Summary
Masspektrometrisk avbildning (MSI) är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att upptäcka och identifiera olika kemiska ämnen i intakta vävnader, bevara föreningar i deras infödda miljöer, vilket kan ge nya insikter i biologiska processer. Häri en MSI-metod som utvecklats för analys av små molekyler beskrivs.
Abstract
De flesta tekniker som används för att studera små molekyler, såsom läkemedel eller endogena metaboliter, anställa vävnadsextrakt som kräver homogenisering av vävnaden av intresse som skulle kunna leda till förändringar i metaboliska vägar som studeras 1. Masspektrometrisk avbildning (MSI) är ett kraftfullt analysverktyg som kan ge geografisk information av analyter inom intakta skivor av biologiska vävnadsprover 1-5. Denna teknik har använts i stor utsträckning för att studera olika typer av föreningar, inklusive proteiner, peptider, lipider, och små molekyler, såsom endogena metaboliter. Med matris-assisterad laser desorption / jonisering (MALDI)-MSI, kan rumsliga fördelningar av flera metaboliter samtidigt upptäckas. Häri är en metod som utvecklats speciellt för att bedriva oriktade metabolomik MSI experiment på baljväxter rötter och rotknölar presenteras som kan avslöja insikter i biologiska processer som äger rum. Denmetod som presenteras här visar en typisk MSI arbetsflöde, från provberedning till bildtagning, och fokuserar på matrisen ansökan steg, visar flera matrisapplikationstekniker som är användbara för att upptäcka små molekyler. När MS-bilderna genereras, är analys och identifiering av metaboliter av intresse diskuteras och demonstreras. Standarden arbetsflöde som presenteras här kan lätt modifieras för olika vävnadstyper, molekylslag, och instrumentering.
Introduction
Den växande området metabolomik har många viktiga biologiska tillämpningar, inklusive biomarkörer, dechiffrera metaboliska vägar i växter och andra biologiska system, och toxikologi profilering 4,6-10. En stor teknisk utmaning när man studerar biologiska system är att studera metabolomic vägar utan att störa dem 11. MALDI-MSI möjliggör direkt analys av intakta vävnader som möjliggör känslig detektion av analyter i enskilda organ 12,13 och till och med enstaka celler 14,15.
Provberedning är ett viktigt steg i att producera reproducerbara och pålitliga masspektraldata bilder. Kvaliteten på bilderna beror mycket på faktorer såsom vävnad inbäddningsmedium, skivtjocklek, MALDI matris och matris appliceringsteknik. För bildprogram, är idealisk snittjocklek bredden på en cell (8-20 nm beroende på provet). MALDI kräver avsättning av ett organiskt, crystalline matrisförening, typiskt en svag syra, på provet för att bistå analyt ablation och jonisering. 16 Olika matriser ger olika signalintensiteterna, interfererande joner och jonisering effektiviteter av olika klasser av föreningar.
Matrisen appliceringstekniken spelar också en roll för kvaliteten av masspektrala bilder och olika tekniker är lämpliga för olika klasser av analyter. Tre matris appliceringsmetoder presenteras i detta protokoll: airbrush, automatisk spruta, och sublimering. Airbrush matrix ansökan har använts i stor utsträckning i MALDI imaging. Fördelen med airbrush matris tillämpning är att det är relativt snabbt och enkelt. Men kvaliteten på airbrush matris programmet beror mycket på skickligheten hos användaren och tenderar att vara mindre reproducerbar och orsaka spridning av analyter, särskilt små molekyler 17. Automatiska sprutsystem har liknande mekanik att airbrush matrix ansökan, men HAVe utvecklats för att avlägsna variabiliteten sett med manuell airbrush ansökan, vilket gör sprayen mer reproducerbar. Denna metod kan ibland vara mer tidskrävande än traditionella airbrush matrix ansökan. Både manuell airbrush och automatiska sprutsystem är lösningsmedelsbaserade matrisappliceringsmetoder. Sublimering är en torr matris appliceringsteknik som blir mer och mer populärt för masspektral avbildning av metaboliter och små molekyler, eftersom det minskar analyt diffusion, men saknar det lösningsmedel behövs för att extrahera och observera högre mass föreningar 18.
Säker identifiering av metaboliter kräver vanligtvis noggranna mätningar mass att få förmodade identifieringar följt av tandem mass (MS / MS) experiment för validering, med MS / MS spektra jämförs med standarder, litteratur, eller teoretiska spektra. I detta protokoll hög upplösning (massa upplösningsförmåga av 60000 vid m / z 400) och vätskekromatografi (LC)-MS kopplas till MALDI-MSI att få både geografisk information och säker identifiering av endogena metaboliter, med hjälp av Medicago truncatula rötter och rotknölar som det biologiska systemet. MS / MS-experiment kan utföras direkt på vävnaden med MALDI-MSI eller på vävnadsextrakt med LC-MS och används för validering av metabolit identifieringar.
Protokollet ger en enkel metod för att kart endogena metaboliter i M. truncatula, som kan anpassas och tillämpas på MSI av små molekyler i olika vävnadstyper och biologiska system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Instrumentering
- MALDI-TOF/TOF MSI. Använd en masspektrometer utrustad med en MALDI källa för analys av små molekyler (se tabell av material / utrustning). Genomför förvärv i positiv eller negativ jon-läge beroende på analyter av intresse. Ange ett massområde av intresse och samla 500 laserskott / plats på 50 ìm mellanrum i både x-och y-mått över ytan av provet för att generera jon bilder. Den rasterbredden och antalet laserskott kan justeras för att erhålla respektive högre rumslig upplösning och maximal signalintensitet. Använd DHB matristoppar eller interna standarder som tillämpas på den eller direkt till vävnaden att kalibrera masspektra.
- Hög upplösning LC-MS. (Se tabell av material / utrustning) Kör provextrakt med LC-MS med hjälp av antingen omvänd fas (RP) LC med en C-18 kolonn, eller normal fas (NP) med ett HILIC kolumn beroende på analyter av intresse. Använd mobila faser ochgradienter som lämpliga för den specifika provtyp. Genomför förvärv i positiva eller negativa jon lägen beroende på provet.
2. Vävnadsberedning
- Trim roten knöl från växten och lämnade 3-4 mm från rot bifogas knutan.
- Omedelbart efter dissektion Använd pincett för att placera vävnaden i en kryostat kopp och täck med gelatin (100 mg / ml i avjoniserat vatten). Det är väsentligt för den vävnad som skall fastnat på botten av koppen utan några luftbubblor.
- Flash frysa vävnaden genom att placera koppen i ett torris / etanol-bad tills gelatinet stelnar och blir opak. Förvara proverna vid -80 ° C tills användning.
- Ta prov från -80 ° C frys, skära bort plasten kryostat cup och trimma bort överflödigt gelatin. Montera den inbäddade vävnaden till kryostat chucken med en dime-stora mängd optimal skärtemperatur (oktober) media, utan att låta oktober röra vävnaden. Placera i kryostatrutan tills oktober stelnar.
- Låt chuck och gelatin till jämvikt i kryostat rutan (inställd på -20 eller -25 ° C) i ca 15 min.
- Använd kryostaten (se tabell av material / utrustning) till vävnadssnittet ungefär tjockleken hos en cell (8-20 ^ m beroende på typen vävnad) och tina montera varje skiva på ITO-belagt glas genom att värma upp (icke-ITO belagd sida) av en ITO-belagd glasskiva på baksidan av din hand. Placera ITO-belagda sidan av värmde glida nära den frusna vävnaden skiva och låta skivan att fastna på bild. Placering avsnitten nära varandra på bilden kommer att ge bättre anpassning under MSI.
3. Matrix Application
- Airbrush Tillämpning av MALDI Matrix
- Alla airbrush förfaranden ska utföras i ett dragskåp.
- Rengör airbrush lösningsbehållare och munstycke (se tabell av material / utrustning) med metanol ochfylla lösningsbehållaren med DHB matrislösning (150 mg / ml i 50% methanol/0.1% TFA volym / volym).
- Håll airbrush ca 35 cm från provet och tillämpa 10-15 lager av matris på ytan av bilden med en löptid på 10 sek spray och 30 sek torktid mellan varje skikt.
- Rengör airbrush igen med metanol när du är klar för att undvika igensättning av matrislösningen.
- Automatisk Spruta Tillämpning av MALDI Matrix
- Följ start instruktionerna från tillverkaren av den automatiska sprutsystemet.
- För MSI av metaboliter i rotknölar med hjälp av 40 mg / ml (i 50% methanol/0.1% TFA v / v) DHB som matrisen, ställ in temperaturen till ~ 80 ° C, hastighet till 1,250 mm / min, flödeshastighet till 50 l / min, och antalet överfarter till 24. För bästa täckning, är det rekommenderat att rotera munstycket 90 ° och / eller förskjutning av munstycket 1,5 mm mellan varje passering. Starta sprutan metod.
Som en side notera, den speciella sprutsystemet som används här uppvärmer munstycket för snabbare avdunstning av lösningsmedlet. Som lösningsmedel avdunstar, ökar snabbt koncentrationen i matrisen. Matrisen tillämpas på stickprovet med airbrush och den automatiska sprutan har jämförbara koncentrationer. - Följ avstängnings instruktionerna från tillverkaren av den automatiska sprutsystemet.
- Sublime Tillämpning av MALDI Matrix
- Väg upp 300 mg DHB i botten av sublimeringskammaren (se tabell av material / utrustning).
- Stick glasskiva till det kalla fingret (övre delen av sublimeringskammaren) med vävnadssnitt nedåt med dubbelsidig, ledande tejp. Täck över hela baksidan av objektglaset med den dubbelsidiga tejpen för jämn konduktivitet, producerar även matrisavsättning.
- Kläm fast de övre och nedre halvorna av sublimeringskammaren tillsammans med C-klämman. Anslut vakuum och add is och kallt vatten till den övre reservoaren.
- Placera sublimekammaren i en värmemantel, som är vid rumstemperatur.
- Slå på vakuumpumpen. Vänta 15 minuter och slå på värmemanteln. Värmemanteln bör nå 120 ° C under loppet av 10 min.
- Efter 10 minuter, stäng av värmen, stäng ventilen till vakuum (så insidan av kammaren förblir under vakuum) och stäng av vakuumpumpen.
- Tillåt kammaren för att komma till rumstemperatur, öppna ventilen släpper vakuumtrycket och avlägsna provet. Storleken på sublimekammaren kommer att bestämma den mängd matris sublim till objektglaset. De större sublimeringskammare (storleken på en 400 ml bägare) kommer att använda ca 300 mg DHB medan de mindre kamrarna (storleken på en 150 ml bägare) kommer att använda ca 100 mg av DHB och kommer att kräva att skära glaset bilden så att den passar i kammaren.
4. Image Acquisition
- <li> Markera ett + mönster på varje hörn av provet med en WiteOut korrigeringsvätska penna för att användas som "lär poäng". Placera glasskiva i MALDI glidadapterplatta och ta en optisk bild av provet med hjälp av en skanner.
- Sätt upp en bild förvärv fil med hjälp av programvara som tillhandahålls av instrumentföretag med en rastersteglängd på 50 m och en laserdiameter lika med eller mindre än rasterstegstorleken. På denna särskilda instrument, ger den lägsta laserinställningen en laser diameter på ca 10 nm och mindre laserinställning har en 40-50 ìm diameter.
- Ladda den optiska bilden i programmet och anpassa plattan med den optiska bilden.
- Kalibrera instrumentet innan förvärvet med hjälp av vanliga matrisklusterjoner, interna standarder, eller en kalibreringsblandning.
- Ange områdena vävnad som skall analyseras med MSI, däribland en plats av ren matris på bilden för att användas som en "blank".
- Begin acförvärvet.
5. Bild Generation
- Öppna bildfilen i kommersiellt tillgänglig programvara som säljaren och extrahera jon bilderna. Annan öppen källkod är tillgänglig för MSI databehandling 19.
6. Metabolit Identifiering
- Välj en specifik m / z av intresse från massspektrum med hjälp av leverantörsspecifika program (se tabell av material / utrustning). En analyt kan urskiljas från en matrisjoner vid en analyttoppen är vald från masspektrum och jon-bilder genereras specifikt lokaliserad till vävnadssnittet.
- Generera en lista över analyter av intresse och utför MS / MS-experiment. Se tabell 1 och 2 i Representativa resultat för provlistor analyter.
- Genomför riktad LC-MS-analys på en högupplöst masspektrometer (eller hög upplösning MALDI-MS om tillgängligt) för att få korrektmass mätningar av analyter av intresse och även utföra LC-MS/MS för målanalyter att få karaktäristiska fragmenteringsmönster.
- Utför databas söka bestämma förmodade identiteter för riktade analyter. Exempel på metabolit-databaser är: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG och HMDB.
- För att bekräfta de förmodade identifikationer från noggrann massdatabassökning, matchar MS / MS från de riktade analyter till MS / MS spektra av standarder, litteratur, och / eller fragmentering förutsägelse programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En experimentell översikt av MSI är visad i fig. 1. Alldeles i början av experimentet, är provberedning ett kritiskt steg. Knölar trimmas från anläggningen rot och inbäddade i gelatin. Vävnaden måste tryckas platt mot kryostat koppen, utan bubblor, medan den frysas, vilket kommer att garantera enklare och korrekt inriktning av vävnaden medan den sektioneras. När vävnaden som skivas, är det viktigt att skära vävnaden vid korrekt tjocklek; alltför tunna sektioner kommer att riva, förstör vävnaden integritet, medan alltför tjock av sektioner kommer att minska det antal analyter som har extraherats och som detekteras från vävnaden. Val av matris-och appliceringsteknik kommer att avgöra vilka typer av analyter upptäckts. Med en kombination av matriser kan ge kompletterande resultat. Tre matris applikationstekniker presenteras i detta arbete. Den airbrush teknik är snabb, men vanligtvis inte lämplig för MSI av små molekyler varaorsaken till analyten diffusion. Automatiska sprutsystem och sublimering ger mindre matriskristaller, bättre reproducerbarhet och mindre analyt diffusion. Figur 2 visar en optisk bild av en Medicago truncatula rot knöl avsnittet. Figur 3 visar en optisk bild exempel på matris täckning och kristallstorlekar som använder airbrush, automatisk spruta, och sublimering respektive.
Konventionella matriser, såsom DHB, producerar många joner i den lägre massområde (m / z 100-400) 20. Dessa matrisjoner kan störa detekteringen av metaboliter i detta intervall. Figur 4 visar MS-spektra av just DHB matris jämfört med root knöl vävnad belagd med DHB matris. DHB matris toppar anges i rött och rot knöl vävnad täckt med DHB visas i blått. Novel matriser såsom TiO 2 nanopartiklar 21, 1,5-diaminonaftalen (DAN) 22, 2,3,4,5-tetrakis (3 ', 4'-dihydroxylphenyl) tiofen (DHPT) 23, och 1,8-bis (dimetyl-amino) naftalen (DMAN) 24,25 har rapporterats att minska störningen av matrisjoner i det låga massområdet, och även förbättra upptäckten av vissa klasser av metaboliter 5. Matris toppar kan skiljas från riktiga metaboliter använder MS-bilder. När en topp klickas på, är den jon bilden heras och visas överlappar den optiska bilden. De toppar som genererar bilder med tydlig lokalisering till vävnaden, och inte finns i matrisen enda område avbildas, anses metaboliter. Figur 5a visar flera representativa jon bilder av metaboliter som finns i roten knöl vävnad, medan figur 5b visar exempel på MS-bilder motsvarande matris relaterade toppar. I figur 5a bilden visar distinkt lokalisering till roten knöl vävnad och en brist på signal i matrisen enda område som avbildades. I fig 5b M. truncatula rot knöl vävnad anges i tabell 1 (positivt tillstånd) och tabell 2 (negativt läge) 4.
Slutmålet för oriktade metabolomik experiment är att identifiera de föreningar som upptäcktes. När du utför MSI på ett medium upplösning instrument (MRMS), såsom en TOF / TOF, är det nödvändigt att få exakta mätningar av mass på ett annat sätt. Detta kan göras med en mångfacetterad MS synsätt där MALDI-MSI resultat jämförs med högupplösta LC-MS-data med hjälp av vävnadsextrakt. Det finns många möjliga vävnads utvinning protokoll att välja mellan beroende på analyterna av intresse. Högupplösande MS (HRMS) kan utföras i den positiva eller negativa jonisering modes och med normal eller omvänd fas LC beroende på de analyter av intresse. När en korrekt massa erhålles med hög upplösning LC-MS, kan den resulterande massan sökas med flera databaser, som anges tidigare, för att erhålla en förmodad identifiering. Nästa MS / MS-data samlas in och den karaktäristiska fragmenteringsmönster av analyten av intresse kan jämföras med normer, litteratur spektra, eller teoretiska fragmenteringsmönster. Figur 6 visar ett exempel på en av de metaboliter som detekteras med MSI-och LC-MS. Denna metabolit identifierades som heme baserat på MS / MS-spektrum uppsamlades med hög upplösning LC-MS. Denna MS / MS-data jämfört med MS / MS-spektra som tidigare publicerats av Shimma och Setou 26. De två MS / MS spektra match, därför identiteten på m / z 616,2 var tryggt delad som heme baserad på den exakta massan söka databas och MS / MS-data jämfört med litteratur MS / MS-data.
Figur 1. Översikt över MSI arbetsflöde. Root knutor trimmas från anläggningen, inbäddade i gelatin, sektion med kryostatens och monteras på en ITO-belagd glasskiva. Matrix appliceras på bilden med hjälp av en av tre matris applikationstekniker. MSI förvärvet sker med en MALDI-TOF/TOF masspektrometer och MS-spektra är kompilerade in bilder med MSI programvara.
Figur 2. Vävnadsprov optisk bild. Representant optisk bild av en Medicago truncatula rot knöl avsnitt vävnad.
Figur 3. Exempel matris nedfall. Representativa bilder som visar de olika konsistenser av matrix nedfall med a) airbrush, b) automatisk spruta, och c) sublimeringsteknik. Den airbrush appliceringsmetod genererar stora och små kristaller medan den automatiska spruta metoden ger mindre jämnt stora kristaller. Sublime ger en jämnt lager av matris. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. MS-spektrum av PLAi DHB matrix vs rot knöl vävnad täckt med DHB. har DHB matris toppar anges i rött och rot knöl vävnad täckt med DHB visas i blått. Matris toppar kan skiljas från riktiga metaboliter använder MS-bilder. När en topp klickas på, är den jon bilden heras och visas överlappar den optiska bilden. De toppar som genererar bilder med tydlig lokalisering till vävnaden, och är inte närvarande i matrisen enda område avbildas, anses metaboliter. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. MS bilder av M. truncatula rotknölar. a) Representativa jon bilder av metaboliter found i vildtyp M. truncatula rotknölar. b) Representativa jon bilder av matris arter som inte skulle anses metaboliter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Exempel MS / MS-data för metabolit identifiering. MS / MS-spektrum av m / z 616,2, identifierad som heme [M +]. Den kemiska strukturen visas och fragmenterings strukturer är tilldelade. Den experimentella ms / ms-data jämförs med MS / MS-spektrum av heme rapporterats i litteraturen av Shimma och Setou 26.
Tabell 1. Målanalyter -. Positiv läge Exempel lista med analYtes av intresse från M. truncatula rot knöl vävnad i positiv jon-läge 4.
| Namn på metabolit | Teoretisk [M + H] ^ | MRMS Uppmätta [M + H] ^ | HRMS Uppmätta [M + H] ^ | Öm (MDA) |
| γ-aminosmörsyra a | 104.0706 | 104,1 | 104.0706 | 0 |
| kolin a, * | 104.1070 > | 104,1 | 104.1071 | 0,01 |
| prolin | 116.0706 | 116,07 | 116.0706 | 0 |
| valin | 118.0863 | 118,09 | 118.0865 | 0,02 |
| leucin en | 132.1019 | 132,1 | 132.1022 | 0,03 |
| asparagin en | h: 79px; "> 133,0608133,06 | 133.0602 | -0,06 | |
| adenin en | 136.0618 | 136,07 | NA | NA |
| proling betain en | 144.1019 | 144,1 | 144.1024 | 0,05 |
| glutamin en | 147.0764 | 147,09 | 147.0768 | 0,04 |
| 156.0768 | 156,06 | 156.0771 | 0,03 | |
| arginin en | 175.1190 | 175,13 | 175.1167 | -0,23 |
| sackaros + K | 381.0794 | 381,05 | 381.0791 | -0,03 |
| heme a, * | 616.1768 | 616,15 | NA | NA |
| ht = "25" style = "height: 26px; width: 173px;"> NAD a | 664.1164 | 664,1 | NA | NA |
| formononetin en | 269.0808 | 269,08 | 269.0803 | 0,05 |
| chrysoseriol GlcA en | 477.1028 | 477,1 | 477.1008 | 0,2 |
| formononetin MalGlc en | 517.1341 | 517,13 | 517.1337 | idth: 64px; "> 0.04|
| aformosin MalGlc en | 547.1446 | 547,16 | 547.1427 | 0,19 |
* [M +]
en MS / MS utfördes för identifiering.
Tabell 2. Analyter sevärdheter - negativ läge urval lista av analyter av intresse från M.. truncatula rot knöl vävnad i negativ jon-läge 4.
| Namn på metabolit | Teoretisk [MH] - | MRMS Uppmätta [MH] - < / Sup> | HRMS Uppmätt [MH] - | Öm (MDA) |
| pyrodruvsyra | 87,0077 | 87 | NA | NA |
| alanin en | 88,0393 | 88,01 | 88,0374 | -0,19 |
| mjölksyra a | 89,0233 | 89,01 | 89,0296 | 0,63 |
| fosforsyra | 96,9685 | 96,96 | 96,9625 | -0,6 |
| 2-ketosmörsyra | 101.0233 | 101,02 | 101.0191 | -0,42 |
| 102,055 | 102,04 | 102.0528 | -0,22 | |
| serin | 104.0342 | 104,02 | 104.0228 | -1,14 |
| maleinsyra / fumarsyra a | 115.0026 | 115,03 | 115 | -0,26 |
| bärnstenssyra en | 117.0182 | 117,01 | 117.0125 | -0,57 |
| treonin | 118.0499 | 118,04 | 118.0456 | -0,43 |
| oxalättiksyra | 130.9975 | 131,03 | 130,991 | -0,65 |
| asparaginsyra a | 132.0291 | 132,03 | 132.0256 | -0,35 |
| äppelsyra en | 133.0132 | 133,02 | 133.0221 | 0,89 |
| salicylsyra | 137.0233 | 137,02 | 137.0349 | 1,16 |
| α-ketoglutarsyra | 145.0132 | 145,02 | 145.0063 | -0,69 |
| glutaminsyra a | 146.0448 | 146,01 | 146.0408 | -0,4 |
| pentos | 149.0445 | 149,04 | 149.0414 | -0,31 | </ Tr>
| akonitinsyra a | 173.0081 | 173,03 | 173.0057 | -0,24 |
| askorbinsyra a | 175.0237 | 175,05 | 175.0341 | 1,04 |
| hexos | 179,055 | 179,05 | 179.0484 | -0,66 |
| citronsyra / isocitronsyra a | 191.0186 | 191,02 | 191.0166 | -0,2 |
| palmitinsyra | 255.2319 | 255,22 | 255.2246 | -0,73 |
| hexos-6-fosfat-a | 259.0213 | 259,04 | 259,014 | -0,73 |
| stearinsyra | 283.2632 | 283,26 | 283.2552 | -0,8 |
| sackaros en | 341.1078 | 341,07 | 341.0972 | -1,06 |
en MS / MS utfördes för identifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som diskuterats ovan, är provberedning det mest kritiska steget i MSI-arbetsflödet. Inbäddning vävnaden ojämnt orsakar sektione vara svåra eller inte möjliga i vissa fall. Den sektionsstorlek och lämplig jämviktstiden är avgörande för att bibehålla vävnadsintegritet och för att undvika veckning och tårar. Val av matris och appliceringsteknik kommer att spela en roll för att bestämma vilka typer av analyter som skall detekteras, den rumsliga upplösningen, och reproducerbarheten av resultaten. Med en kombination av matriser eller applikationstekniker kan ge kompletterande resultat.
Denna metod har utvecklats speciellt för oriktade MSI av endogena metaboliter i M. truncatula rot knöl vävnad, men kan lätt anpassas till andra vävnadstyper och biologiska frågor. De rekommenderade matris appliceringsmetoder för liten molekyl MSI är sublimering och automatisk spruta. Ökning av mängden av lösningsmedlet avsätts på tissue, genom att justera den automatiska sprutan metod kommer att öka extraktionen av analyter och möjliggör detektering av högre massa föreningar bör man välja att utföra MSI av lipider, peptider, etc. Vid användning av andra typer av vävnad, kommer den viktigaste justeringen vara snittjocklek. Idealt vävnaden bör skivas med tjockleken hos en cell, och därför tjockare sektioner kanske lämpligt för växtvävnad och tunnare sektioner lämpliga för djurvävnad. Om vikning eller riva inträffar vanligtvis behövs en längre jämviktstid innan snittning eller en tjockare sektionsstorlek kan vara nödvändig. När man utför LC-MS för att få exakta massorna, vävnaden utvinning protokollet, mobil fas lösningsmedel och lutning, kolumn stationär fas, och MS jonisering läge kan justeras och optimeras för de analyter av intresse.
Den största fördelen med MALDI-MSI är dess förmåga att ge inte bara massa information, men även geografisk information för ett visst provutan behov av tidigare kunskap om de målanalyter. Andra avbildningstekniker kräver användning av derivatiseringar eller taggar 5. Såsom diskuterats tidigare, är en begränsning av denna teknik överflödet av interfererande matris jon toppar. Nya matriser har rapporterats att ta itu med denna begränsning. Alternativt är sekundär jon masspektrometri (SIMS)-MSI en matrisfritt imaging alternativ, men det har mindre känslighet än MALDI-MSI 3. En annan begränsning hos denna teknik är den lägre massupplösning av MALDI-TOF/TOF instrument. På grund av den låga massan upplösningsförmåga, är det nödvändigt att också utföra högupplösande MS för att erhålla de korrekta massorna för metabolit identifiering, vilket innebär fler experiment och mer tid. Detta problem skulle kunna lösas genom att utföra MALDI-MSI på en högupplöst instrumentplattform såsom MALDI-Orbitrap. Den sista begränsningen att utföra MSI experiment är bristen på programvaruverktyg för analys av MSI uppgifter, altHough några senaste framstegen inom MSI programvara har gjorts 27,28. Typiskt MS spektrum för varje avbildning regionen måste manuellt analyseras och jon bilder utvinns för hand. MSI experiment producerar ett överflöd av data och kan vara oerhört tidskrävande att analysera. Sammantaget MALDI-MSI erbjuder unika fördelar för att få geografisk information av många föreningar samtidigt i ett enda experiment som kan vara till stor nytta för den oriktade analys av små molekyler och andra föreningar med många biologiska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för Dr Jean-Michel Ané vid institutionen för agronomi vid UW-Madison för att ge Medicago truncatula prover. Detta arbete stöddes delvis av medel från National Science Foundation (NSF) bevilja CHE-0.957.784, University of Wisconsin Graduate School och Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) och Romnes Faculty Research Fellowship-programmet (till LL). EG erkänner en NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1.256.259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
- Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, 130-145 (2013).
- Ye, H., Gemperline, E., Li, L. A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics. Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).
- Wei, R. Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry. Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).
- Kobayashi, T., et al. A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer. Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).
- West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics. Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).
- Spegel, P., et al. Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release. Biochem. J. 450, 595-605 (2013).
- Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics. J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).
- Prell, J., Poole, P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).
- Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation. Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).
- Stemmler, E. A., et al. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).
- Neupert, S., Predel, R. Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect. Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).
- Northen, T. R., et al. Clathrate nanostructures for mass spectrometry. Nature. 449, (2007).
- Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Chen, S., et al. 2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).
- Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
- Shroff, R., Svatos, A. Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).
- Shimma, S., Setou, M. Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).
- Paschke, C., et al. Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).
- Parry, R. M., et al. omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).
