MALDI por espectrometria de massa de imagens de Investigação de metabólitos em<em> Medicago truncatula</em> Os nódulos radiculares
Summary
Imagiologia por espectrometria de massa (MSI) é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para descobrir e identificar várias espécies químicas em tecidos intactos, preservando os compostos em seus ambientes nativos, que pode fornecer novos insights sobre processos biológicos. Aqui um método MSI desenvolvido para a análise de moléculas pequenas é descrito.
Abstract
A maioria das técnicas utilizadas para estudar moléculas pequenas, tais como fármacos ou metabolitos endógenos, empregam extractos de tecidos que requerem a homogeneização do tecido de interesse, que poderia, potencialmente, causar alterações nas vias metabólicas em estudo 1. Imagiologia por espectrometria de massa (MSI) é uma poderosa ferramenta analítica que pode fornecer informação espacial dos analitos dentro fatias intactas de amostras de tecidos biológicos 1-5. Esta técnica tem sido amplamente utilizado para o estudo de vários tipos de compostos, incluindo proteínas, péptidos, lípidos, e moléculas pequenas, tais como metabolitos endógenos. Com matriz assistida por laser de dessorção / ionização (MALDI)-MSI, distribuições espaciais de vários metabolitos podem ser detectados simultaneamente. Aqui, um método desenvolvido especificamente para a realização de experimentos de metabolômica MSI não segmentados em raízes leguminosas e nódulos radiculares é apresentado o que poderia revelar insights sobre os processos biológicos que ocorrem. Ométodo aqui apresentado mostra um fluxo de trabalho típico MSI, desde a preparação da amostra para aquisição de imagem, e centra-se na etapa de aplicação da matriz, o que demonstra várias técnicas de aplicação da matriz que são úteis para a detecção de pequenas moléculas. Uma vez que as imagens são geradas MS, a análise e identificação de metabolitos de interesse é discutido e demonstrado. O fluxo de trabalho padrão apresentado aqui pode ser facilmente modificada para diferentes tipos de tecidos, espécies moleculares e instrumentação.
Introduction
O crescente campo da metabolômica tem muitas aplicações biológicas importantes, incluindo a descoberta de biomarcadores, decifrando vias metabólicas em plantas e outros sistemas biológicos, e toxicologia profiling 4,6-10. Um grande desafio técnico ao estudar sistemas biológicos é estudar caminhos metabolômica, sem perturbar-los 11. MALDI-MSI permite a análise direta de tecidos intactos que permite a detecção sensível de analitos em órgãos individuais 12,13 e até células individuais 14,15.
A preparação da amostra é um passo crucial na produção de imagens espectrais de massa reprodutíveis e confiáveis. A qualidade das imagens depende muito de fatores, tais como a incorporação de tecido médio, espessura de corte, matriz MALDI, e técnica de aplicação da matriz. Para aplicações de imagem, a espessura do corte ideal é a largura de uma célula (8-20 mM, dependendo do tipo de amostra). MALDI requer a deposição de um composto orgânico, a cristalinae composto de matriz, tipicamente um ácido fraco, por exemplo para auxiliar a ablação analito e ionização. 16 matrizes diferentes proporcionam diferentes intensidades de sinal, os iões interferentes, e eficiências de ionização de diferentes classes de compostos.
A técnica de aplicação de matriz, também desempenha um papel na qualidade das imagens de espectro de massa e de diferentes técnicas são apropriadas para diferentes classes de analitos. Três métodos de aplicação da matriz são apresentadas neste protocolo: airbrush, pulverizador automático e sublimação. Aplicação matriz spray tem sido amplamente utilizado em imagiologia de MALDI. A vantagem da aplicação de spray matriz é de que é relativamente rápido e fácil. No entanto, a qualidade da aplicação matriz spray depende em grande medida da perícia do utilizador e tende a ser menos reprodutível e causar a difusão dos analitos, especialmente as pequenas moléculas de 17. Sistemas de pulverização automáticos tem mecânica semelhante ao aerógrafo aplicação da matriz, mas have foi desenvolvido para remover a variabilidade observada com aplicação manual de spray, fazendo a pulverização mais reprodutível. Este método pode às vezes ser mais demorado do que a aplicação da matriz aerógrafo tradicional. Ambos aerógrafo manual e sistemas de pulverização automáticos são métodos de aplicação de matriz à base de solvente. A sublimação é uma técnica de aplicação de matriz seca que está a tornar-se cada vez mais popular para a imagem do espectro de massa de metabolitos e pequenas moléculas, pois reduz a difusão do analito, no entanto, falta-lhe o solvente necessária para extrair e observar os compostos de massa mais elevados 18.
Confiante identificação de metabólitos normalmente requer medições de massa precisas para obter identificações putativos seguidos de massa em tandem (MS / MS) experimentos para validação, com espectros MS / MS que estão sendo comparados com os padrões, a literatura, ou espectros teórico. Neste protocolo de alta resolução (massa potência de 60.000 a m / z de 400 a resolução), a cromatografia líquida (LC)-MS está acoplado a MALDI-MSI obter tanto informações espaciais e identificações confiantes de metabolitos endógenos, usando Medicago truncatula raízes e nódulos de raiz como o sistema biológico. Experimentos MS / MS pode ser realizada diretamente sobre o tecido com MALDI-MSI ou em extratos de tecidos com LC-MS e usado para a validação das identificações de metabólitos.
Este protocolo fornece um método simples para mapear metabolitos endógenos em M. truncatula, que pode ser adaptado e aplicado a MSI de moléculas pequenas em vários tipos de tecidos e sistemas biológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como discutido acima, a preparação da amostra é a etapa mais importante no fluxo de trabalho MSI. A incorporação do tecido de forma desigual causará o corte ser difícil ou não ser possível, em alguns casos. O tamanho da seção e tempo de equilíbrio adequado são fundamentais para a manutenção da integridade do tecido e evitando dobrar e lágrimas. Selecção da matriz e da técnica de aplicação vai desempenhar um papel importante na determinação dos tipos de analitos a serem detectados, a resolução es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer o Dr. Jean-Michel Ané no Departamento de Agronomia da UW-Madison para fornecer amostras truncatula Medicago. Este trabalho foi financiado em parte pelo financiamento da National Science Foundation (NSF) concessão CHE-0.957.784, a Graduate School da Universidade de Wisconsin ea Fundação Alumni Research Wisconsin (WARF) e programa Romnes Faculdade Bolsa de Investigação (a LL). EG reconhece um NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1256259).
Materials
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25-75-0.8 mm (width-length-thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1×10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
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