एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा मानकों, साहित्य, या सैद्धांतिक स्पेक्ट्रा की तुलना में किया जा रहा है साथ मान्यता के लिए (एमएस / एमएस) प्रयोगों द्वारा पीछा ख्यात पहचान प्राप्त करने के लिए जन सटीक माप की आवश्यकता है. इस प्रोटोकॉल उच्च संकल्प में (जन एम / Z 400 पर 60,000 की शक्ति को हल), तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा) एमएस Medicago जैविक प्रणाली के रूप में जड़ों और जड़ पिंड truncatula का उपयोग, स्थानिक जानकारी और अंतर्जात मेटाबोलाइट्स का पूरा भरोसा पहचान दोनों प्राप्त करने के लिए MALDI-एमएसआई के लिए युग्मित है. एमएस / एमएस प्रयोगों MALDI-एमएसआई के साथ या नियंत्रण रेखा एमएस के साथ ऊतक निष्कर्षों पर ऊतक पर सीधे प्रदर्शन किया और metabolite पहचान के सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल एम. में अंतर्जात मेटाबोलाइट्स नक्शा करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है अनुकूलित और विभिन्न प्रकार के ऊतकों और जैविक प्रणालियों में छोटे अणुओं का एमएसआई के लिए लागू किया जा सकता है जो truncatula,.

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Protocol

1. उपकरण

  1. MALDI-TOF/TOF MSI. छोटे अणुओं के विश्लेषण के लिए एक MALDI स्रोत से लैस एक मास स्पेक्ट्रोमीटर (सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) का प्रयोग करें. ब्याज की analytes के आधार पर सकारात्मक या नकारात्मक आयन मोड में अधिग्रहण को पूरा करें. ब्याज की एक सीमा जन निर्दिष्ट करें और आयन छवियों को उत्पन्न करने के लिए नमूना की सतह भर में एक्स और वाई आयाम दोनों में 50 माइक्रोन अंतराल पर 500 लेजर शॉट / जगह इकट्ठा. लेजर दृश्यों की रेखापुंज चौड़ाई और संख्या क्रमशः उच्च स्थानिक संकल्प और अधिकतम तीव्रता संकेत प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. DHB मैट्रिक्स चोटियों या जन स्पेक्ट्रा जांच करने के लिए स्लाइड करने के लिए या सीधे ऊतकों को लागू आंतरिक मानकों का प्रयोग करें.
  2. उच्च संकल्प नियंत्रण रेखा एमएस. (सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) नियंत्रण रेखा एमएस एक HILIC स्तंभ ब्याज की analytes पर निर्भर करता है के साथ एक सी -18 स्तंभ, या सामान्य चरण (एनपी) के साथ उलट चरण (आरपी) नियंत्रण रेखा या तो उपयोग करने के साथ चलाने के लिए नमूना अर्क. मोबाइल चरणों और प्रयोगविशिष्ट नमूना प्रकार के लिए उचित रूप में ढ़ाल. नमूना प्रकार के आधार पर सकारात्मक या नकारात्मक आयन मोड में अधिग्रहण को पूरा करें.

2. ऊतक तैयारी

  1. गुत्थी से जुड़ी जड़ से 3-4 मिमी, छोड़ संयंत्र से जड़ गुत्थी ट्रिम.
  2. इसके तत्काल बाद विच्छेदन के बाद, एक cryostat कप में ऊतक जगह और जिलेटिन (विआयनीकृत पानी में 100 मिलीग्राम / एमएल) के साथ कवर करने के लिए संदंश का उपयोग करें. ऊतक कोई हवाई बुलबुले के साथ कप की तह तक अटक होने के लिए यह आवश्यक है.
  3. फ्लैश जिलेटिन और मज़बूत बनाता है और अपारदर्शी हो जाता है जब तक एक सूखी बर्फ / इथेनॉल स्नान में कप रखकर ऊतक फ्रीज. -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर स्टोर नमूनों.
  4. से नमूने निकालें -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर, प्लास्टिक cryostat कप दूर कटौती और अतिरिक्त जिलेटिन दूर ट्रिम. अक्टूबर ऊतक स्पर्श नहीं दे रहा है, जबकि इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) मीडिया के एक सिक्के के आकार राशि के साथ cryostat चक एम्बेडेड ऊतक माउंट. Cryostat में जगहअक्तूबर solidifies तक बॉक्स.
  5. चक और जिलेटिन लगभग 15 मिनट के लिए (-20 या -25 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट) cryostat बॉक्स में संतुलित करने की अनुमति दें.
  6. पीठ (गैर इतो वार्मिंग से आईटीओ लेपित गिलास पर प्रत्येक टुकड़ा माउंट cryostat (सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) खंड के ऊतकों को लगभग एक सेल की मोटाई (8-20 माइक्रोन ऊतक प्रकार पर निर्भर करता है) और पिघलना का प्रयोग करें अपने हाथ की पीठ पर एक आईटीओ लेपित गिलास स्लाइड के पक्ष) में लिपटे. जमे हुए ऊतक टुकड़ा निकट गरम स्लाइड के आईटीओ में लिपटे की ओर रखें और टुकड़ा स्लाइड पर छड़ी करने के लिए अनुमति देते हैं. स्लाइड पर करीब एक साथ वर्गों रखकर एमएसआई के दौरान बेहतर संरेखण प्रदान करेगा.

3. मैट्रिक्स आवेदन

  1. MALDI मैट्रिक्स की एयरब्रश आवेदन
    1. सभी airbrush प्रक्रियाओं एक धूआं हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
    2. अच्छी तरह से airbrush समाधान कंटेनर और नोजल (सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) मेथनॉल के साथ स्वच्छ औरDHB मैट्रिक्स समाधान के साथ समाधान कंटेनर को भरने के (50% methanol/0.1% TFA वी में 150 मिलीग्राम / एमएल / वी).
    3. लगभग 35 सेमी नमूना से airbrush पकड़ो और एक 10 सेकंड स्प्रे की अवधि और प्रत्येक कोट के बीच में 30 सेकंड के समय सुखाने के साथ स्लाइड की सतह पर मैट्रिक्स के 10-15 कोट लागू होते हैं.
    4. मैट्रिक्स समाधान से clogging से बचने के लिए जब समाप्त अच्छी तरह से मेथनॉल के साथ फिर से airbrush साफ.
  2. MALDI मैट्रिक्स की स्वचालित स्प्रेयर आवेदन
    1. स्वचालित स्प्रेयर प्रणाली के निर्माताओं द्वारा प्रदान शुरू हुआ निर्देशों का पालन करें.
    2. 40 मिलीग्राम / एमएल का उपयोग कर जड़ पिंड में मेटाबोलाइट्स के एमएसआई (50% methanol/0.1% TFA वी में / वी) DHB मैट्रिक्स के रूप में, ~ 80 डिग्री सेल्सियस, वेग को 1,250 मिमी / मिनट, 50 को दर करने के लिए प्रवाह तापमान सेट के लिए μl / मिनट, और 24 के लिए पास की संख्या. सबसे अच्छा कवरेज के लिए, यह नोक 90 डिग्री और / या प्रत्येक पारित के बीच नोक 1.5 मिमी ऑफसेट बारी बारी से करने की सिफारिश की है. स्प्रेयर विधि प्रारंभ करें.
      एक सी के रूप मेंडे ध्यान दें, यहां इस्तेमाल विशेष स्प्रेयर प्रणाली विलायक की तेजी से वाष्पीकरण के लिए नोक तपता है. विलायक उड जाती है, मैट्रिक्स की एकाग्रता जल्दी से बढ़ जाती है. airbrush और स्वचालित स्प्रेयर के साथ नमूने के लिए लागू मैट्रिक्स तुलनीय सांद्रता है.
    3. स्वचालित स्प्रेयर प्रणाली के निर्माताओं द्वारा उपलब्ध कराए गए बंद नीचे दिए गए निर्देशों का पालन करें.
  3. MALDI मैट्रिक्स के उच्च बनाने की क्रिया आवेदन
    1. (सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) बनाने की क्रिया कक्ष के नीचे में 300 मिलीग्राम DHB वजन.
    2. ऊतक वर्गों दो तरफा, प्रवाहकीय टेप के साथ नीचे का सामना करना पड़ के साथ ठंड उंगली (उच्च बनाने की क्रिया कक्ष के शीर्ष भाग) को कांच स्लाइड रहो. यहां तक ​​कि मैट्रिक्स बयान के उत्पादन, भी चालकता के लिए दो तरफा टेप के साथ स्लाइड के पूरे वापस कवर.
    3. एक साथ सी क्लैंप के साथ बनाने की क्रिया कक्ष के ऊपर और नीचे के हिस्सों दबाना. निर्वात और विज्ञापन कनेक्टशीर्ष जलाशय को डी बर्फ और ठंडे पानी.
    4. कमरे के तापमान पर है कि एक हीटिंग विरासत में उच्च बनाने की क्रिया कक्ष रखें.
    5. वैक्यूम पंप पर बारी. 15 मिनट रुको और हीटिंग विरासत पर बारी. ताप मेंटल 10 मिनट के पाठ्यक्रम पर 120 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाना चाहिए.
    6. 10 मिनट के बाद, गर्मी, वैक्यूम के करीब वाल्व (ताकि चैंबर के अंदर वैक्यूम के तहत बनी हुई है) को बंद करने और वैक्यूम पंप बंद कर देते हैं.
    7. वैक्यूम दबाव रिहा वाल्व खोलने और नमूना हटाने, चैम्बर कमरे के तापमान को आने की अनुमति दें. उच्च बनाने की क्रिया चैंबर के आकार गिलास स्लाइड पर sublimed मैट्रिक्स की राशि का निर्धारण करेगा. छोटे कक्षों (150 मिलीलीटर बीकर का आकार) DHB के लगभग 100 मिलीग्राम का उपयोग करेगा और कांच स्लाइड काटने की आवश्यकता होगी, जबकि बड़ा बनाने की क्रिया कक्षों (400 मिलीलीटर बीकर का आकार) DHB के लगभग 300 मिलीग्राम का उपयोग करेगा तो यह चैम्बर में फिट बैठता है.

4. छवि अधिग्रहण

    <ली> मार्क "सिखाने अंक" के रूप में प्रयोग की जाने वाली एक WiteOut सुधार द्रव कलम के साथ नमूना के प्रत्येक कोने पर एक + पैटर्न. MALDI स्लाइड अनुकूलक थाली में कांच स्लाइड प्लेस और एक स्कैनर का उपयोग कर नमूने के एक ऑप्टिकल छवि ले.
  1. 50 माइक्रोन का एक रेखापुंज कदम आकार और के बराबर या रास्टर कदम आकार से छोटा एक लेजर व्यास के साथ साधन कंपनी द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक छवि अधिग्रहण फ़ाइल सेट. इस विशेष साधन को न्यूनतम लेजर सेटिंग एक 40-50 माइक्रोन व्यास लगभग 10 मीटर और छोटे लेजर सेटिंग की एक लेजर व्यास देता है.
  2. सॉफ्टवेयर में ऑप्टिकल छवि लोड और ऑप्टिकल छवि के साथ थाली संरेखित.
  3. आम मैट्रिक्स क्लस्टर आयनों, आंतरिक मानकों, या एक अंशांकन मिश्रण का उपयोग अधिग्रहण शुरू होने से पहले साधन जांचना.
  4. एक "खाली" के रूप में प्रयोग की जाने वाली स्लाइड पर शुद्ध मैट्रिक्स के एक स्थान सहित एमएसआई के साथ विश्लेषण किया जा ऊतक के क्षेत्रों, निर्दिष्ट करें.
  5. एसी शुरू करोquisition.

5. छवि पीढ़ी

  1. विक्रेता द्वारा प्रदान की गई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर में इमेजिंग फ़ाइल खोलें और आयन छवियों को निकालने. अन्य खुला स्रोत सॉफ्टवेयर MSI डाटा प्रोसेसिंग 19 के लिए उपलब्ध है.

6. Metabolite पहचान

  1. विक्रेता विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम से ब्याज की एक विशिष्ट मी / z (सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) का चयन करें. एक analyte चोटी जन स्पेक्ट्रम से चुना जाता है और आयन छवियों विशेष रूप से ऊतक अनुभाग के लिए स्थानीय उत्पन्न कर रहे हैं जब एक analyte एक मैट्रिक्स आयन से प्रतिष्ठित किया जा सकता.
  2. ब्याज की analytes की एक सूची उत्पन्न और एमएस / एमएस प्रयोगों प्रदर्शन. Analytes की नमूना सूचियों के लिए प्रतिनिधि परिणाम में तालिका 1 और 2 टेबल देखें.
  3. सही प्राप्त करने के लिए (यदि उपलब्ध हो या उच्च संकल्प MALDI एमएस) एक उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर पर लक्षित नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण प्रदर्शनजन हित के analytes की माप और भी विशेषता विखंडन पैटर्न प्राप्त करने के लिए लक्ष्य analytes की LC-MS/MS प्रदर्शन करते हैं.
  4. लक्षित analytes के लिए ख्यात पहचान निर्धारित करने के लिए खोज डेटाबेस प्रदर्शन करना. Metabolite डेटाबेस के उदाहरण हैं: metlin, ChemSpider, PubChem, KEGG, और HMDB.
  5. जन सटीक डेटाबेस खोज से ख्यात पहचान की पुष्टि करने के लिए, मानकों, साहित्य, और / या विखंडन भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर के एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा के लिए लक्षित analytes से एमएस / एमएस मैच.

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Representative Results

एमएसआई के एक प्रयोगात्मक अवलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है. प्रयोग के बहुत शुरुआत में, नमूना तैयार करने में एक महत्वपूर्ण कदम है. पिंड संयंत्र रूट से छंटनी और जिलेटिन में एम्बेडेड रहे हैं. यह जमे हुए किया जा रहा है, जबकि ऊतक, कोई बुलबुले के साथ, cryostat कप के खिलाफ फ्लैट दबाया जाना चाहिए, यह sectioned किया जा रहा है, जबकि इस ऊतक के आसान और उचित संरेखण को सुनिश्चित करेगा. ऊतक कटा हुआ जा रहा है, यह उचित मोटाई में ऊतक में कटौती करने के लिए महत्वपूर्ण है, वर्गों की भी मोटी निकाला और ऊतक से पता चला analytes की संख्या कम हो जाएगा, जबकि वर्गों का भी पतली, ऊतक अखंडता को बर्बाद कर, आंसू जाएगा. मैट्रिक्स और आवेदन तकनीक के चयन का पता चला analytes के प्रकार का निर्धारण करेगा. Matrices का एक संयोजन का उपयोग पूरक परिणाम दे सकती है. तीन मैट्रिक्स आवेदन तकनीक इस काम में प्रस्तुत कर रहे हैं. airbrush तकनीक तेजी से, लेकिन छोटे अणुओं की एमएसआई हो के लिए आम तौर पर उपयुक्त नहीं हैanalyte प्रसार के कारण. स्वचालित स्प्रेयर व्यवस्था और उच्च बनाने की क्रिया छोटे मैट्रिक्स क्रिस्टल, बेहतर reproducibility, और कम analyte प्रसार प्रदान करते हैं. 2 एक Medicago truncatula जड़ गुत्थी खंड के एक ऑप्टिकल छवि दिखाता है. 3 स्वत:, airbrush का उपयोग मैट्रिक्स कवरेज और क्रिस्टल आकार के एक ऑप्टिकल छवि उदाहरण से पता चलता है क्रमशः स्प्रेयर, और उच्च बनाने की क्रिया.

DHB तरह पारंपरिक matrices,, कम जन रेंज (मी / z 100-400) 20 में कई आयनों का उत्पादन. ये मैट्रिक्स आयनों इस श्रृंखला में चयापचयों का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. 4 आंकड़ा सिर्फ DHB मैट्रिक्स के एमएस स्पेक्ट्रा DHB मैट्रिक्स के साथ लेपित जड़ गुत्थी ऊतकों की तुलना से पता चलता है. DHB मैट्रिक्स चोटियों नीले रंग में दिखाया गया है DHB के साथ कवर लाल और जड़ गुत्थी ऊतक में संकेत कर रहे हैं. ऐसे TiO 2 नैनोकणों 21, 1,5-diaminonapthalene (दान) 22, 2,3,4,5-Tetrakis (3 ', 4'-उपन्यास matricesdihydroxylphenyl) thiophene (DHPT) 23, और 1,8-बीआईएस (डाइमिथाइल अमीनो) नेफ़थलीन (DMAN) 24,25 कम द्रव्यमान सीमा में मैट्रिक्स आयनों के हस्तक्षेप को कम करने वाली सूचना दी, और भी कुछ वर्गों का पता लगाने में वृद्धि की गई है 5 मेटाबोलाइट्स. मैट्रिक्स चोटियों एमएस छवियों का उपयोग असली मेटाबोलाइट्स से प्रतिष्ठित किया जा सकता. एक चोटी पर क्लिक किया जाता है, आयन छवि निकाले और ऑप्टिकल छवि ओवरलैपिंग प्रदर्शित किया जाता है. ऊतक के लिए अलग स्थानीयकरण साथ छवियों को उत्पन्न, और केवल क्षेत्र imaged मैट्रिक्स में मौजूद नहीं हैं कि उन चोटियों, मेटाबोलाइट्स माना जाता है. चित्रा 5A जड़ गुत्थी ऊतकों में पाया मेटाबोलाइट्स के कई प्रतिनिधि आयन छवियों से पता चलता है, चित्रा 5 ब एमएस छवियों के उदाहरण से पता चलता है, जबकि संबंधित चोटियों मैट्रिक्स के लिए इसी. चित्रा 5A में छवि जड़ गुत्थी ऊतक और उतारी थी कि केवल क्षेत्र मैट्रिक्स में संकेत की कमी के कारण अलग स्थानीयकरण से पता चलता है. चित्रा 5B में एम. से ब्याज की analytes की नमूना सूचीबद्ध truncatula जड़ गुत्थी ऊतक 1 टेबल में सूचीबद्ध (सकारात्मक मोड) और तालिका 2 (नकारात्मक मोड) 4 है.

अलक्षित metabolomics प्रयोगों के अंत तक लक्ष्य पाया गया कि यौगिकों की पहचान है. एक मध्यम संकल्प साधन एक ऐसी TOF / TOF के रूप में (MRMS), पर एमएसआई प्रदर्शन करते हैं, तो यह एक अलग तरह से सटीक जन माप प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इस MALDI-MSI परिणाम ऊतक के अर्क का उपयोग उच्च संकल्प नियंत्रण रेखा एमएस डेटा की तुलना कर रहे हैं, जिसमें एक बहुमुखी एमएस दृष्टिकोण के साथ किया जा सकता है. ब्याज की analytes पर निर्भर करता है से चुनने के लिए कई संभव ऊतक निष्कर्षण प्रोटोकॉल रहे हैं. उच्च संकल्प एमएस (HRMS) सकारात्मक या नकारात्मक आयनीकरण मो में किया जा सकता हैडेस और सामान्य या उलट चरण नियंत्रण रेखा ब्याज की analytes पर निर्भर करता है के साथ. एक सटीक जन उच्च संकल्प नियंत्रण रेखा एमएस के साथ प्राप्त हो जाने के बाद, जिसके परिणामस्वरूप बड़े पैमाने पर एक ख्यात पहचान प्राप्त करने के लिए, पहले से सूचीबद्ध कई डेटाबेस, साथ खोजा जा सकता है. अगला एमएस / एमएस डेटा इकट्ठा किया जाता है और ब्याज की analyte की विशेषता विखंडन पैटर्न मानकों, साहित्य स्पेक्ट्रा, या सैद्धांतिक विखंडन पैटर्न की तुलना की जा सकती है. चित्रा 6 MSI और नियंत्रण रेखा एमएस के साथ पकड़ा मेटाबोलाइट्स में से एक का एक उदाहरण दिखाता है. इस metabolite उच्च संकल्प नियंत्रण रेखा एमएस के साथ एकत्र एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम पर आधारित हीम के रूप में पहचान की थी. यह एमएस / एमएस डेटा पहले से Shimma और Setou 26 द्वारा प्रकाशित एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा की तुलना में था. दो एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा मैच, इसलिए मी / z 616.2 की पहचान आत्मविश्वास से साहित्य एमएस / एमएस डेटा की तुलना में सटीक जन डेटाबेस खोज और एमएस / एमएस डेटा पर आधारित हीम के रूप में सौंपा गया था.


चित्रा 1. एमएसआई कार्यप्रवाह. जड़ पिंड का अवलोकन cryostat के साथ sectioned जिलेटिन में एम्बेडेड संयंत्र, से छंटनी और एक आईटीओ लेपित गिलास स्लाइड पर बढ़ रहे हैं. मैट्रिक्स तीन मैट्रिक्स आवेदन तकनीकों में से एक का उपयोग कर स्लाइड पर लागू होता है. एमएसआई अधिग्रहण एक MALDI-TOF/TOF मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ किया जाता है और एमएस स्पेक्ट्रा MSI सॉफ्टवेयर के साथ छवियों में संकलित हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. ऊतक का नमूना ऑप्टिकल छवि. एक Medicago truncatula जड़ गुत्थी ऊतक अनुभाग के प्रतिनिधि ऑप्टिकल छवि.

चित्रा 3
चित्रा 3. उदाहरण मैट्रिक्स बयानों. एक) airbrush, ख) स्वचालित स्प्रेयर, और ग) बनाने की क्रिया तकनीक के साथ मैट्रिक्स बयान से अलग consistencies दिखा प्रतिनिधि छवियाँ. स्वचालित स्प्रेयर विधि छोटे बराबर आकार वाले क्रिस्टल का उत्पादन करते हुए airbrush आवेदन विधि बड़े और छोटे क्रिस्टल उत्पन्न करता है. उच्च बनाने की क्रिया एक मैट्रिक्स का भी परत पैदा करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. पीएलए के एमएस स्पेक्ट्रमDHB के साथ कवर जड़ गुत्थी ऊतक बनाम DHB मैट्रिक्स में. DHB मैट्रिक्स चोटियों लाल रंग में संकेत कर रहे हैं और DHB के साथ कवर जड़ गुत्थी ऊतक नीले रंग में दिखाया गया है. मैट्रिक्स चोटियों एमएस छवियों का उपयोग असली मेटाबोलाइट्स से प्रतिष्ठित किया जा सकता. एक चोटी पर क्लिक किया जाता है, आयन छवि निकाले और ऑप्टिकल छवि ओवरलैपिंग प्रदर्शित किया जाता है. ऊतक के लिए अलग स्थानीयकरण साथ छवियों को उत्पन्न, और उन है कि चोटियों, केवल क्षेत्र imaged मैट्रिक्स में मौजूद नहीं हैं मेटाबोलाइट्स माना जाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. एम. के एमएस छवियों truncatula जड़ पिंड. एक) मेटाबोलाइट्स एफ के प्रतिनिधि आयन छवियोंound जंगली प्रकार एम. में truncatula जड़ पिंड. ख) मेटाबोलाइट्स विचार नहीं किया जाएगा कि मैट्रिक्स प्रजातियों के प्रतिनिधि आयन छवियों. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा 6. Metabolite पहचान के लिए उदाहरण एमएस / एमएस डेटा. हीम [एम +] के रूप में पहचान एम / Z 616.2, एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम. रासायनिक संरचना से पता चला है और विखंडन संरचनाओं सौंपा है. प्रयोगात्मक एमएस / एमएस डेटा Shimma और Setou 26 से साहित्य में सूचना दी हीम के एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम की तुलना में है.

तालिका 1. ब्याज की analytes -. गुदा के सकारात्मक मोड नमूना सूचीएम. से ब्याज की ytes सकारात्मक आयन मोड 4 में truncatula जड़ गुत्थी ऊतक.

H: 79px; "> 133.0608 73px; "> हिस्टडीन एकidth: 64px; "> 0.04
Metabolite के नाम सैद्धांतिक [एम + एच] + [एम + एच] + मापा MRMS [एम + एच] + मापा HRMS Δm (एमडीए)
γ-aminobutyric एसिड एक 104.0706 104.1 104.0706 0
कोलीन एक, * 104.1070 > 104.1 104.1071 0.01
प्रोलाइन 116.0706 116.07 116.0706 0
valine 118.0863 118.09 118.0865 0.02
leucine एक 132.1019 132.1 132.1022 0.03
asparagine एक 133.06 133.0602 -0.06
adenine एक 136.0618 136.07 एनए एनए
proling betaine एक 144.1019 144.1 144.1024 0.05
glutamine एक 147.0764 147.09 147.0768 0.04
156.0768 156.06 156.0771 0.03
एक arginine 175.1190 175.13 175.1167 -0.23
सुक्रोज + K 381.0794 381.05 381.0791 -0.03
हीम एक, * 616.1768 616.15 एनए एनए
एचटी = "25" शैली = "ऊंचाई: 26px; चौड़ाई: 173px;"> NAD एक 664.1164 664.1 एनए एनए
formononetin एक 269.0808 269.08 269.0803 0.05
chrysoseriol GlcA एक 477.1028 477.1 477.1008 0.2
formononetin MalGlc एक 517.1341 517.13 517.1337
aformosin MalGlc एक 547.1446 547.16 547.1427 0.19

* [एम +]
एक एमएस / एमएस पहचान के लिए प्रदर्शन किया.

तालिका 2. ब्याज की analytes -. एम. से ब्याज की analytes की नकारात्मक मोड नमूना सूची नकारात्मक आयन मोड 4 में truncatula जड़ गुत्थी ऊतक.

हिंदुस्तान टाइम्स: 26px; "> γ-aminobutyric एसिड एक </ Tr>
Metabolite के नाम सैद्धांतिक [महाराष्ट्र] - मापा MRMS [महाराष्ट्र] - < / Sup> HRMS [महाराष्ट्र] मापा - Δm (एमडीए)
पाइरुविक एसिड 87.0077 87 एनए एनए
alanine एक 88.0393 88.01 88.0374 -0.19
लैक्टिक एसिड एक 89.0233 89.01 89.0296 0.63
फास्फोरिक अम्ल 96.9685 96.96 96.9625 -0.6
2 ketobutyric एसिड 101.0233 101.02 101.0191 -0.42
102.055 102.04 102.0528 -0.22
सेरीन 104.0342 104.02 104.0228 -1.14
Maleic / Fumaric एसिड एक 115.0026 115.03 115 -0.26
succinic एसिड एक 117.0182 117.01 117.0125 -0.57
threonine 118.0499 118.04 118.0456 -0.43
oxalacetic एसिड 130.9975 131.03 130.991 -0.65
एसपारटिक एसिड एक 132.0291 132.03 132.0256 -0.35
मैलिक एसिड एक 133.0132 133.02 133.0221 0.89
salicyclic एसिड 137.0233 137.02 137.0349 1.16
α-ketoglutaric एसिड 145.0132 145.02 145.0063 -0.69
glutamic एसिड एक 146.0448 146.01 146.0408 -0.4
pentose 149.0445 149.04 149.0414 -0.31
ऐकोनिटिक एसिड एक 173.0081 173.03 173.0057 -0.24
एस्कॉर्बिक एसिड एक 175.0237 175.05 175.0341 1.04
hexose 179.055 179.05 179.0484 -0.66
साइट्रिक / isocitric एसिड एक 191.0186 191.02 191.0166 -0.2
palmitic एसिड 255.2319 255.22 255.2246 -0.73
hexose 6 फॉस्फेट एक 259.0213 259.04 259.014 -0.73
साबुन तता ग्लिसरीन वर्तिका के बनाने के काम आने वाला अम्ल 283.2632 283.26 283.2552 -0.8
सुक्रोज एक 341.1078 341.07 341.0972 -1.06

एक एमएस / एमएस पहचान के लिए प्रदर्शन किया.

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Discussion

ऊपर चर्चा की, नमूना तैयार करने MSI कार्यप्रवाह में सबसे महत्वपूर्ण कदम है. असमान रूप से ऊतक एम्बेड कुछ मामलों में संभव मुश्किल या नहीं होने की सेक्शनिंग कारण होगा. खंड आकार और पर्याप्त संतुलन समय ऊतक अखंडता को बनाए रखने और तह और आँसू से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं. मैट्रिक्स और आवेदन तकनीक का चयन पता लगाया जा analytes के प्रकार का निर्धारण करने में एक भूमिका, स्थानिक संकल्प, और परिणाम के reproducibility खेलेंगे. Matrices या आवेदन तकनीक के संयोजन का उपयोग पूरक परिणाम दे सकती है.

इस विधि एम. में अंतर्जात मेटाबोलाइट्स के अलक्षित MSI के लिए विशेष रूप से डिजाइन किया गया था truncatula जड़ गुत्थी ऊतक, लेकिन आसानी से अन्य प्रकार के ऊतक और जैविक सवालों को रूपांतरित किया जा सकता है. छोटे अणु MSI के लिए सिफारिश की मैट्रिक्स आवेदन तरीकों बनाने की क्रिया और स्वचालित स्प्रेयर हैं. Tissu पर जमा विलायक की राशि बढ़ाने सेई, स्वचालित स्प्रेयर विधि का समायोजन करके, analytes की निकासी में वृद्धि होगी और एक आदि लिपिड, पेप्टाइड्स के एमएसआई प्रदर्शन करने के लिए चुनना चाहिए उच्च जन यौगिकों का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं. ऊतक के अन्य प्रकार का उपयोग करते समय, मुख्य समायोजन अनुभाग मोटाई किया जाएगा. आदर्श रूप में ऊतक एक सेल की मोटाई के लिए कटा हुआ होना चाहिए; संयंत्र ऊतक और पशु ऊतक के लिए उपयुक्त पतली वर्गों के लिए इसलिए मोटा वर्गों शायद उपयुक्त. तह या फाड़ होती है, तो आम तौर पर एक लंबे समय तक संतुलन समय सेक्शनिंग पहले की जरूरत है या एक मोटा अनुभाग आकार के लिए आवश्यक हो सकता है. सटीक जनता, ऊतक निष्कर्षण प्रोटोकॉल, मोबाइल चरण विलायकों और ढाल, स्तंभ स्थिर चरण, और एमएस आयनीकरण मोड प्राप्त करने के लिए नियंत्रण रेखा एमएस जब प्रदर्शन कर सभी को समायोजित करने और ब्याज की analytes के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

MALDI-एमएसआई के मुख्य लाभ यह है कि अपने बड़े पैमाने पर जानकारी न केवल प्रदान करने की क्षमता है, लेकिन यह भी किसी नमूने के लिए स्थानिक जानकारी हैलक्ष्य analytes की पूर्व ज्ञान की आवश्यकता के बिना. अन्य इमेजिंग तकनीक derivatizations या 5 टैग के उपयोग की आवश्यकता. पहले चर्चा की, इस तकनीक की एक सीमा मैट्रिक्स आयन चोटियों हस्तक्षेप की बहुतायत है. उपन्यास matrices इस सीमा को पता करने के लिए सूचित किया गया है. वैकल्पिक रूप से, माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एस)-MSI एक मैट्रिक्स मुक्त इमेजिंग विकल्प है, लेकिन, यह MALDI-MSI 3 से कम संवेदनशीलता है. इस तकनीक का एक और सीमा MALDI-TOF/TOF उपकरणों के निचले सामूहिक संकल्प है. क्योंकि कम द्रव्यमान हल शक्ति से, यह भी अधिक प्रयोगों और अधिक समय का मतलब है जो metabolite पहचान, के लिए सटीक जनता को प्राप्त करने के लिए उच्च संकल्प एमएस प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है. यह समस्या ऐसे MALDI-Orbitrap के रूप में एक उच्च संकल्प साधन मंच पर MALDI-MSI प्रदर्शन करके हल किया जा सकता है. एमएसआई प्रयोगों प्रदर्शन के अंतिम सीमा MSI डेटा के विश्लेषण के लिए उपलब्ध सॉफ्टवेयर उपकरणों की कमी, एएलटी हैHough MSI सॉफ्टवेयर में कुछ हाल ही में अग्रिम 27,28 बनाया गया है. आमतौर पर प्रत्येक इमेजिंग क्षेत्र के लिए एमएस स्पेक्ट्रम मैन्युअल रूप से विश्लेषण किया जाना चाहिए और आयन छवियों हाथ से निकाली गई. एमएसआई प्रयोगों डेटा की एक बहुतायत उत्पादन और अविश्वसनीय रूप से समय का विश्लेषण करने के लिए लगता हो सकता है. कुल मिलाकर, MALDI-MSI कई जैविक अनुप्रयोगों के साथ छोटे अणुओं और अन्य यौगिकों की अलक्षित विश्लेषण के लिए अत्यंत उपयोगी हो सकता है कि एक ही प्रयोग के भीतर एक साथ कई यौगिकों के स्थानिक जानकारी प्राप्त करने के लिए अद्वितीय लाभ प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों Medicago truncatula नमूने उपलब्ध कराने के लिए UW-Madison में कृषि विज्ञान विभाग में डॉ. ज्यां मिशेल ane स्वीकार करना चाहते हैं. यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) से धन के द्वारा समर्थित किया गया था अनुदान चे 0957784, विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय के ग्रेजुएट स्कूल और विस्कॉन्सिन पूर्व छात्रों रिसर्च फाउंडेशन (WARF) और ROMNES फैकल्टी रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम (करूँगा के लिए). ईजी एक NSF ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप (डीजीई-1256259) मानता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Difco 214340 heat to dissolve
Cryostat- HM 550 Thermo Scientific 956564A
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides  Delta Technologies CB-90IN-S107 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix  ICN Biomedicals PI90033
Airbrush Paasche Airbrush Company TG-100D coupled with 75 ml steel container
Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer HTX Technologies, LLC HTX.TMSP.H021-U Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed
Sublimation apparatus  Chemglass Life Science CG-3038-01
Vaccum pump- Alcatel 2008 A Ideal Vacuum Products P10976 Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF Bruker Daltonics 276601
FlexImaging Bruker Daltonics 269841 One example of "vender specific software"
MALDI LTQ Orbitrap Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMASZ High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements
Q Exactive Thermo Scientific IQLAAEGAAPFALGMAZR High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements

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References

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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 85 बड़े पैमाने पर spectrometric इमेजिंग इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री MALDI TOF / TOF, Metabolite छोटे अणु उच्च बनाने की क्रिया स्वचालित स्प्रेयर
में मेटाबोलाइट्स के जांच के लिए MALDI-बड़े पैमाने पर spectrometric इमेजिंग<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; जड़ पिंड
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Gemperline, E., Li, L. MALDI-Mass… More

Gemperline, E., Li, L. MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules. J. Vis. Exp. (85), e51434, doi:10.3791/51434 (2014).

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