Kitle spektometrik görüntüleme (MSI), biyolojik süreçler içine yeni anlayışlar sağlayabilir kendi doğal ortamlarında bileşikleri koruyarak, sağlam dokularda çeşitli kimyasal türler keşfetmek ve tanımlamak için kullanılan güçlü bir araçtır. Burada küçük moleküllerin analizi için geliştirilmiş bir MSI yöntem tarif edilmektedir.
, Bu tür ilaçlar ya da endojen metabolit olarak küçük moleküller, çalışma potansiyel olarak 1 çalışılmaktadır metabolik yollar değişikliklere neden olabilir, ilgi konusu doku homojenizasyon gerektiren doku özleri istihdam için kullanılan çoğu teknikleri. Kitle spektometrik görüntüleme (MSI) biyolojik doku örneklerinin 1-5 bozulmamış dilimleri içinde Analitlerin mekansal bilgi verebilir güçlü bir analitik araçtır. Bu teknik, proteinler, peptitler, lipidler ve bu endojen metabolitler gibi küçük moleküller de dahil olmak üzere bileşiklerin çeşitli incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI)-MSI ile, birden fazla metabolit uzaysal dağılımı, aynı anda tespit edilebilir. Burada, baklagil kök ve kök üzerindeki nodüllerde hedefsiz metabolomiks MSI deneyler için özel olarak geliştirilmiş bir yöntem gerçekleşen biyolojik süreçlerin içine anlayışlar ortaya koyabilir sunulmuştur.yöntem Burada sunulan numune hazırlama görüntü edinimi, tipik bir MSI iş akışını gösterir ve küçük molekülleri tespit için yararlı birçok matris uygulama tekniklerini gösteren, matris uygulama adım üzerinde duruluyor. MS görsel üretildikten sonra, ilgi konusu metabolitlerin analizi ve tanımlanması tartışılan ve gösterilmiştir. Burada sunulan standart iş akışı kolayca farklı doku tiplerinin moleküler türler ve enstrümantasyon için modifiye edilebilir.
Metabolitler ve büyüyen alan biyobelirtecin keşif, bitki ve diğer biyolojik sistemlerde metabolik yolları deşifre ve toksikoloji profil 4,6-10 dahil olmak üzere birçok önemli biyolojik uygulamalar vardır. Biyolojik sistemleri inceleyerek önemli teknik zorluk onlara 11 aksatmadan metabolomic yolları incelemektir. MALDI-MSI tek organlar 12,13 ve hatta tek hücre 14,15 analitlerin hassas algılama sağlar dokulara doğrudan analizi sağlar.
Örnek hazırlama, güvenilir ve tekrarlanabilir kütle spektral görüntüler üretiminde çok önemli bir adımdır. Görüntülerin kalitesi büyük ölçüde, doku gömme ortamı, dilim kalınlığı, MALDI matris ve matris uygulama tekniği gibi faktörlere bağlıdır. Görüntüleme uygulamaları için ideal bir kesit kalınlığı bir hücre (numune tipine bağlı olarak 8-20 um) genişliğidir. MALDI bir organik, kristalinin birikimi gerektirene matris bileşimi, analit ablasyon ve iyonizasyon yardımcı olmak için numune üzerine tipik olarak bir zayıf asit,. 16 farklı matrisler farklı sinyal yoğunlukları, müdahale iyonları ve bileşikleri farklı sınıflarının iyonizasyon verimliliği sağlar.
Matris aynı zamanda uygulama tekniği kütle spektrum görüntü ve farklı teknikler kalitesinde bir rol analitlerin farklı sınıflar için uygun oynar. Üç matris uygulama yöntemleri bu protokolü sunulmuştur: Pistole, otomatik püskürtücü, ve yüceltme. Airbrush matris uygulaması yaygın MALDI görüntülemede kullanılmıştır. Airbrush matris uygulamanın avantajı, nispeten hızlı ve kolay olmasıdır. Bununla birlikte, matris airbrush uygulamanın kalitesi büyük ölçüde kullanıcının beceri bağlıdır ve daha az tekrarlanabilir ve analitlerin difüzyon, özellikle de küçük moleküller 17 neden olma eğilimindedir. Otomatik püskürtücü sistemler ve matris uygulama airbrush benzer mekaniği var, ama have püskürtme daha tekrarlanabilir hale manuel pistole uygulamasıyla görülen farklılığı yok etmek için geliştirilmiştir. Bu yöntem bazen daha fazla zaman tüketen geleneksel airbrush matris uygulaması daha olabilir. Manuel airbrush ve otomatik püskürtücü sistemleri hem de solvent bazlı matris uygulaması yöntemlerdir. Ancak, özü ve yüksek kütle bileşikleri 18 gözlemlemek için çözücü gerekli yoksun; Sublime bu analit yayılmasını azaltır çünkü metabolitleri ve küçük moleküllerin kütle spektrum görüntüleme için daha popüler hale geliyor, kuru bir matris uygulaması tekniğidir.
Metabolitleri Emin kimlik genellikle tandem kütle MS / MS spektrumları standartları, edebiyat, veya teorik spektrumları karşılaştırılır ile doğrulama için (MS / MS) deneyleri, ardından varsayılan kimlik elde etmek için doğru bir kitle ölçümler gerektirir. Bu protokol, yüksek çözünürlükte (kütle m / z 400 at 60.000 çözme gücü), sıvı kromatografisi (LC)-MS Medicago biyolojik sistem olarak kökler ve kök nodüller truncatula kullanarak uzamsal bilgiler ve endojen metabolitlerin emin kimlik elde etmek üzere her ikisi de MALDI-MSI kuple edilir. MS / MS deneyler MALDI-MSI veya LC-MS ile doku özleri ile ilgili doku üzerine direkt olarak gerçekleştirilen ve metabolit özdeşimlerin doğrulama için kullanılabilir.
Bu protokol, M. endojen metabolitleri eşlemek için basit bir yöntem sağlar uyarlanmış ve çeşitli doku tipleri ve biyolojik sistemlerde küçük moleküllerin MSI uygulanabilir truncatula.
Yukarıda tartışıldığı gibi, örnek hazırlama MSI akışı en kritik adımdır. Dengesiz doku gömme bazı durumlarda olası zor ya da olmamak Kesit neden olacaktır. Kesit boyutu ve yeterli dengeleme zamanı doku bütünlüğünün korunması ve katlama ve gözyaşları kaçınarak için çok önemlidir. Matris ve uygulama tekniği seçimi tespit edilecek analitlerin türlerini belirlenmesinde rol, uzamsal çözünürlük ve sonuçların tekrar elde edilebilirliğini oynayacaktır. Matrisler veya uygulama teknik…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Medicago truncatula örnekleri sağlamak için UW-Madison Tarla Bitkileri Bölümü'nde Dr Jean-Michel Ane kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (NSF) fon tarafından kısmen desteklenen hibe CHE-0957784, Wisconsin Üniversitesi Enstitüsü ve Wisconsin Mezunlar Araştırma Vakfı (warf) ve Romnes Fakültesi Araştırma Bursu programı (LL). EG, bir NSF Lisansüstü Araştırma Bursu (DGE-1256259) kabul eder.
Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25-75-0.8 mm (width-length-thickness) |
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1×10-4 Torr |
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |