Summary
Massespektrometrisk imaging (MSI) er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at opdage og identificere forskellige kemiske stoffer i intakte væv, bevare de forbindelser i deres oprindelige miljøer, som kan give ny indsigt i biologiske processer. Heri beskrives en MSI metode udviklet til analyse af små molekyler er beskrevet.
Abstract
De fleste teknikker, der anvendes til at studere små molekyler, såsom lægemidler eller endogene metabolitter, beskæftiger vævsekstrakter som kræver homogenisering af vævet af interesse, der potentielt kan forårsage ændringer i de metaboliske veje blive undersøgt 1. Massespektrometrisk imaging (MSI) er et kraftfuldt analytisk redskab, der kan give geografisk information af analytter i intakte skiver af biologiske vævsprøver 1-5. Denne teknik er blevet brugt i udstrakt grad til at studere forskellige typer af forbindelser, herunder proteiner, peptider, lipider, og små molekyler, såsom endogene metabolitter. Med matrix-assisteret laser desorption / ionisering (MALDI)-MSI, kan rumlige fordelinger af flere metabolitter samtidigt opdaget. Heri er en metode udviklet specielt til at gennemføre målrettede metabolomics MSI eksperimenter på bælgplanter rødder og rodknolde præsenteret som kan afsløre indsigt i de biologiske processer, der finder sted. Denmetode præsenteres her viser en typisk MSI workflow, fra prøveforberedelse til billede erhvervelse, og fokuserer på matricen ansøgning trin, viser flere matrix ansøgning, som er nyttige til påvisning af små molekyler. Når MS billederne er genereret, er analyse og identifikation af metabolitter af interesse diskuteret og demonstreret. Standardarbejdsgangen præsenteret her, kan let modificeres til forskellige vævstyper, molekylære arter og instrumentering.
Introduction
Den voksende inden for metabolomics har mange vigtige biologiske applikationer, herunder biomarkører, decifrere metaboliske veje i planter og andre biologiske systemer, og toksikologi profilering 4,6-10. En stor teknisk udfordring, når man studerer biologiske systemer er at studere Metabolomic veje uden at forstyrre dem 11. MALDI-MSI tillader direkte analyse af intakte væv, der muliggør sensitiv påvisning af analytter i enkelte organer 12,13 og endda enkelte celler 14,15.
Prøveforberedelse er et afgørende skridt i at producere reproducerbare og pålidelige massespektrale billeder. Kvaliteten af billederne i høj grad afhænger af faktorer såsom væv indstøbningsmedium, skivetykkelse, MALDI matrix og matrix ansøgning teknik. Til programmer til billedbehandling, ideel godstykkelse er bredden af en celle (8-20 um afhængig af prøvetype). MALDI kræver aflejring af en organisk, crystalline matrix sammensatte, typisk en svag syre, på prøven for at hjælpe analysanden ablation og ionisering. 16 forskellige matricer giver forskellige signalintensiteter, interfererende ioner og ionisering effektivitetsgevinster af forskellige klasser af forbindelser.
Matrixen påføringsteknikken spiller også en rolle i kvaliteten af massespektrale billeder og forskellige teknikker er egnede til forskellige klasser af analytter. Tre matrix påføringsmetoder præsenteres i denne protokol: airbrush, automatisk sprøjte, og sublimering. Airbrush matrix ansøgning er blevet meget udbredt i MALDI billeddannelse. Fordelen airbrush matrix anvendelse er, at det er relativt hurtigt og nemt. Men kvaliteten af airbrush matrix ansøgning i høj grad afhænger af dygtighed af brugeren og har tendens til at være mindre reproducerbar og forårsage diffusion af analytter, især små molekyler 17. Automatiske sprøjtende systemer har lignende mekanik til airbrush matrix ansøgning, men HAVe blevet udviklet til at fjerne variation ses med manuel airbrush ansøgning, hvilket gør spray mere reproducerbare. Denne metode kan nogle gange være mere tidskrævende end traditionel airbrush matrix ansøgning. Både manuel airbrush og automatiske sprøjtende systemer er solvent baserede matrix anvendelsesmetoder. Sublimation er en tør matrix ansøgning teknik, der bliver mere og mere populært for massespektrumdata billeddannelse af metabolitter og små molekyler, fordi det mindsker analyt diffusion, men mangler det opløsningsmidlet nødvendigt at ekstrahere og observere højere masse forbindelser 18.
Trygge identifikation af metabolitter kræver typisk nøjagtige massemålinger at opnå formodede identifikationer efterfulgt af tandem masse (MS / MS) eksperimenter til validering, med MS / MS spektre blive sammenlignet med standarder, litteratur eller teoretiske spektre. I denne protokol høj opløsning (masse opløsningsevne på 60.000 ved m / z 400), væskekromatografi (LC)-MS er koblet til MALDI-MSI at opnå både geografisk information og tillidsfulde identifikationer af endogene metabolitter, ved hjælp af Medicago truncatula rødder og rodknolde, som det biologiske system. MS / MS eksperimenter kan udføres direkte på væv med MALDI-MSI eller på vævsekstrakter med LC-MS og anvendes til validering af metabolit identifikationer.
Denne protokol giver en enkel metode til at kortlægge endogene metabolitter i M. truncatula, som kan tilpasses og anvendes til MSI af små molekyler i forskellige vævstyper og biologiske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Instrumentering
- MALDI-TOF/TOF MSI. Brug et massespektrometer udstyret med et MALDI kilde til analyse af små molekyler (se tabel of Materials / udstyr). Udfør opkøb i positiv eller negativ ion-mode afhængigt af analysand. Angiv en masse afstanden af interesse og indsamle 500 laser shots / plet på 50 um intervaller i både x-og y-dimensioner hen over overfladen af prøven for at generere ion billeder. Raster bredde og antal laserskud kan justeres for at opnå højere rumlig opløsning og maksimal signalintensitet hhv. Brug DHB matrix toppe eller interne standarder, der anvendes til diaset eller direkte til det væv at kalibrere massespektre.
- High Resolution LC-MS. (Se tabel of Materials / udstyr) Kør prøveekstrakter med LC-MS ved hjælp af enten omvendt fase (RP) LC med en C-18 kolonne eller normal fase (NP) med en HILIC kolonne afhængigt af analysand. Bruge mobile faser ogsom relevante for den specifikke prøvetype gradienter. Udfør opkøb i positive eller negative ion tilstande afhængig af prøvetype.
2. Vævspræparat
- Trim roden knude fra anlægget, efterlader 3-4 mm rod knyttet til knuden.
- Umiddelbart efter dissektion pincet til at placere vævet i en kryostat kop og dække med gelatine (100 mg / ml i deioniseret vand). Det er afgørende for det væv, der skal fast til bunden af koppen uden luftbobler.
- Flash fryse vævet ved at placere koppen i et tøris / ethanol-bad, indtil gelatinen størkner og bliver uigennemsigtig. Opbevar prøver ved -80 ° C indtil brug.
- Tag prøver fra -80 ° C fryser, skære væk plastik cryostat kop og trimme væk overskydende gelatine. Monter den integrerede væv til kryostat borepatron med en skilling mellemstore mængden af optimal skæring temperatur (OLT) medier, mens ikke at lade OLT berøre vævet. Placer i kryostatkassen, indtil OLT størkner.
- Lad værktøjsholderen, og gelatine i ligevægt i kryostat boks (sæt til -20 eller -25 ° C) i ca 15 min.
- Brug kryostaterne (se tabel of Materials / udstyr) til sektion væv omkring tykkelsen af en celle (8-20 um afhængig af vævstype) og tø montere hver skive på ITO-coatede glas ved opvarmning af ryggen (ikke-ITO belagt side) af en ITO-coatede objektglas på bagsiden af din hånd. Placer ITO-coatede side af varmede dias nær det frosne væv skive og tillade skive til at holde fast på diaset. Placering af sektionerne tæt sammen på slide vil give bedre justering under MSI.
3. Matrix Ansøgning
- Airbrush Anvendelse af MALDI Matrix
- Alle airbrush bør udføres i et stinkskab.
- Rengør airbrush løsning beholder og dyse (se tabel of Materials / udstyr) med methanol ogfylde opløsningen beholder med DHB matrix-opløsning (150 mg / ml i 50% methanol/0.1% TFA volumen / volumen).
- Hold airbrush cirka 35 cm fra prøven, og anvendelse 10-15 lag matrix på overfladen af objektglasset med en varighed på 10 sek spray og 30 sek tørretid mellem hvert lag.
- Rengør airbrush igen med methanol når du er færdig for at undgå tilstopning af matrix-løsning.
- Automatisk Sprayer Anvendelse af MALDI Matrix
- Følg start-up instruktionerne fra producenterne af den automatiske sprøjte system.
- MSI metabolitter i rodknolde ved hjælp af 40 mg / ml (i 50% methanol/0.1% TFA volumen / volumen) DHB som matrix, indstille temperaturen til ~ 80 ° C, hastighed på 1.250 mm / min, flow 50 ul / min, og antallet af passager til 24. For bedste dækning, anbefales det at dreje dysen 90 ° og / eller udligne dysen 1,5 mm mellem hvert forløb. Start sprøjten metode.
Som en side note, navnlig sprøjtesystemet anvendt her opvarmer dyse til hurtigere afdampning af opløsningsmidlet. Som opløsningsmiddel fordamper, koncentrationen af matrixen øges hurtigt. Matrixen påføres prøven med airbrush og den automatiske sprøjte har sammenlignelige koncentrationer. - Følg de shut-down instruktionerne fra producenterne af den automatiske sprøjte system.
- Sublimation Anvendelse af MALDI Matrix
- Der afvejes 300 mg DHB i bunden af sublimering kammer (se tabel Materialer / udstyr).
- Stick objektglasset til den kolde finger (øverste del af sublimering kammer) med vævssnit nedad med dobbeltsidet, ledende tape. Dæk hele bagsiden af dias med dobbeltklæbende tape for selv ledningsevne, der producerer selv matrix deposition.
- Klem de øverste og nederste halvdele af sublimering kammer sammen med C-klemme. Tilslut vakuum og add is og koldt vand til den øverste reservoir.
- Placer sublimering kammer i en varmekappe, som er ved stuetemperatur.
- Tænd vakuumpumpen. Vent 15 minutter, og tænd for varmekappe. Varmekappen skulle nå 120 ° C i løbet af 10 min.
- Efter 10 minutter, slukke for varmen tæt ventil for vakuum (så indersiden af kammeret forbliver under vakuum) og sluk for vakuumpumpen.
- Lad kammeret til at komme til stuetemperatur, åbne ventilen frigiver vakuumtrykket og fjern prøven. Størrelsen af sublimering kammeret vil bestemme mængden af matrix sublimeret til objektglas. De større sublimering kamre (på størrelse med et 400 ml bægerglas) vil bruge omkring 300 mg DHB mens de mindre kamre (på størrelse med et 150 ml bægerglas), vil bruge omkring 100 mg DHB og vil kræve at skære objektglasset, så det passer ind i kammeret.
4.. Image Acquisition
- <li> Mark a + mønster på hvert hjørne af prøven med en WiteOut rettelak pen til at blive brugt som "underviser punkter". Anbring objektglasset i MALDI slide adapter plade og tage en optisk billede af prøven ved hjælp af en scanner.
- Opsæt et billede erhvervelse fil ved hjælp af software, som instrumentet selskab med en raster trin på 50 m og en laser diameter er lig med eller mindre end den raster skridt størrelse. På dette særlige instrument, den mindste laser indstilling giver en laser diameter på omkring 10 um og lille laser indstilling har en 40-50 um diameter.
- Læg det optiske billede i softwaren og tilpasse pladen med optisk billedstabilisering.
- Apparatet kalibreres, før du begynder købet ved hjælp af fælles matrix klynge ioner, interne standarder, eller en kalibrering mix.
- Angiv de områder af væv, der skal analyseres med MSI, herunder en plet af ren matrix på diaset for at blive brugt som en "blank".
- Begynd acovertagelsen.
5.. Billede Generation
- Åbn imaging fil i kommercielt tilgængelige software leveret af sælger og udtrække ion billeder. Andre open source software er tilgængelig til databehandling MSI 19.
6.. Metabolite Identifikation
- Vælg et bestemt m / z af interesse fra massespektret hjælp sælgeren specifik software (se tabel of Materials / udstyr). En analyt kan skelnes fra en matrix-ion, når en analyt peak er udvalgt fra massespektret og ion billeder genereres specifikt lokaliseret til vævssnittet.
- Generer en liste over analytter af interesse og udføre MS / MS eksperimenter. Se tabel 1 og tabel 2 i Repræsentative Resultater for lister prøve af analytter.
- Udføre målrettet LC-MS analyse på en høj opløsning massespektrometer (eller høj opløsning MALDI-MS hvis tilgængelig) for at få nøjagtigmasse målinger af analytter af interesse og også udføre LC-MS/MS af målanalytterne at opnå karakteristiske fragmenteringsmønstre.
- Udfør database søger at bestemme formodede identifikationer for de målrettede analytter. Eksempler på metabolit databaser omfatter: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG og HMDB.
- For at bekræfte de formodede identifikationer fra nøjagtig masse database søgning, matcher MS / MS fra de målrettede analytter til MS / MS spektre af standarder, litteratur og / eller fragmentering forudsigelse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En eksperimentel oversigt over MSI er vist i figur 1. Ved selve begyndelsen af eksperimentet prøveforberedelse er et kritisk trin. Knuder er trimmet fra planten rod og indlejret i gelatine. Vævet skal trykkes fladt mod kryostat kop, med ingen bobler, mens det bliver frosset, hvilket vil sikre en lettere og korrekt tilpasning af vævet, mens den bliver sektioneret. Når væv bliver skåret, er det vigtigt at skære vævet ved korrekt tykkelse for tynd sektioner vil rive, ødelægger vævet integritet, mens for tyk sektioner vil reducere antallet af analytter ekstraheret og påvist fra vævet. Udvælgelse af matrix og anvendelse teknik vil bestemme de typer af analytter påvises. Ved hjælp af en kombination af matricer kunne give komplementære resultater. Tre matrix påføringsteknikker præsenteres i dette arbejde. Airbrush teknik er hurtig, men typisk ikke egnet til MSI af små molekyler væreårsag analyt diffusion. Automatiske sprøjtende systemer og sublimering giver mindre matrix krystaller, bedre reproducerbarhed, og mindre analyt diffusion. Figur 2 viser et optisk billede af en Medicago truncatula rod knude sektion. Figur 3 viser et optisk billede eksempel på matrix-dækning og krystal størrelser ved hjælp airbrush, automatisk sprøjte, og sublimering hhv.
Konventionelle matricer, som DHB producerer mange ioner i den nedre masseinterval (m / z 100-400) 20. Disse matrix ioner kan interferere med påvisningen af metabolitter i dette interval. Figur 4 viser MS spektre af bare DHB matrix i forhold til roden knude væv belagt med DHB matrix. DHB matrix toppe er angivet i rødt og rod knude væv dækket med DHB er vist i blåt. Hidtil ukendte matricer, såsom TiO 2 nanopartikler 21, 1,5-diaminonapthalene (DAN) 22 2,3,4,5-tetrakis (3 ', 4'-dihydroxylphenyl) thiophen (DHPT) 23, og 1,8-bis (dimethyl-amino) naphthalen (DMAN) 24,25 er blevet rapporteret at reducere interferens af matrix-ioner i den lave masseinterval, og også forbedre påvisning af visse klasser metabolitter 5.. Matrix toppe kan skelnes fra virkelige metabolitter ved hjælp af MS-billeder. Når et højdepunkt er klikket på, er ion billede udvindes og vises overlappende optisk billede. De toppe, der genererer billeder med tydelig lokalisering til vævet, og ikke er til stede i matrixen eneste område afbildes, betragtes metabolitter. 5a viser flere repræsentative ion billeder af metabolitter findes i root nodule væv, medens figur 5b viser eksempler på MS billeder svarende til matrix forbundne toppe. I figur 5a billedet viser tydelig lokalisering til roden knuden væv og manglende signal i matrixen eneste område, der blev afbildet. I figur 5b M. truncatula rod knude væv er anført i tabel 1 (positiv mode) og tabel 2 (negativ tilstand) 4..
Det endelige mål for irrelevante metabolomics eksperimenter er at identificere de forbindelser, der blev opdaget. Når der udføres MSI på et medium opløsning instrument (MRMS), såsom en TOF / TOF, er det nødvendigt at opnå nøjagtige massemålinger på en anden måde. Dette kan gøres med en mangesidet MS tilgang, hvor MALDI-MSI resultater sammenlignes med høj opløsning LC-MS-data anvender vævsekstrakter. Der er mange mulige væv ekstraktionsprotokoller at vælge imellem afhængigt af analysand. Høj opløsning MS (HRMS) kan udføres i positiv eller negativ ionisering modes og med normal eller omvendt fase LC afhængigt af analysand. Når en nøjagtig masse opnås med høj opløsning LC-MS, kan den resulterende masse søges med flere databaser, som tidligere anført, for at opnå en formodet identifikation. Næste MS / MS data indsamles og den karakteristiske fragmentering mønster af analytten af interesse kan sammenlignes med standarder, litteratur spektre eller teoretiske fragmenteringsmønstre. Figur 6 viser et eksempel på en af metabolitterne opdages med MSI og LC-MS. Denne metabolit blev identificeret som hæm baseret på MS / MS spektrum indsamlet med høj opløsning LC-MS. Dette MS / MS-data blev sammenlignet med MS / MS spektre tidligere udgivet af Shimma og Setou 26. De to MS / MS spektre match, derfor identiteten af m / z 616,2 blev trygt tildelt som hæm baseret på den nøjagtige masse databasesøgning og MS / MS-data i forhold til litteratur MS / MS-data.
Figur 1. Oversigt over MSI arbejdsgang. Rodknolde trimmes fra anlægget, indlejret i gelatine, snittet med kryostaten og monteret på en ITO-overtrukket objektglas. Matrix påføres slæden ved hjælp af en af tre matrix påføringsteknikker. MSI købet er foretaget med et MALDI-TOF/TOF massespektrometer og MS spektre er kompileret ind i billeder med MSI-software.
Figur 2. Vævsprøve optisk billede. Repræsentant optisk billede af en Medicago truncatula rod knude vævssnit.
Figur 3. Eksempel matrix depositioner. Repræsentative billeder, der viser de forskellige konsistenser af matrix deposition med a) airbrush, b) automatisk sprøjte, og c) sublimering teknikker. Airbrush ansøgning metode genererer store og små krystaller, mens den automatiske sprøjte-metoden producerer små lige store krystaller. Sublimation producerer en jævnt lag af matrix. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. MS-spektrum af PLAi DHB matrix vs rod knude væv dækket med DHB. er DHB matrix toppe angivet med rødt og rod knude væv dækket med DHB er vist i blåt. Matrix toppe kan skelnes fra virkelige metabolitter ved hjælp af MS-billeder. Når et højdepunkt er klikket på, er ion billede udvindes og vises overlappende optisk billede. Disse toppe, der genererer billeder med tydelig lokalisering til vævet, og ikke er til stede i matricen eneste område afbildes, betragtes metabolitter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. MS billeder af M. truncatula rodknolde. a) Repræsentative ion billeder af metabolitter found i vildtype M. truncatula rodknolde. b) Repræsentative ion billeder af matrix arter, som ikke vil blive anset metabolitter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Eksempel MS / MS-data for metabolit identifikation. MS / MS spektrum af m / z 616,2, identificeret som hæm [M +]. Den kemiske struktur er vist og fragmentering strukturer er tildelt. Den eksperimentelle MS / MS-data sammenlignes med MS / MS spektrum af hæm rapporteret i litteraturen ved Shimma og Setou 26.
Tabel 1. Analysandernes -. Positiv tilstand Sample liste over analytes af interesse fra M. truncatula rod knude væv i positiv ion mode 4.
| Navn på metabolit | Teoretisk [M + H] + | MRMS Målte [M + H] + | HRMS Målte [M + H] + | Δm (MDA) |
| γ-aminosmørsyre en | 104.0706 | 104.1 | 104.0706 | 0 |
| cholin a, * | 104.1070 > | 104.1 | 104.1071 | 0.01 |
| prolin | 116.0706 | 116,07 | 116.0706 | 0 |
| valin | 118.0863 | 118,09 | 118.0865 | 0.02 |
| leucin a | 132.1019 | 132,1 | 132.1022 | 0.03 |
| asparagin en | h: 79px; "> 133,0608133,06 | 133.0602 | -0.06 | |
| adenin a | 136.0618 | 136,07 | NA | NA |
| proling betain en | 144.1019 | 144,1 | 144.1024 | 0.05 |
| glutamin a | 147.0764 | 147,09 | 147.0768 | 0,04 |
| 156.0768 | 156,06 | 156.0771 | 0.03 | |
| arginin en | 175.1190 | 175,13 | 175.1167 | -0.23 |
| saccharose + K | 381.0794 | 381,05 | 381.0791 | -0.03 |
| hæm a, * | 616.1768 | 616,15 | NA | NA |
| ht = "25" style = "height: 26px; bredde: 173px;"> NAD a | 664.1164 | 664,1 | NA | NA |
| formononetin en | 269.0808 | 269,08 | 269.0803 | 0.05 |
| chrysoseriol GlcA en | 477.1028 | 477,1 | 477.1008 | 0.2 |
| formononetin MalGlc a | 517.1341 | 517,13 | 517.1337 | idth: 64px; "> 0,04|
| aformosin MalGlc en | 547.1446 | 547,16 | 547.1427 | 0,19 |
* [M +]
en MS / MS udført for identifikation.
Tabel 2. Analysandernes -. Negativ tilstand Sample liste af analytter af interesse fra M. truncatula rod knude væv i negativ ion mode 4.
| Navn på metabolit | Teoretisk [MH] - | MRMS Målte [MH] - < / Sup> | HRMS Målt [MH] - | Δm (MDA) |
| pyrodruesyre | 87,0077 | 87 | NA | NA |
| alanin a | 88,0393 | 88.01 | 88,0374 | -0.19 |
| mælkesyre en | 89,0233 | 89.01 | 89,0296 | 0,63 |
| phosphorsyre | 96,9685 | 96,96 | 96,9625 | -0.6 |
| 2-ketosmørsyre | 101.0233 | 101,02 | 101.0191 | -0.42 |
| 102,055 | 102,04 | 102.0528 | -0.22 | |
| serin | 104.0342 | 104,02 | 104.0228 | -1.14 |
| maleinsyre / fumarsyre en | 115.0026 | 115,03 | 115 | -0.26 |
| ravsyre en | 117.0182 | 117,01 | 117.0125 | -0.57 |
| threonin | 118.0499 | 118,04 | 118.0456 | -0.43 |
| oxaleddikesyre | 130.9975 | 131.03 | 130,991 | -0.65 |
| asparaginsyre en | 132.0291 | 132,03 | 132.0256 | -0.35 |
| æblesyre en | 133.0132 | 133,02 | 133.0221 | 0,89 |
| salicylsyre | 137.0233 | 137.02 | 137.0349 | 1.16 |
| α-ketoglutarsyre | 145.0132 | 145,02 | 145.0063 | -0.69 |
| glutaminsyre en | 146.0448 | 146,01 | 146.0408 | -0.4 |
| pentose | 149.0445 | 149,04 | 149.0414 | -0.31 | </ Tr>
| aconitsyre en | 173.0081 | 173,03 | 173.0057 | -0.24 |
| ascorbinsyre en | 175.0237 | 175,05 | 175.0341 | 1.04 |
| hexose | 179,055 | 179,05 | 179.0484 | -0.66 |
| citronsyre / isocitronsyre en | 191.0186 | 191,02 | 191.0166 | -0.2 |
| palmitinsyre | 255.2319 | 255,22 | 255.2246 | -0.73 |
| hexose-6-phosphat en | 259.0213 | 259,04 | 259,014 | -0.73 |
| stearinsyre | 283.2632 | 283,26 | 283.2552 | -0.8 |
| sucrose a | 341.1078 | 341,07 | 341.0972 | -1.06 |
en MS / MS udført for identifikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som diskuteret ovenfor, prøveforberedelse er den mest afgørende skridt i MSI workflow. Embedding vævet ujævnt vil forårsage skæring at være vanskeligt eller ikke er mulig i nogle tilfælde. Afsnittet størrelse og tilstrækkelig Ekvilibreringstiden er afgørende for at opretholde vævet integritet og undgå foldning og tårer. Udvælgelse af matrix og anvendelse teknik vil spille en rolle i at bestemme typerne af analytter skal påvises, den rumlig opløsning, og reproducerbarhed af resultaterne. Ved hjælp af en kombination af matricer eller påføringsteknikker kunne give komplementære resultater.
Denne metode er udviklet specielt til målrettede MSI af endogene metabolitter i M. truncatula rod knude væv, men kan nemt tilpasses til andre vævstyper og biologiske spørgsmål. De anbefalede matrix anvendelsesmetoder for små molekyle MSI er sublimering og automatisk sprøjten. Forøgelse af mængden af opløsningsmiddel aflejret på tissue, ved at justere den automatiske sprøjte-metoden vil forøge udvinding af analytter og giver mulighed for detektion af en større masse forbindelser bør man vælge at udføre MSI lipider, peptider, etc. Ved brug af andre former for væv, vil den vigtigste justering være for sektionens tykkelse. Ideelt vævet bør skiver til tykkelsen af en celle, og derfor tykkere sektioner måske hensigtsmæssigt plantevæv og tyndere sektioner er egnede til dyrevæv. Hvis der opstår foldning eller tåreflåd, typisk en længere ækvilibreringstid er nødvendig, før sektionering eller en tykkere sektion størrelse kan være nødvendig. Ved udførelse af LC-MS at opnå nøjagtige masser, vævet udvinding protokol, mobil fase opløsningsmidler og gradient, kolonne stationær fase, og MS ionisering mode kan alle justeres og optimeres til analytter af interesse.
Den største fordel ved MALDI-MSI er dens evne til at levere ikke kun masse information, men også geografisk information for en given prøveuden behov for forudgående kendskab til målanalytter. Andre billeddiagnostiske teknikker kræver brug af derivatiseringer eller tags 5. Som tidligere omtalt, en begrænsning af denne teknik er den overflod af interfererende matrix iontoppe. Nye matricer er blevet rapporteret at afhjælpe denne begrænsning. Alternativt sekundær ion-massespektrometri (SIMS)-MSI er en matrix-fri billeddannelse mulighed, men det har mindre følsomhed end MALDI-MSI 3. En anden begrænsning ved denne teknik er den lavere masse opløsning MALDI-TOF/TOF instrumenter. På grund af den lille masse opløsningsevne, er det nødvendigt også at udføre højopløsnings-MS til opnåelse af nøjagtige masserne metabolit identifikation, hvilket betyder flere eksperimenter og mere tid. Dette problem kunne løses ved at udføre MALDI-MSI på en høj opløsning instrument platform såsom MALDI-Orbitrap. Den endelige begrænsning udføre MSI eksperimenter er manglen på software-værktøjer til rådighed til analyse af MSI data altHough nogle nylige fremskridt i MSI-software er blevet gjort 27,28. Typisk MS spektret for hver imaging region skal manuelt analyseres og ion billeder udvindes ved hånden. MSI eksperimenter producerer en overflod af data og kan være utroligt tidskrævende at analysere. Samlet MALDI-MSI giver enestående fordele for at opnå geografisk information af mange forbindelser samtidigt i et enkelt eksperiment, der kan være særdeles nyttig for den målrettede analyser af små molekyler og andre forbindelser med mange biologiske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Jean-Michel ane på Institut for Agronomi på UW-Madison for at give Medicago truncatula prøver. Dette arbejde blev støttet delvist af midler fra National Science Foundation (NSF) tilskud CHE-0.957.784, University of Wisconsin Graduate School og Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) og Romnes Faculty Research Fellowship program (LL). EG anerkender en NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1.256.259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
- Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, 130-145 (2013).
- Ye, H., Gemperline, E., Li, L. A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics. Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).
- Wei, R. Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry. Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).
- Kobayashi, T., et al. A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer. Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).
- West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics. Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).
- Spegel, P., et al. Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release. Biochem. J. 450, 595-605 (2013).
- Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics. J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).
- Prell, J., Poole, P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).
- Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation. Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).
- Stemmler, E. A., et al. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).
- Neupert, S., Predel, R. Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect. Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).
- Northen, T. R., et al. Clathrate nanostructures for mass spectrometry. Nature. 449, (2007).
- Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Chen, S., et al. 2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).
- Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
- Shroff, R., Svatos, A. Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).
- Shimma, S., Setou, M. Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).
- Paschke, C., et al. Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).
- Parry, R. M., et al. omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).
