Summary
Massespektrometrisk imaging (MSI) er et kraftig verktøy som kan brukes til å oppdage og identifisere ulike kjemiske stoffer i intakt vev, bevare forbindelsene i sine opprinnelige omgivelser, noe som kan gi ny innsikt i biologiske prosesser. Heri en MSI metode utviklet for analyse av små molekyler er beskrevet.
Abstract
De teknikker som brukes for å undersøke små molekyler, slik som farmasøytiske medikamenter eller endogene metabolitter, benytter vevsekstrakter som krever homogenisering av vev av interesse som kan forårsake forandringer i de metabolske baner som studeres en. Massespektrometrisk imaging (MSI) er et kraftig analytisk verktøy som kan gi romlig informasjon av analytter innen intakte skiver av biologiske vevsprøver 1-5. Denne teknikken er blitt brukt i stor utstrekning for å studere forskjellige typer av forbindelser, inkludert proteiner, peptider, lipider, og små molekyler slik som endogene metabolitter. Med matrise-assistert laser desorpsjon / ionisering (MALDI)-MSI, kan romlige fordelinger av flere metabolitter være samtidig oppdaget. Heri, er en metode utviklet spesielt for å gjennomføre vilkårlige metabolomics MSI eksperimenter på legume røtter og rot knuter presenteres som kunne avsløre innsikt i de biologiske prosessene som foregår. DenMetoden som presenteres her viser en typisk MSI arbeidsflyt, fra prøvepreparering for bildeopptak, og fokuserer på matrisen påføringstrinnet, noe som viser flere matriks påføringsteknikker som er nyttige for detektering av små molekyler. Når MS-bilder genereres, er analysen og identifisering av metabolitter av interesse diskutert og demonstrert. Standarden arbeidsflyt presenteres her kan enkelt endres for ulike vevstyper, molekylære arter, og instrumentering.
Introduction
Den voksende feltet av metabolomics har mange viktige biologiske bruksområder, inkludert biomarkører, tyde metabolske veier i planter og andre biologiske systemer, og toksikologi profilering 4,6-10. En stor teknisk utfordring når en skal studere biologiske systemer er å studere metabolomic trasé uten å forstyrre dem 11. MALDI-MSI gir mulighet for direkte analyse av intakte vev som gjør at sensitiv deteksjon av analytter i enkeltorganer 12,13 og til og med enkeltceller 14,15.
Prøveopparbeidelse er et viktig skritt i å produsere reproduserbare og pålitelige massespektraldata bilder. Kvaliteten av bildene er meget avhengig av faktorer som vev innstøping medium, snittykkelse, MALDI matrise, og matrisen påføringsteknikk. For avbildningsapplikasjoner, er ideelt tykkelse delen av bredden av en celle (8 til 20 mikrometer, avhengig av prøvetype). MALDI krever deponering av en organisk, crystalline matrise forbindelsen, vanligvis en svak syre, på prøven for å bistå analytt-ablasjon og ionisering. seksten forskjellige matriser gi forskjellige signalintensitet, interfererende ioner, samt ionisering av effektiviteten av forskjellige klasser av forbindelser.
Matrisen applikasjon teknikk spiller også en rolle i kvaliteten på massespektraldata bilder og forskjellige teknikker er egnet for forskjellige klasser av analytter. Tre matrise påføringsmetoder er presentert i denne protokollen: airbrush, automatisk sprøyta, og sublimering. Airbrush matrise søknaden er mye brukt i MALDI bildebehandling. Fordelen med Spraymaling matrise søknad, er at den er relativt rask og enkel. Imidlertid avhenger kvaliteten på airbrush matrise bruksområdet betraktelig på dyktighet av brukeren og har en tendens til å være mindre reproduserbar og forårsake spredning av analytter, spesielt små molekyler 17. Automatiske sprøyter systemer har lignende mekanikere til airbrush matrise program, men have er utviklet for å fjerne variabilitet sett med manuell airbrush påføring, noe som gjør spray mer reproduserbar. Denne metoden kan noen ganger være mer tidkrevende enn tradisjonell airbrush matrise søknad. Både manuell airbrush og automatiske sprøyter systemer er løsemiddelbaserte matrise påføringsmetoder. Sublimering er en tørr matrise påføringsteknikk som blir mer og mer populært for masse spektral avbildning av metabolitter og små molekyler fordi det reduserer analytt diffusjon, men mangler det løsemiddel nødvendig å trekke ut og observere høyere masse forbindelser 18.
Trygge identifikasjon av metabolitter krever vanligvis nøyaktige masse målinger for å oppnå antatte identifikasjoner fulgt av tandem masse (MS / MS) eksperimenter for validering, med MS / MS spektra blir sammenlignet med standarder, litteratur eller teoretisk spektra. I denne protokoll høy oppløsning (masse oppløsningsevne på 60.000 ved m / z 400), væskekromatografi (LC)-MS er forbundet med MALDI-MSI å oppnå både romlig informasjon og trygg identifisering av endogene metabolitter, ved hjelp Medicago truncatula røtter og rot knuter som det biologiske system. MS / MS eksperimenter kan utføres direkte på vev med MALDI-MSI eller på vevsekstrakter med LC-MS og brukes til validering av metabolitten identifikasjoner.
Denne protokollen gir en enkel metode for å kartlegge endogene metabolitter i M. truncatula, som kan tilpasses og brukes til MSI av små molekyler i forskjellige typer vev og biologiske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Instrumentering
- Maldi-TOF/TOF basert masse spektrometri MSI. Bruke et massespektrometer utstyrt med en MALDI kilde for analyse av små molekyler (se tabell of Materials / Equipment). Utfør oppkjøp i positiv eller negativ ion modus avhengig av analyttene av interesse. Spesifiser en masseområdet av interesse og samle 500 laser skudd / flekk på 50 mikrometer intervaller i både x-og y-dimensjoner på tvers av overflaten av prøven for å generere ion bilder. Den rasterbredde og antall laser skudd kan justeres for å oppnå høyere romlig oppløsning og maksimal signalintensitet hhv. Bruk DHB matrix topper eller interne standarder brukes på lysbildet eller direkte til vevet å kalibrere massespektra.
- Høy oppløsning LC-MS. (Se tabell for material / utstyr) Kjør prøveekstrakter med LC-MS ved hjelp av enten reversert fase (RP) LC med en C-18 kolonne, eller normal fase (NP) med en HILIC kolonne avhengig av analyttene av interesse. Bruk mobilfaser oggradienter som aktuelle for den spesifikke prøvetype. Utfør kjøp i positive eller negative ion modi avhengig av prøvetypen.
2. Vevpreparerina
- Trim roten nodul fra anlegget, slik at 3-4 mm av roten som er festet til nodul.
- Umiddelbart etter disseksjon, bruk tang for å sette vevet i en cryostat kopp og dekke med gelatin (100 mg / ml i avionisert vann). Det er viktig for vevet som skal fast i bunnen av koppen uten luftbobler.
- Flash fryse vevet ved å plassere begeret i et tørris / etanol-bad inntil gelatinen stivner og blir ugjennomsiktig. Oppbevar prøver ved -80 ° C inntil bruk.
- Ta prøver fra -80 ° C fryser, skjære bort plasten kryostat cup og trimme bort overflødig gelatin. Monter den innebygde vev til cryostat chuck med en krone-størrelse mengde optimal skjæretemperatur (OCT) media, mens ikke gi OCT berøre vevet. Plasser i kryostatboksen til oktober stivner.
- La chuck og gelatin for å stabilisere seg i kryostaten boksen (satt til -20 eller -25 ° C) i ca 15 min.
- Bruk kryostaten (se tabell of Materials / Equipment) § vev omtrent tykkelsen av én celle (8-20 mikrometer, avhengig av vevet type) og tine montere hver skive på ITO-belagt glass ved oppvarming av baksiden (ikke-ITO -belagt side) av en ITO-belagt glass lysbilde på baksiden av hånden din. Plasser det ITO-belagte side av den oppvarmede glide nærheten av det frosne vev skive og tillater stykket å holde fast på lysbildet. Plassere delene tett sammen på lysbildet vil gi bedre justering under MSI.
Tre. Matrix Application
- Airbrush Anvendelse av MALDI Matrix
- Alle airbrush prosedyrer skal utføres i et avtrekksskap.
- Rengjør airbrush løsning container og dysen (se tabell for material / utstyr) med metanol ogfyll oppløsningsbeholderen med DHB matrise-oppløsning (150 mg / ml i 50% methanol/0.1% TFA v / v).
- Hold Spraymaling omtrent 35 cm fra prøven, og anvende 10-15 strøk med matriks på overflaten av dekselet med en varighet på 10 sekunder spray og 30 sek tørketid på mellom hvert strøk.
- Rengjør airbrush igjen med metanol når du er ferdig for å unngå tilstopping fra matrisen løsning.
- Automatisk Sprayer Anvendelse av MALDI Matrix
- Følg oppstarts instruksjonene fra produsentene av den automatiske sprøyta system.
- For MSI av metabolitter i roten knuter ved bruk av 40 mg / ml (i 50% methanol/0.1% TFA v / v) DHB som matrise, stille inn temperaturen til ~ 80 ° C, hastighet til 1250 mm / min, strømningshastighet til 50 mL / min, og antall passerer til 24. For best mulig dekning, er det anbefalt å dreie munnstykket 90 °, og / eller forskyvning av dysen 1,5 mm mellom hver passering. Begynn sprayer metoden.
Som en side noten, den spesielle dyse som brukes her varmer dysen for raskere fordampning av løsningsmidlet. Som oppløsningsmiddel fordamper, øker konsentrasjonen av grunnmassen raskt. Matrisen påføres prøven med spraymaling, og den automatiske sprøyten har sammenlignbare konsentrasjoner. - Følg stengings instruksjonene fra produsentene av den automatiske sprøyta system.
- Sublime Anvendelse av MALDI Matrix
- Vei ut 300 mg DHB inn i bunnen av sublimekammeret (se tabell of Materials / Equipment).
- Hold deg glass-slide til den kalde finger (øverste delen av sublime kammer) med vevsdelene vendt ned med tosidige, ledende tape. Dekk hele baksiden av lysbildet med dobbeltsidig tape for enda ledningsevne, produsere enda matrise deponering.
- Klem topp-og bunnhalvdelene av sublimekammeret sammen med C-klemmen. Koble vakuum og add is og kaldt vann til det øvre reservoar.
- Plasser sublime kammer i en varmekappe som er ved romtemperatur.
- Slå på vakuumpumpen. Vent 15 minutter og slå på varmekappe. Den varmekappe skal nå 120 ° C i løpet av 10 min.
- Etter 10 min, slå av varmen, i nærheten av ventilen for vakuum (slik at innsiden av kammeret forblir under vakuum) og slå av vakuumpumpen.
- Tillat kammeret for å komme til romtemperatur, åpnes ventilen slik at vakuumtrykket og fjerne prøven. Størrelsen av sublime kammeret vil bestemme mengden av matrix sublimert til glass-slide. De større sublime kamre (på størrelse med en 400 ml begerglass) vil bruke ca 300 mg av DHB mens de mindre kamre (på størrelse med en 150 ml begerglass) vil bruke ca 100 mg av DHB og vil kreve kutte glass lysbilde slik at det passer inn i kammeret.
4. Image Acquisition
- <li> Mark a + mønster på hvert hjørne av prøven med en WiteOut korrekturlakk penn til å bli brukt som "lærer poeng". Plasser glass-slide i den MALDI glideadapterplaten og ta et optisk bilde av prøven ved hjelp av en scanner.
- Sett opp et bilde oppkjøpet fil ved hjelp av programvaren som følger med instrumentet selskap med en raster trinn størrelse på 50 mikrometer og en laser diameter lik eller mindre enn raster trinnstørrelse. På dette spesielle instrument, gir minimum laser innstilling en laser diameter på omtrent 10 mikrometer og små laser innstilling har en 40 til 50 mikrometer diameter.
- Legg den optiske bilde inn i programvaren og justere platen med den optiske bilde.
- Kalibrere instrumentet før du begynner kjøpet ved hjelp av vanlige matriseklase ioner, interne standarder, eller en kalibrerings mix.
- Angi de områder av vevet som skal analyseres med MSI, inkludert en flekk av ren matrise på objektglasset for å bli brukt som en "blank".
- Begynn acoppkjøpet.
5. Bilde Generation
- Åpne bildefilen i den kommersielt tilgjengelig programvare levert av leverandøren og pakke ut ion bilder. Andre open-source programvare er tilgjengelig for MSI databehandling 19.
6. Metabolitt Identifikasjon
- Velg en bestemt m / z av interesse fra massespekteret med leverandøren spesifikk programvare (se tabell for material / utstyr). Et analytt kan skilles fra en matrise ion når en analytt-topp er valgt blant masse-spektrum, og ion-bilder genereres spesifikt lokalisert til vev-delen.
- Generere en liste over analytter av interesse og utføre MS / MS eksperimenter. Se tabell 1 og tabell 2 i Representative Resultater for eksempellister av analytter.
- Utfør målrettet LC-MS-analyse på en høyoppløselig massespektrometer (eller høy oppløsning MALDI-MS hvis tilgjengelig) for å oppnå nøyaktigemassemålinger av analyttene av interesse og også utføre LC-MS/MS av målet analytter å skaffe karakteristiske fragmentering mønstre.
- Utfør database søker å bestemme antatte identifikasjoner for målrettede analyser. Eksempler på metabolitten databaser inkluderer: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG, og HMDB.
- For å bekrefte de antatte identifikasjoner fra nøyaktig masse database søking, matche MS / MS fra de målrettede analyser til MS / MS spektra av standarder, litteratur, og / eller fragmentering prediksjon programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En eksperimentell oversikt over MSI er vist i figur 1.. Ved begynnelsen av forsøket, er prøvepreparering et kritisk trinn. Knuter er trimmet fra anlegget rot og innebygd i gelatin. Vevet må trykkes flatt mot kryostat cup, uten bobler, mens den blir frosset, og dette vil sikre enklere og riktig justering av vev mens den blir delt. Når vevet blir skiver, er det viktig å skjære vevet i riktig tykkelse, for tynne seksjoner vil rive, ødelegger vev integritet, mens for tykke seksjoner vil redusere antall analytter som er trukket ut og detekteres fra vevet. Valg av matrise og påføringsteknikk vil avgjøre hvilke typer analyser oppdaget. Ved hjelp av en kombinasjon av matriser kunne gi komplementære resultater. Tre matrise søknad teknikker er presentert i dette arbeidet. Airbrush Teknikken er rask, men vanligvis ikke egnet for MSI av små molekyler væreÅrsaken til analytten diffusjon. Automatiske sprøyter systemer og sublimering gir mindre matrise krystaller, bedre reproduserbarhet, og mindre analytt diffusjon. Figur 2 viser et optisk bilde av en Medicago truncatula rot nodul-delen. Figur 3 viser et optisk bilde eksempel på matrisen dekning og krystall-størrelser ved hjelp av spraymaling, automatisk Sprayer, og sublimehenholdsvis.
Konvensjonelle grunnmasser, som DHB, produserer mange ioner i det nedre masseområde (m / z 100-400) 20. Disse matrise ioner kan interferere med deteksjonen av metabolitter i dette området. Figur 4 viser MS spektra av bare DHB matrisen i forhold til roten nodul vev belegges med DHB matrise. DHB matrix toppene er angitt i rødt og rot nodule vev dekket med DHB er vist i blått. Novel matrikser slik som TiO 2 nanopartikler 21, 1,5-diaminonapthalene (DAN) 22, 2,3,4,5-tetrakis (3 ', 4'-dihydroxylphenyl) tiofen (DHPT) 23 og 1,8-bis (dimetyl-amino) naftalen (dman) 24,25 er rapportert som reduserer interferens av matriks-ioner i lav masseområdet, og også forbedre deteksjon av visse klasser av metabolitter fem. Matrix toppene kan skilles fra virkelige metabolitter ved hjelp av MS-bilder. Når en topp er klikket på, er det ion bildet ut og vises overlappende den optiske bilde. De toppene som genererer bilder med tydelig lokalisering til vevet, og er ikke tilstede i matrisen eneste området avbildes, anses metabolitter. Figur 5a viser flere representative ion bilder av metabolitter funnet i root nodule vev, mens figur 5b viser eksempler på MS-bilder tilsvarende matrise relaterte topper. I figur 5a bildet viser tydelig lokalisering til roten nodul vev og manglende signal i grunnmassen eneste området som ble fotografert. I figur 5b M. truncatula rot nodul vevet Tabell 2 (negativ modus) 4 som er oppført i tabell 1 (positiv modus) og.
Det endelige målet for vilkårlige metabolomics eksperimenter er å identifisere forbindelsene som ble oppdaget. Ved utføring av MSI på en middels oppløsning instrument (MRMS), for eksempel en TOF / TOF, er det nødvendig for å oppnå nøyaktige massemålinger på en annen måte. Dette kan gjøres med en fasettert MS tilnærming der MALDI-MSI Resultatene er sammenlignet med høy oppløsning LC-MS-data ved hjelp av vevs-ekstrakter. Det er mange mulige vev ekstraksjonsmetoder å velge mellom, avhengig av analyttene av interesse. Høyoppløsnings MS (HRMS) kan utføres i positiv eller negativ ionisering modes og med normal eller reversert fase LC avhengig av analytter av interesse. Når en nøyaktig masse oppnås med høy oppløsning LC-MS, kan det resulterende massen søkes med flere databaser, nevnt ovenfor, for å oppnå en antatt identifikasjon. Neste MS / MS-data blir innsamlet, og det karakteristiske fragmenteringsmønsteret av analytten av interesse kan sammenlignes med standarder, litteratur-spektra eller teoretiske fragmenteringsmønstre. Figur 6 viser et eksempel på en av metabolittene detektert med MSI og LC-MS. Denne metabolitten ble identifisert som heme utgangspunkt i MS / MS-spektrum med høy oppløsning oppsamlet LC-MS. Dette MS / MS data ble sammenlignet med MS / MS spektra tidligere utgitt av Shimma og Setou 26. De to MS / MS spektra kamp, derfor identiteten m / z 616,2 ble trygt tildelt som heme basert på den nøyaktige massen database søking og MS / MS-data i forhold til litteratur MS / MS-data.
Figur 1. Oversikt over MSI arbeidsflyt. Root knuter er trimmet fra anlegget, innebygd i gelatin, seksjonert med kryostat og montert på en ITO-belagt glass lysbilde. Matrix påtrykkes skyve ved hjelp av en av tre matrisepåføringsteknikker. MSI oppkjøpet er utført med en Maldi-TOF/TOF basert masse spektrometri massespektrometer og MS spektra er samlet inn bilder med MSI-programvaren.
Figur 2. Vevsprøve optisk bilde. Representant optisk bilde av en Medicago truncatula root nodule vev delen.
Figur 3. Eksempel matrix avsetninger. Representative bilder som viser de forskjellige konsistenser av matrise deponering med a) airbrush, b) automatisk sprøyta, og c) sublimering teknikker. Airbrush påføringsmetoden genererer store og små krystaller mens den automatiske sprøyta metoden produserer små lik størrelse krystaller. Sublime produserer ett jevnt lag av matrise. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. MS spekteret av plai DHB matrise vs root nodule vev dekket med DHB. DHB matrise toppene er angitt i rødt og rot nodule vev dekket med DHB er vist i blått. Matrix toppene kan skilles fra virkelige metabolitter ved hjelp av MS-bilder. Når en topp er klikket på, er det ion bildet ut og vises overlappende den optiske bilde. De toppene som genererer bilder med tydelig lokalisering til vevet, og er ikke tilstede i matrisen eneste området fotografert, anses metabolitter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. MS bilder av M. truncatula roten knuter. a) Representative ion bilder av metabolitter found i villtype M. truncatula rot knuter. b) Representative ion bilder av matrise arter som ikke ville bli vurdert metabolitter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Eksempel MS / MS data for metabolitten identifikasjon. MS / MS spekteret av m / z 616,2, identifisert som heme [M +]. Den kjemiske struktur er vist og fragmentering strukturer er tilordnet. Den eksperimentelle MS / MS-data i forhold til MS / MS-spektret av heme rapportert i litteraturen ved Shimma og Setou 26..
Tabell 1. Analytter av interesse -. Positiv modus Sample liste over analytes av interesse fra M. truncatula root nodule vev i positiv ion modus fire.
| Navn på metabolitt | Teoretisk [M + H] + | MRMS Målte [M + H] + | HRMS Målte [M + H] + | Δm (MDA) |
| γ-aminosmørsyre en | 104.0706 | 104.1 | 104.0706 | 0 |
| kolin en, * | 104.1070 > | 104.1 | 104.1071 | 0,01 |
| Proline | 116.0706 | 116,07 | 116.0706 | 0 |
| valin | 118.0863 | 118,09 | 118.0865 | 0,02 |
| leucine en | 132.1019 | 132,1 | 132.1022 | 0,03 |
| asparagin en | h: 79px; "> 133,0608133,06 | 133.0602 | -0,06 | |
| adenin en | 136.0618 | 136,07 | NA | NA |
| proling betain en | 144.1019 | 144,1 | 144.1024 | 0,05 |
| glutamin en | 147.0764 | 147,09 | 147.0768 | 0,04 |
| 156.0768 | 156,06 | 156.0771 | 0,03 | |
| arginin en | 175.1190 | 175,13 | 175.1167 | -0,23 |
| sukrose + K | 381.0794 | 381,05 | 381.0791 | -0,03 |
| heme en, * | 616.1768 | 616,15 | NA | NA |
| ht = "25" style = "height: 26px; width: 173px;"> NAD en | 664.1164 | 664,1 | NA | NA |
| formononetin en | 269.0808 | 269,08 | 269.0803 | 0,05 |
| chrysoseriol GlcA en | 477.1028 | 477,1 | 477.1008 | 0,2 |
| formononetin MalGlc en | 517.1341 | 517,13 | 517.1337 | idth: 64px; "> 0,04|
| aformosin MalGlc en | 547.1446 | 547,16 | 547.1427 | 0,19 |
* [M +]
en MS / MS utført for identifikasjon.
Tabell 2. Analytter severdigheter -. Negativ modus eksempelliste av analytter av interesse fra M. truncatula root nodule vev i negativ ion modus fire.
| Navn på metabolitt | Teoretisk [MH] - | MRMS Målte [MH] - < / Sup> | HRMS Målt [MH] - | Δm (MDA) |
| pyrodruesyre | 87,0077 | 87 | NA | NA |
| alanine en | 88,0393 | 88.01 | 88,0374 | -0,19 |
| melkesyre et | 89,0233 | 89.01 | 89,0296 | 0,63 |
| fosforsyre | 96,9685 | 96.96 | 96,9625 | -0,6 |
| 2-ketobutyric syre | 101.0233 | 101,02 | 101.0191 | -0,42 |
| 102,055 | 102,04 | 102.0528 | -0,22 | |
| serin | 104.0342 | 104,02 | 104.0228 | -1,14 |
| malein / fumarsyre en | 115.0026 | 115,03 | 115 | -0,26 |
| ravsyre et | 117.0182 | 117,01 | 117.0125 | -0,57 |
| treonin | 118.0499 | 118,04 | 118.0456 | -0,43 |
| oxalacetic syre | 130.9975 | 131,03 | 130,991 | -0,65 |
| asparaginsyre en | 132.0291 | 132,03 | 132.0256 | -0,35 |
| eplesyre en | 133.0132 | 133,02 | 133.0221 | 0,89 |
| salicyclic syre | 137.0233 | 137,02 | 137.0349 | 1,16 |
| α-keto-glutarsyre | 145.0132 | 145,02 | 145.0063 | -0,69 |
| glutaminsyre en | 146.0448 | 146,01 | 146.0408 | -0,4 |
| pentose | 149.0445 | 149,04 | 149.0414 | -0.31 | </ Tr>
| aconitic syre en | 173.0081 | 173,03 | 173.0057 | -0,24 |
| askorbinsyre en | 175.0237 | 175,05 | 175.0341 | 1,04 |
| hexose | 179,055 | 179,05 | 179.0484 | -0,66 |
| sitron / isositronsyre syre en | 191.0186 | 191,02 | 191.0166 | -0,2 |
| palmitinsyre | 255.2319 | 255,22 | 255.2246 | -0,73 |
| hexose-6-fosfat en | 259.0213 | 259,04 | 259,014 | -0,73 |
| stearinsyre | 283.2632 | 283,26 | 283.2552 | -0,8 |
| sukrose en | 341.1078 | 341,07 | 341.0972 | -1,06 |
en MS / MS utført for identifikasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som omtalt ovenfor, er prøvepreparering det mest kritiske trinn i MSI arbeidsflyten. Inkludering vevet ujevnt vil føre til snitting å være vanskelig eller ikke mulig i noen tilfeller. Størrelse Seksjonen og tilstrekkelig ekvilibreringstid er avgjørende for å opprettholde vevet integritet og å unngå folding og tårer. Valg av matrisen og påføringsteknikk vil spille en rolle i å bestemme typer av analytter som skal påvises, den romlige oppløsning, og reproduserbarhet av resultatene. Ved hjelp av en kombinasjon av matriser eller søknad teknikker kunne gi utfyllende resultater.
Denne metoden ble utviklet spesielt for vilkårlige MSI av endogene metabolitter i M. truncatula root nodule vev, men kan enkelt tilpasses andre vevstyper og biologiske spørsmål. De anbefalte matrise påføringsmetoder for lite molekyl MSI er sublimering og automatisk sprøyta. Å øke mengden av oppløsningsmiddel som avsettes på tissue, ved å justere den automatiske sprøyte-metoden, vil øke utvinning av analytter og gir mulighet for påvisning av høyere masse forbindelsene bør man velge å utføre MSI av lipider, peptider, etc. Ved bruk av andre typer vev, vil den største justeringen være seksjonens tykkelse. Ideelt vevet bør skiver til tykkelsen av en celle, og derfor tykkere seksjoner kanskje egnet for plantevevet og tynnere partier som er egnet for animalsk vev. Ved bretting eller rive skjer, vanligvis en lengre ekvilibreringstid er nødvendig før snitting eller en tykkere seksjon størrelse kan være nødvendig. Ved utførelse av LC-MS for å oppnå nøyaktige masser, vevet ekstraksjon protokollen, mobil fase oppløsningsmidler og gradient, kolonne stasjonær fase, og MS ionisering modus kan alle bli justert og optimalisert for analytten av interesse.
Den største fordelen med MALDI-MSI er dens evne til å gi ikke bare massen informasjon, men også romlig informasjon for en gitt prøveuten behov for forkunnskaper i målet analytter. Andre bildeteknikker som krever bruk av derivatizations eller koder 5. Som omtalt tidligere, er en begrensning av denne teknikken overflod av forstyrrende matrise ion toppene. Novel matrikser har blitt rapportert å løse denne begrensningen. Alternativt, er sekundær ion massespektrometri (SIMS)-MSI en matrise-fri bildebehandling alternativ, men den har mindre følsomhet enn MALDI-MSI tre. En annen begrensning med denne teknikken er den nedre masse oppløsning av Maldi-TOF/TOF basert masse spektrometri instrumenter. På grunn av den lave masseoppløsningsevne, er det nødvendig også å utføre høy oppløsning MS for å oppnå de nøyaktige masser for metabolitt identifikasjon, det vil si flere eksperimenter og mer tid. Dette problemet kan løses ved å utføre MALDI-MSI på en høyoppløselig instrument plattform som MALDI-Orbitrap. Den endelige begrensning av å utføre MSI eksperimenter er mangelen av programvare tilgjengelig for analyse av MSI data, altHough noen nylige fremskritt i MSI-programvaren har blitt gjort 27,28. Vanligvis MS-spektrum for hver avbildning region må manuelt analysert og ione-bilder ut for hånd. MSI eksperimenter produserer en overflod av data og kan være utrolig tidkrevende å analysere. Totalt sett byr MALDI-MSI unike fordeler for oppnåelse av romlig informasjon for mange forbindelser samtidig i et enkelt eksperiment som kan være svært nyttig for vilkårlige analyse av små molekyler og andre forbindelser med mange biologiske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke dr. Jean-Michel ane ved Institutt for agronomi ved UW-Madison for å gi Medicago truncatula prøver. Dette arbeidet ble støttet delvis av midler fra National Science Foundation (NSF) stipend CHE-0957784, University of Wisconsin Graduate School og Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) og Romnes Fakultet stipendprogram (til LL). EG erkjenner en NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1256259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
- Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, 130-145 (2013).
- Ye, H., Gemperline, E., Li, L. A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics. Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).
- Wei, R. Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry. Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).
- Kobayashi, T., et al. A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer. Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).
- West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics. Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).
- Spegel, P., et al. Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release. Biochem. J. 450, 595-605 (2013).
- Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics. J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).
- Prell, J., Poole, P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).
- Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation. Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).
- Stemmler, E. A., et al. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).
- Neupert, S., Predel, R. Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect. Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).
- Northen, T. R., et al. Clathrate nanostructures for mass spectrometry. Nature. 449, (2007).
- Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Chen, S., et al. 2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).
- Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
- Shroff, R., Svatos, A. Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).
- Shimma, S., Setou, M. Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).
- Paschke, C., et al. Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).
- Parry, R. M., et al. omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).
