ההדמיה ספקטרומטריה (MSI) היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בם כדי לגלות ולזהות תרכובות כימיות שונות ברקמות שלמות, שמירה על התרכובות בסביבות האם שלהם, אשר יכול לספק תובנות חדשות על תהליכים ביולוגיים. להלן שיטת MSI פיתחה לניתוח של מולקולות קטנות, הוא תאר.
רוב הטכניקות המשמשות ללמוד מולקולות קטנות, כגון תרופות סמים או מטבוליטים אנדוגני, להעסיק תמציות רקמה הדורשות הומוגניות של הרקמות של עניין שעלול לגרום לשינויים במסלולים מטבוליים נחקרים 1. ההדמיה ספקטרומטריה (MSI) היא כלי אנליטי רב עוצמה שיכול לספק מידע המרחבי של analytes בתוך פרוסות שלמות של דגימות רקמה ביולוגיות 1-5. טכניקה זו נעשתה שימוש נרחב ללמוד סוגים שונים של תרכובות כוללים חלבונים, פפטידים, שומנים, ומולקולות קטנות, כגון מטבוליטים אנדוגני. עם desorption / יינון לייזר בסיוע מטריקס (MALDI)-MSI, הפצות המרחבי של מטבוליטים רבים ניתן לאתר בו זמנית. בזאת, שיטה שפותחה במיוחד עבור ביצוע ניסויי MSI metabolomics לא ממוקדים בשורשי קטניות וגושי שורש מוצגת שיכול לחשוף תובנות התהליכים הביולוגיים המתרחשים.שיטה שהוצגה כאן מראה זרימת עבודה MSI טיפוסית, מהכנת מדגם לרכישת תמונה, ומתמקדת בשלב יישום מטריקס, הוכחת כמה טכניקות יישום מטריצה כי הם שימושיים לאיתור מולקולות קטנות. ברגע שהתמונות של הטרשת הנפוצה שנוצרו, הניתוח וזיהוי של מטבוליטים של העניין נדון והפגינו. זרימת העבודה סטנדרטית שהוצגה כאן ניתן לשנות בקלות לסוגי רקמות שונים, מינים מולקולריים, ומכשור.
השדה הולך וגדל של metabolomics יש יישומים ביולוגיים חשובים רבים, כולל גילוי סמן ביולוגי, פענוח מסלולים מטבוליים בצמחים ומערכות ביולוגיות אחרות, ופרופיל טוקסיקולוגיה 4,6-10. אתגר טכני עיקרי כאשר לומדים במערכות ביולוגיות הוא ללמוד מסלולי metabolomic מבלי לשבשם 11. MALDI-MSI מאפשר ניתוח ישיר של רקמות שלמות המאפשר זיהוי רגיש של analytes באיברים בודדים 12,13 ואפילו תאים בודדים 14,15.
הכנת מדגם היא צעד חיוני בייצור דימויי רפאים המוניים לשחזור ואמינים. האיכות של התמונות מאוד תלויה בגורמים כגון בינוני רקמות הטבעה, עובי פרוס, מטריקס MALDI, ויישום טכניקת מטריצה. עבור יישומי הדמיה, עובי סעיף אידיאלי הוא הרוחב של תא אחד (8-20 מיקרומטר תלוי בסוג המדגם). MALDI דורש תצהיר של אורגני, Crystallinמתחם מטריצת דואר, בדרך כלל חומצה חלשה, על המדגם כדי לסייע אבלציה ויינון אנליטי. 16 מטריצות שונות מספקים עוצמות שונות אות, יונים מפריעים, ויעילות יינון של סוגים שונים של תרכובות.
טכניקת יישום המטריצה גם משחקת תפקיד באיכות של מסת תמונות רפאים וטכניקות שונות מתאימים לסוגים שונים של analytes. שלוש שיטות יישום מטריצה מוצגות בפרוטוקול זה: מברשת אוויר, מרסס אוטומטי, ומראה. יישום מטריצת Airbrush כבר בשימוש נרחב בתחום ההדמיה MALDI. היתרון של יישום מטריצת מברשת אוויר הוא שזה הוא יחסית מהיר וקל. עם זאת, האיכות של יישום מטריצת airbrush מאוד תלויה במיומנות של המשתמש ונוטה להיות פחות לשחזור ולגרום לדיפוזיה של analytes, במיוחד מולקולות קטנות 17. יש מערכות מרסס אוטומטיות מכניקה דומה לairbrush יישום מטריצה, אבל havדואר פותחו כדי להסיר את ההשתנות ראו עם יישום airbrush ידני, מה שהופך את ספריי לשחזור יותר. שיטה זו יכולה לפעמים להיות יותר זמן רב יותר מאשר יישום מטריצת מברשת האוויר מסורתי. שני airbrush הידני ומערכות מרסס אוטומטיות שיטות יישום מטריצה ממיסים מבוססות. העידון הוא טכניקת יישום מטריצה יבשה שהופכת יותר ויותר פופולרי עבור ההדמיה ספקטרלי המונית של מטבוליטים ומולקולות קטנות משום שהיא מפחיתה דיפוזיה אנליטי, עם זאת, היא חסרה את צורך ממס כדי לחלץ ולבחון תרכובות מסה גבוהות יותר 18.
זיהוי בטוח של מטבוליטים בדרך כלל דורש מדידות מסה מדויקות כדי להשיג הזדהויות המשוערות אחריו מסת טנדם ניסויים (MS / MS) עבור אימות, עם MS / MS ספקטרום שהשוואה לסטנדרטים, ספרות, או ספקטרום תיאורטי. , כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציה גבוהה פרוטוקול זה (מסת פתרון כוח של 60,000 במ '/ z 400) (LC)-MS הוא מצמידים את MALDI-MSI לקבל גם מידע במרחב ובהזדהויות בטוחים של מטבוליטים אנדוגני, באמצעות Medicago truncatula שורשים וגושי שורש כמערכת הביולוגית. ניתן לבצע ניסויי MS / MS ישירות על הרקמה עם MALDI-MSI או על תמציות רקמה עם LC-MS ומשמשים לאימות של הזדהויות המטבוליט.
פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה למפה מטבוליטים אנדוגני בתוך: מ ' truncatula, אשר יכול להיות מותאם ומיושם על MSI של מולקולות קטנות בסוגי רקמות שונים ומערכות ביולוגיות.
כאמור לעיל, הכנת מדגם היא השלב הקריטי ביותר בתהליך העבודה של MSI. הטבעת הרקמה בצורה לא אחידה תגרום חתך להיות קשה או בלתי אפשרי במקרים מסוימים. גודל הסעיף וזמן איזון נאות הם קריטיים לשמירה על שלמות הרקמה וההימנעות מתקפל ודמעות. בחירה של מטריצה ואת טכניקת יישום תשחק ת?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות ד"ר ז'אן מישל Ane במחלקה לאגרונומיה בUW-Madison עבור מתן דגימות truncatula Medicago. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון מהקרן הלאומית למדע (NSF) מענק מל"ג-0,957,784, בית הספר למוסמכים באוניברסיטת ויסקונסין והקרן ויסקונסין בוגרי המחקר (WARF) ותכנית Romnes הפקולטה מלגת מחקר (לLL). EG מכיר בוגר מחקר אחוות NSF (DGE-1,256,259).
Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25-75-0.8 mm (width-length-thickness) |
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1×10-4 Torr |
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |