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Biology

Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial

Published: September 6, 2014 doi: 10.3791/51682
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 2, 1
1Division of Cardiothoracic Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Boston Children's Hospital and Department of Anesthesia, Harvard Medical School

ERRATUM NOTICE

Summary

Un método para el rápido aislamiento de las mitocondrias a partir de biopsias de tejido de mamíferos se describe. Preparaciones de hígado de rata o de músculo esquelético se homogeneizaron con un disociador tejido comercial y mitocondrias se aislaron por filtración a través de filtros diferencial de malla de nylon. Tiempo de aislamiento mitocondrial es <30 min frente a 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.

Abstract

Métodos de aislamiento mitocondriales descritos previamente utilizando centrifugación diferencial y / o centrifugación en gradiente de Ficoll requieren de 60 a 100 minutos para completar. Se describe un método para el rápido aislamiento de las mitocondrias a partir de biopsias de mamíferos usando un disociador tejido comercial y filtración diferencial. En este protocolo, homogeneización manual se reemplaza con ciclo de homogeneización estandarizada del disociador tejido. Esto permite uniforme y homogeneización coherente de tejido que no se logra fácilmente con homogeneización manual. Después de la disociación del tejido, el homogeneizado se filtró a través de filtros de malla de nylon, que eliminan etapas de centrifugación repetitivas. Como resultado, el aislamiento mitocondrial se puede realizar en menos de 30 min. Este protocolo de aislamiento rinde aproximadamente 2 x 10 10 mitocondrias competentes viables y respiración de 0,18 ± 0,04 g (peso húmedo) muestra de tejido.

Introduction

Las mitocondrias existen en todas las células del cuerpo excepto las células rojas de la sangre y están involucrados en un gran número de importantes procesos celulares y metabólicos 1-4. Debido a estas muchas funciones, el daño mitocondrial puede tener efectos perjudiciales 3. Con el fin de investigar la función mitocondrial y la disfunción mitocondrial varios métodos de aislamiento se han descrito. Las cuentas publicadas tempranas de fecha aislamiento mitocondrial a la década de 1940 5-8. El primer intento documentado demostró aislamiento mitocondrial moliendo el tejido hepático en un mortero, seguido de centrifugación en una solución salina a baja velocidad 5,8. Más tarde, otros grupos expandido en el procedimiento original y demostraron fraccionamiento tejido basado en centrifugación diferencial 6-8. Estos primeros métodos fueron la base de las técnicas actuales que a menudo incorporan homogeneización y / o centrifugación diferencial 9-15. El número de homogenizatien pasos de centrifugación y varía entre los protocolos. Estos pasos repetitivos aumentan el tiempo para el aislamiento mitocondrial y en última instancia reducen la viabilidad. Además, la homogeneización manual puede causar daños e inconsistentes resultados mitocondriales si no están adecuadamente controlados 10,16.

Recientemente, hemos utilizado la homogeneización y centrifugación diferencial para aislar las mitocondrias para el trasplante en el tejido miocárdico 17,18. Este largo procedimiento de aislamiento requiere aproximadamente 90 min y la aplicabilidad clínica de este método era, por tanto, limitada. Para permitir el uso terapéutico aguda en el tratamiento clínico y quirúrgico se ha desarrollado un procedimiento de aislamiento mitocondrial rápida que se puede realizar en menos de 30 min.

Las principales ventajas de este protocolo son que la disociación del tejido normalizada permite uniforme y coherente homogeneización de tejido que no se logra fácilmente con homogeneización manual. En addition, el uso de filtración diferencial en lugar de la centrifugación diferencial elimina mucho tiempo y etapas de centrifugación repetitivos lo que permite más rápido aislamiento de las mitocondrias competentes altamente purificadas, viables y respiración.

La capacidad de aislar las mitocondrias competentes viables y respiración en menos de 30 min permite la aplicabilidad clínica. Este protocolo de aislamiento tiene potencial para su uso en la cirugía de revascularización coronaria (CABG) y otros procedimientos terapéuticos.

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Protocol

Preparación

  1. Preparar 1 M K-HEPES Stock Solution (ajustar el pH a 7,2 con KOH).
  2. Preparar 0,5 M K-EGTA Stock Solution (ajustar el pH a 8,0 con KOH).
  3. Preparar 1 M KH 2 PO 4 Stock Solution.
  4. Preparar 1 M de MgCl2 Stock Solution.
  5. Preparar tampón de homogeneización (pH 7,2) de sacarosa 300 mM, 10 mM K-HEPES, y 1 mM de K-EGTA. Almacenar a 4 ° C.
  6. Preparar sacarosa 250 mM Respiración Buffer, 2 mM KH 2 PO 4, 10 mM MgCl2, 20 mM K-HEPES buffer (pH 7.2) y 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Almacenar a 4 ° C.
  7. Preparar 10x PBS Solución Stock disolviendo 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, y 2,4 g de KH 2 PO 4 en 1 L de doble H 2 O destilada (pH 7,4).
  8. Preparar PBS 1x pipeteando 100 ml 10x PBS en 1 l doble H2O destilada
  9. Preparar Subtilisina A Stock pesando 4 mg de Subtilisina A ena un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Almacenar a -20 ° C hasta su uso.
  10. Preparar BSA Stock pesando 20 mg de BSA en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Almacenar a -20 ° C hasta su uso.

Aislamiento mitocondrial (Figura 1)

  1. Inmediatamente antes del aislamiento, disolver Subtilisina A en 1 ml de tampón de homogeneización.
  2. Inmediatamente antes del aislamiento, BSA disolver en 1 ml de tampón de homogeneización.
  3. Recoger dos muestras de tejido fresco usando un punzón 6 mm muestra de biopsia y almacenar en 1x PBS en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml en hielo.
  4. La transferencia de los dos punzones 6 mm de tejido a un tubo de disociación C que contiene 5 ml de tampón de homogeneización enfriado con hielo.
  5. Homogeneizar el tejido mediante el ajuste del tubo de disociación C en el disociador de tejido y seleccionar el ciclo de aislamiento mitocondrial pre-establecido (60 seg homogeneización).
  6. Retire el tubo de disociación C a un cubo de hielo.
  7. Añadir 250 l de Subtilisin una solución madre a lahomogeneizado, se mezcla por inversión y se incuba el homogeneizado en hielo durante 10 min.
  8. Coloque un filtro de malla de 40 micras en un tubo de centrífuga de 50 ml cónico en hielo y pre-mojado el filtro con tampón de homogeneización y filtrado del homogeneizado en el tubo de centrífuga de 50 ml cónico en el hielo.
  9. Añadir 250 l de solución de BSA Stock recién preparada al filtrado y mezclar por inversión.
    Nota: Omita este paso si se requiere la determinación de proteínas mitocondriales.
  10. Coloque un filtro de 40 micras en un tubo de centrífuga de 50 ml cónico en hielo y pre-mojado el filtro con tampón de homogeneización y filtrado del homogeneizado en el tubo de centrífuga de 50 ml cónico en el hielo.
  11. Coloque un filtro de 10 micras en un tubo de centrífuga de 50 ml cónico en hielo y pre-mojado el filtro con tampón de homogeneización y filtrado del homogeneizado en el tubo de centrífuga de 50 ml cónico en el hielo.
  12. Transferir el filtrado a dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml pre-refrigerados y centrifugar a 9000 xg durante 10 min a4 º C.
  13. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender y combinar pastillas en 1 ml de hielo frío Respiración Buffer.

Ensayo de ATP

Nota: Para determinar la actividad metabólica de las mitocondrias aisladas de un ensayo de luminiscencia de ATP se puede realizar usando un kit de ensayo de ATP. El protocolo, reactivos y patrones se suministra en el kit de ensayo. Un resumen del procedimiento se describe a continuación.

  1. Equilibrar reactivos del kit a temperatura ambiente.
  2. Preparar mM ATP Stock Solución 10 disolviendo pellet ATP liofilizada en 1.170 l de agua doblemente destilada. Guarde ATP estándar de solución y las muestras mitocondriales preparados en hielo.
  3. Añadir 5 ml de solución tampón de sustrato a un vial de solución de sustrato liofilizado. Mezclar suavemente y colocar en la oscuridad.
  4. Añadir 100 l de Buffer respiración a todos los pocillos de un fondo opaco negro, placa de 96 pocillos.
  5. Añadir 10 l de las mitocondrias de las muestras preparadas a cada pocillo ofa color negro, fondo opaco, placa de 96 pocillos. Nota: Las muestras se sembraron por triplicado. Incluya una fila para las normas y tres pozos para el control negativo (Respiración Buffer).
  6. Añadir 50 l de solución de lisis de células de mamífero a todos los pocillos, incluyendo los estándares y controles.
  7. Incubar la placa a 37 º C durante 5 min en un agitador orbital a 125 rpm.
  8. Durante la incubación preparar las normas de ATP en concentraciones de 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM y 0,0001 mM ATP a partir de la mM ATP Solución Stock 10. Normas Tienda en el hielo.
  9. Después de la incubación, añadir 10 l de las normas de la ATP a los pozos correspondientes como se indica en el mapa de placas. Nota: Las normas se realizaron por duplicado.
  10. Añadir 50 l de la solución de sustrato reconstituido a cada pocillo.
  11. Incubar la placa a 37 º C en el agitador orbital durante 5 min a 125 rpm.
  12. Software Gen5 1.11 Abrir en una computadora conectada con el espectrofotómetro.
  13. Bajo "Crear un nuevo elemento ", haga clic en" Experimento ".
  14. Haga clic en "protocolo predeterminado". Haga clic en "Ok".
  15. En la columna de la izquierda, seleccione "Protocolo", luego "Procedimiento".
  16. Seleccione "Delay". Se establece en 00:10:00. Haga clic en "Ok".
  17. Seleccione "Leer". Seleccione "luminiscencia" de menú desplegable. Ajuste otros ajustes para las siguientes: Lea tipo de punto final, Integración Tiempo 0: 01.00 MM: ss.ss, Filter Sets 1, Emisión Hole, Óptica Posición Top, Sensibilidad 100, Top Sonda Vertical Offset 1,00 mm.
  18. Cuando el plato está listo para ser analizado, haga clic en el icono de "Leer Plate" en la fila superior. Haga clic en "Leer". Cuando se abra el espectrofotómetro, colocar la placa en la bandeja con el pocillo A1 en la esquina superior izquierda. Una caja con la temperatura se abrirá. Haga clic en "Leer". Nota: Los valores más altos se correlacionan con un aumento de los niveles de ATP y una mayor actividad metabólica.

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Representative Results

Una figura que describe los pasos de procedimiento en el aislamiento de las mitocondrias utilizando la disociación de tejido y filtración diferencial se muestra en la Figura 1. Duración total del procedimiento es de menos de 30 min.

Las muestras de tejido se obtuvieron usando un punzón de biopsia de 6 mm. Peso del tejido fue de 0,18 ± 0,04 g (peso húmedo). El número de mitocondrias aisladas como se determina por recuento de tamaño de partícula fue de 2,4 x 10 x 10 ± 0,1 10 10 mitocondrias para el músculo esquelético y 2,75 x 10 x 10 ± 0,1 10 10 mitocondria para preparaciones de hígado (Figura 2A). Para permitir la comparación número mitocondrial también se determinó mediante hemocitómetro. Número mitocondrial fue subestimada según lo determinado por hemocitómetro como 0,11 x 10 10 ± 0.04 x 10 10 mitocondrias de músculo esquelético y 0.34 x 10 10 ± 0.09 x 10 10 mitocondrias para preparaciones de hígado (F2A igura). Diámetro mitocondrial tal como se determina por el tamaño basándose contador de partículas se muestra en la Figura 2B. El trazado muestra representativa de las mitocondrias aisladas se localizan en un pico con diámetro medio de 0,38 ± 0,17 micras de acuerdo con informes anteriores 7.

Proteína mitocondrial / g (peso húmedo) a partir de tejido como se determina por ácido bicinconínico (BCA) ensayo fue de 4,8 ± 2,9 mg / g (peso húmedo) y 7,3 ± 3,5 mg / g (peso húmedo) para el músculo esquelético y muestras de hígado, respectivamente (Figura 2C).

Pureza mitocondrial se determinó por microscopía electrónica de transmisión y se muestra en la Figura 2D. Las mitocondrias se muestran a ser denso en electrones con menos de 0,01% que se fracturó o dañado. La contaminación por partículas no mitocondriales es menor que 0,001%.

Viabilidad mitocondrial se determinó por MitoTracker Rojo como anteriormente desdescrita 17,18. Nuestros resultados muestran que las mitocondrias aisladas mantienen potencial de membrana (Figuras 3A - C).

ATP se determinó usando un kit de ensayo luminiscente. Un mapa de placa para el ensayo de ATP se muestra en la Figura 4. Normas de ATP se sembraron en duplicado. Muestras mitocondriales y controles negativos se sembraron por triplicado. Contenido de ATP era / proteína 10,67 ± 4,38 nmol mg mitocondrial y / mg proteína mitocondrial 14,83 ± 4,36 nmol para el músculo esquelético y muestras de hígado, respectivamente (Figura 3D).

La respiración mitocondrial se evaluó utilizando un tipo de electrodo de Clark a lo descrito previamente 17,18. Tasa de consumo de oxígeno mitocondrial era 178 O 2 / min / proteína ± 17 nM mg mitocondrial de músculo esquelético y 176 ± 23 O 2 / min / mg de proteína mitocondrial nM para preparaciones de hígado. Índice de control respiratorio valores (RCI) fueron 2.45 ± 0.34 und 2,67 ± 0,17 para el músculo esquelético y preparaciones de muestras de hígado, respectivamente (Figura 3E). Estos resultados son similares a los reportados en nuestros estudios anteriores utilizando homogeneización manual y centrifugación diferencial para aislar las mitocondrias 17-18.

Figura 1
Figura 1. Esquema para el aislamiento de las mitocondrias utilizando la disociación de tejido y filtración diferencial. (A) Transferencia dos 6 mm golpes de muestras de biopsia a 5 ml de tampón de homogeneización en un tubo de disociación C y homogeneizar las muestras mediante el programa de homogeneización 1 min del disociador tejido. (B) Añadir 250 l subtilisina una solución madre al homogeneizado en la disociación tubo C e incubar en hielo durante 10 min. (C) Filtrar el homogeneizado a través de un pre -wetted filtro de malla 40 micras en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml en hielo y luego añadir 250 l de solución madre de BSA al filtrado. (D) Re-filtro el filtrado a través de un nuevo filtro de malla previamente mojado 40 micras en unos 50 ml de centrífuga cónico en hielo. (E) Re-filtro el filtrado a través de un nuevo filtro de malla de 10 micras previamente mojado en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml en hielo. (F) Transferir el filtrado a 1,5 ml tubos de microcentrífuga y centrifugar a 9000 xg durante 10 min a 4 ° C. (G) Remover el sobrenadante y volver a suspender y combinar los gránulos mitocondriales en 1 ml Respiración Buffer. Tiempo total del procedimiento es de menos de 30 min. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. rendimiento mitocondrial y la pureza. (A) Número hemocitómetro y contador de tamaño de partícula mitocondrias aisladas de 0,18 ± 0,04 g de tejido (peso húmedo) para el músculo esquelético y el hígado. (B) Tamaño mitocondrial (mg / g) de distribución según lo detectado por el contador de tamaño de partícula. (C) proteína mitocondrial peso mg / g de tejido húmedo para el músculo esquelético y el hígado. (D) Microscopía Electrónica de Transmisión de imagen de mitocondrias aisladas. La barra de escala es de 100 nm. Las flechas indican la posible contaminación por partículas no mitocondriales y las mitocondrias dañadas. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 < br /> Figura 3. viabilidad mitocondrial. Microfotografías representativas de mitocondrias aisladas (A) bajo iluminación de contraste de fase y (B y C) en virtud de fluorescencia, con mitocondrias marcadas con MitoTracker Red CMXRos. Las barras de escala son 25 micras (A, B) y 5 micras (C). Estas imágenes indican que las mitocondrias mantienen el potencial de membrana.   Las flechas indican las mitocondrias carecen de membrana mitocondrial proteína / mg nmol potencial o desechos (D) ATP contenido determinado por ensayo ATP y (E) RCI (estado 3 / estado 4) según lo determinado por el electrodo de Clark. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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. Figura mapa 4. Plate para el ensayo de ATP Este mapa placa ilustra cómo configurar normas (A1 - A12), las muestras de las mitocondrias (B1 - C6), y los controles negativos (C7 - C9) para el ensayo de ATP. Durante el ensayo, 100 l de tampón de respiración, se añaden 50 l de solución de lisis de células de mamíferos y 50 l de solución de sustrato a todos los pocillos reconstituida (A1 - C9).

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Discussion

Para aislar con éxito las mitocondrias utilizando este protocolo es esencial para mantener todas las soluciones y las muestras de tejido en hielo para preservar la viabilidad mitocondrial. Incluso cuando se mantiene en hielo, mitocondrias aisladas exhibirán una disminución en la actividad funcional en el tiempo 19. Recomendamos que todas las soluciones y adiciones serán pre-preparados. Nos pre-pesar y almacenar Subtilisina A en 4 mg alícuotas de 1,5 ml tubos de microcentrífuga y almacenar a -20 ° C. Del mismo modo BSA se pre-pesa y se almacena en alícuotas de 20 mg en 1,5 ml tubos de microcentrífuga que se pueden almacenar a -20 ° C. Justo antes de usar los tubos se quitan de -20 ° C y subtilisina A y BSA se disuelven en 1 ml de tampón de homogeneización para su uso en el procedimiento de aislamiento mitocondrial.

Dos punzones de biopsia de tejido de músculo esquelético obtuvieron usando un punzón de biopsia de 6 mm proporcionar mitocondrias suficientes para su uso en procedimientos clínicos y quirúrgicos para intervenciones terapéuticas 17-18. Para estimar el número de mitocondrias que hemos utilizado dos métodos, hemocitómetro y partículas conteo tamaño. Se recomienda el uso del conteo de tamaño de partícula. El contador de tamaño de partícula utiliza la impedancia eléctrica para medir el volumen de las partículas que pasan a través de una abertura de un tamaño definido. El contador de tamaño de partícula es costosa, pero proporciona estimaciones precisas y fiables y es independiente del usuario. Número estimado por hemocitometría mitocondrial es más económico. Nuestros estudios han demostrado que este método proporciona estimaciones de variables que son aproximadamente un orden de magnitud menor que la obtenida usando un contador de tamaño de partícula. También hemos observado que los recuentos obtenidos por hemocitómetro dependen en gran medida del usuario. Le sugerimos que para garantizar estimaciones consistentes de todos los cargos utilizando un hemocitómetro deben ser realizadas por una sola persona.

Hemos encontrado kits de ensayo de ATP que es útil para la determinación de la función mitocondrial. El kit proporciona todos los r necesarioeagents y proporciona un método simple y rápido para determinar la actividad metabólica de las mitocondrias aisladas. El ensayo de ATP proporciona resultados similares a los obtenidos usando un electrodo de tipo Clark y por lo tanto es compatible con el análisis de datos anterior 20-21.

Una ventaja importante de nuestro protocolo de aislamiento mitocondrial es que permite para el aislamiento de un alto rendimiento de las mitocondrias, la respiración competentes viables libres de contaminación en menos de 30 min. Diferencial de filtración en lugar de centrifugación diferencial reduce significativamente el tiempo de procedimiento. Otros protocolos incorporan varias etapas de centrifugación con el tiempo global de aislamiento con un 60 min a 100 min 13-17. Otra ventaja de este protocolo es que la homogeneización del tejido ha sido estandarizada. El disociador tejido comercial ofrece un ciclo normalizado y produce resultados consistentes y reproducibles. Esto es en contraste a la homogeneización manual que está sujeta a la variabilidad de usuario yinconsistencia. Nuestro método para el rápido aislamiento de las mitocondrias mediante la disociación de tejido y filtración diferencial proporciona un marco de tiempo de aislamiento compatible para la intervención terapéutica clínica y quirúrgica 17,18.

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Disclosures

Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las directrices institucionales actuales. No tenemos intereses financieros en competencia a revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de subvención HL-103542, y el premio Trailblazer Distinguido de la Fundación de Investigación de la Anestesia BCH a CAP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Sigma Aldrich 84100
HEPES Sigma Aldrich H4034
EGTA Sigma Aldrich E4378
Substilsin A Sigma Aldrich P5380
BSA Sigma Aldrich A7906
KH2PO4 Sigma Aldrich P5379
MgCl2 Sigma Aldrich M8266
NaCl Sigma Aldrich S6191
KCl Fisher Scientific P2173
Na2HPO4 Fisher Scientific S374
ATPlite Luminescence Assay System,
1,000 Assay Kit		 Perkin Elmer 6016941
50 ml Conical Tubes BD 352098
40 μm Nylon Filters BD  352340
GentleMACS C tube Miltenyl Biotech 120-005-331
1.5 ml Eppendorf tube Fisher Scientific 05-408-129
6 mm biopsy punch Miltex 33-36
10 μm Pluristrainer Pluriselect 43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C Marshall Scientific EP-5415C 
GentleMACS Dissociator  Miltenyl Biotech 130-093-235
96-well plates, tissue culture treated VWR 82050-732
Rotomax 120 orbital shaker Heidolph 544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode
 Microplate Reader		 BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076
Oxytherm System Hansatech Instruments
Hemacytometer Fisher Scientific 267110

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References

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Biología Celular Número 91 los procedimientos quirúrgicos operativa técnicas de investigación las mitocondrias el aislamiento la filtración homogeneizado la disociación de tejidos el trasplante

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 01/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial
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Preble, J. M., Pacak, C. A., Kondo,… More

Preble, J. M., Pacak, C. A., Kondo, H., MacKay, A. A., Cowan, D. B., McCully, J. D. Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. J. Vis. Exp. (91), e51682, doi:10.3791/51682 (2014).

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