代謝産物の調査のためのMALDI-質量分析イメージング<em>ウマゴヤシtruncatula</em>ルート結節
Summary
質量分析イメージング（MSI）は、生物学的プロセスに新たな洞察を提供することができ、ネイティブ環境で化合物を保持し、無傷の組織内の様々な化学種を発見し、識別するために使用することができる強力なツールです。本明細小分子の分析のために開発MSI方法が記載されている。
Abstract
そのような医薬品または内因性代謝産物などの小分子を研究する潜在的に1検討されて代謝経路の変化を引き起こす可能性が目的の組織の均質化を必要とする組織抽出物を使用するために使用される大部分の技術を含む。質量分析イメージング（MSI）は、生物学的組織サンプル1-5の完全なスライス内の分析物の空間的な情報を提供することができる強力な分析ツールです。この技術は、タンパク質、ペプチド、脂質、および内因性代謝産物などの小分子を含む様々なタイプの化合物を研究するために広く使用されている。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI）-MSIでは、複数の代謝物質の空間分布を同時に検出することができる。ここでは、マメ科植物の根と根粒に非標的メタボロミクスのMSI実験を行うために特別に開発された方法が行われている生物学的プロセスへの洞察を明らかにする可能性が提示されている。ザ·ここに提示した方法は、サンプル調製からの画像取得のために、典型的なMSIワークフローを示し、および小分子を検出するために有用であるいくつかのマトリックス適用技術を実証行列適用工程に焦点を当てている。 MS画像が生成されると、関心のある代謝物の分析および同定は議論され示されている。ここに提示標準ワークフローを容易に異なる組織型、分子種、および計測のために修飾することができる。
Introduction
メタボロミクスの成長分野は、バイオマーカーの発見、植物や他の生物系における代謝経路を解読、および毒性プロファイリング4,6-10を含む多くの重要な生物学的なアプリケーションを持っています。生物学的システムを研究の主要な技術的な課題は、彼らに11を中断することなく、メタボローム経路を研究することです。 MALDI-MSIは、単一臓器12,13、さらには単一細胞14,15中の分析物の高感度検出を可能にし、無傷の組織の直接的な分析を可能にする。
試料調製は、再現可能かつ信頼性の高い質量スペクトル画像を生成する上で重要なステップである。画像の品質が大きく、組織包埋媒体、スライス厚、MALDIマトリックス、およびマトリックス適用技術などの要因に依存する。撮像用途のために、理想的な断面の厚さは一つのセル（試料の種類に応じて8〜20ミクロン）の幅である。 MALDIは、有機、クリスタリンの堆積を必要とする検体アブレーションおよびイオン化を支援するために、試料上の電子のマトリックス化合物、典型的には、弱酸、16の異なる行列が異なる信号強度、干渉イオン、および化合物の異なるクラスのイオン化効率を提供する。
行列適用技術は、質量分光画像の品質の役割を果たし、異なる技術が、分析物の異なるクラスに適している。三つの行列の適用方法は、このプロトコルで提示されています。エアブラシ、自動噴霧器、および昇華。エアブラシマトリックスアプリケーションが広くMALDIイメージングに使用されている。エアブラシ行列適用の利点は、比較的迅速かつ簡単であることである。しかし、エアブラシマトリックスアプリケーションの品質が大幅にユーザの技量に依存し、以下で再現可能と分析物の拡散、特に小分子17が発生しやすい。自動噴霧器システムは、マトリックス·アプリケーションをエアブラシと同様の機構を有するが、HAVEスプレーがより再現することは、マニュアルエアブラシアプリケーションで見られる多様性を除去するために開発されて。このメソッドは、時々、より時間のかかる伝統的なエアブラシ行列アプリケーションよりもすることができます。手動エアブラシと自動噴霧器システムの両方が溶剤系マトリックス適用方法である。昇華は、分析物の拡散を減少させるので、代謝物および小分子の質量スペクトルイメージングのためにますます人気になっている乾燥マトリックス適用技術であるが、より高い質量の化合物18を抽出して観察するために必要な溶媒を欠く。
代謝物の確実なIDは、一般的に、タンデム質量MS / MSスペクトルを基準に、文学、または理論スペクトルと比較されると検証のための（MS / MS）実験、続く推定される識別を得るために、正確な質量測定を必要とします。このプロトコル高分解能（M / Z 400で60,000の質量分解能）、液体クロマトグラフィー（中LC）-MSがウマゴヤシは 、生物学的システムとして根や根粒をtruncatula使用して、空間情報と内因性代謝物の自信を持って識別の両方を取得するために、MALDI-MSIに結合されている。 MS / MS実験はMALDI-MSIまたはLC-MSで組織抽出物に対して組織上で直接実行し、代謝産物の同定の検証のために使用することができる。
このプロトコルは、Mの内因性代謝物をマッピングするための簡単な方法を提供し、適合され、種々の組織タイプおよび生物系における小分子のMSIに適用することができるtruncatula、。
Protocol
Representative Results
Discussion
上述のように、試料調製は、MSIのワークフローの中で最も重要な工程である。不均一な組織を埋め込むと、いくつかのケースでは困難または不可能であることが切片なります。セクションのサイズ及び適切な平衡時間は、組織の完全性を維持し、折り畳みおよび涙を避けるために重要である。マトリックスおよび適用技術の選択は、検出されるべき分析対象物の種類を決定する役割、空間分?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、 ウマゴヤシtruncatulaサンプルを提供するためのウィスコンシン大学マディソン校での栽培の部門の博士ジャン=ミシェル·ANEを承認したいと思います。この作品は、全米科学財団（NSF）からの資金によって部分的にサポートされていた補助金哲0957784、ウィスコンシン大学大学院ウィスコンシン同窓会研究財団（WARF）とRomnes学部研究フェローシッププログラム（LLまで）。 EGは、NSF大学院研究フェローシップ（DGE-1256259）を認めている。
Materials
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25-75-0.8 mm (width-length-thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1×10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
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