Summary

Snabb Isolering och rening av Mitokondrier För Transplantation Av vävnadsdissociering Och Differential Filtration

Published: September 06, 2014
doi:

Summary

En metod för snabb isolering av mitokondrier från däggdjurs vävnadsbiopsier beskrivs. Råtta lever eller skelettmuskelpreparat homogeniserades med en kommersiell vävnads dissociator och mitokondrier isolerades genom differentiell filtrering genom nylon mesh filter. Mitochondrial isoleringstiden är <30 minuter jämfört med 60 – 100 minuter med hjälp av alternativa metoder.

Abstract

Tidigare beskrivna mitokondriella isoleringsmetoder som använder differentiell centrifugering och / eller Ficoll gradientcentrifugering kräver 60-100 minuter att slutföra. Vi beskriver en metod för snabb isolering av mitokondrier från däggdjurs biopsier med en kommersiell vävnads dissociator och differential filtrering. I detta protokoll är manuell homogenisering ersätts med vävnaden dissociator standardiserade homogenisering cykel. Detta möjliggör enhetlig och konsekvent homogenisering av vävnad som inte är lätt att uppnå med manuell homogenisering. Efter vävnadsdissociering är homogenatet filtreras genom nylonnät filter som eliminerar repetitiva centrifugeringssteg. Som ett resultat kan mitokondrie isolering utföras på mindre än 30 min. Denna isolering protokoll ger ca 2 x 10 10 livskraftiga och andnings kompetenta mitokondrier från 0,18 ± 0,04 g (våtvikt) vävnadsprov.

Introduction

Mitokondrier finns i varje cell i kroppen utom röda blodkroppar och är involverade i ett stort antal viktiga cellulära och metaboliska processer 1-4. På grund av dessa många funktioner, kan mitokondriell skada ha skadliga effekter 3. För att undersöka mitokondriell funktion och dysfunktion flera mitokondriella isoleringsmetoder har beskrivits. De tidigaste publicerade räkenskaper mitokondriell isolering datum till 1940-talet 5-8. Den första dokumenterade försök visat mitokondriell isolering genom slipning levervävnad i en mortel, följt av centrifugering i en saltlösning vid låg hastighet 5,8. Senare, andra grupper kompletterats det ursprungliga förfarandet och visade vävnadsfraktione baserad på differentiell centrifugering 6-8. Dessa tidiga metoder legat till grund för aktuella tekniker som ofta innehåller homogenisering, och / eller differentialcentrifugering 9-15. Antalet homogenizatipå och centrifugeringssteg varierar bland protokoll. Dessa repetitiva steg öka tiden för mitokondriell isolering och slutligen minska lönsamheten. Dessutom kan manuell homogenisering orsaka mitokondriell skada och inkonsekventa resultat om den inte kontrolleras 10,16.

Nyligen använde vi homogenisering och differentialcentrifugering för att isolera mitokondrier för transplantation till hjärtmuskelvävnaden 17,18. Denna långa isoleringsförfarande krävs ca 90 min och den kliniska tillämpningen av denna metod var därför begränsad. För att möjliggöra akut terapeutisk användning i klinisk och kirurgisk behandling har vi utvecklat en snabb mitokondriell isoleringsförfarande som kan utföras på mindre än 30 minuter.

De stora fördelarna med detta protokoll är att standardiserad vävnadsdissociering möjliggör enhetlig och konsekvent homogenisering av vävnad som inte är lätt att uppnå med manuell homogenisering. I addition, användning av differentialfiltrering i stället för differentialcentrifuge eliminerar tidskrävande och repetitiva centrifugeringssteg som möjliggör snabbare isolering av renade, livskraftiga och andnings kompetenta mitokondrier.

Förmågan att isolera livskraftiga och andnings kompetenta mitokondrier på mindre än 30 minuter möjliggör klinisk tillämpbarhet. Denna isolering protokoll har potential att användas i koronar bypass-kirurgi kirurgi (CABG) och andra terapeutiska förfaranden.

Protocol

Framställning Bered en M K-HEPES-stamlösning (pH-justering till 7,2 med KOH). Förbered 0,5 M K-EGTA stamlösning (justera pH till 8,0 med KOH). Bered 1 M KH 2 PO 4 Stock Solution. Bered en M MgCl 2 förrådslösning. Förbered homogeniseringsbuffert (pH 7,2) 300 mM sackaros, 10 mM K-HEPES och 1 mM K-EGTA. Förvara vid 4 ° C. Förbered Respiration Buffert 250 mM sackaros, 2 mM KH 2 PO 4, 10 mM MgCl…

Representative Results

En siffra som beskriver de processuella åtgärder i isolering av mitokondrier använder vävnadsdissociering och differentialfiltrering visas i figur 1. Total processtiden är mindre än 30 min. Vävnadsprover erhölls genom att använda en 6 mm biopsistans. Tissue vikten var 0,18 ± 0,04 g (våt vikt). Antalet mitokondrier isolerade bestämt med partikelstorleksräkning var 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitokondrier för skelettmuskel och 2,75 x 10 …

Discussion

För att lyckas isolera mitokondrier som använder detta protokoll är det viktigt att hålla alla lösningar och vävnadsprov på is för att bevara mitokondrie livskraft. Även när underhålls på is, kommer isolerade mitokondrier uppvisar en minskning av funktionell aktivitet över tiden 19. Vi rekommenderar att alla lösningar och tillägg i förväg förberedda. Vi reser väga och lagra subtilisin A i 4 mg alikvoter i 1,5 ml mikrofugrör och förvara dem vid -20 ° C. Likaså BSA förvägt och lagrades …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes av National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL 103.542 och BCH Anesthesia Research Foundations Distinguished Trailblazer Award till den gemensamma jordbrukspolitiken.

Materials

Sucrose Sigma Aldrich 84100
HEPES Sigma Aldrich H4034
EGTA Sigma Aldrich E4378
Substilsin A Sigma Aldrich P5380
BSA Sigma Aldrich A7906
KH2PO4 Sigma Aldrich P5379
MgCl2 Sigma Aldrich M8266
NaCl Sigma Aldrich S6191
KCl Fisher Scientific P2173
Na2HPO4 Fisher Scientific S374
ATPlite Luminescence Assay System,
1000 Assay Kit
Perkin Elmer 6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes BD 352098
40 μm Nylon Filters BD  352340
GentleMACS C tube Miltenyl Biotech 120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube Fisher Scientific 05-408-129
6 mm biopsy punch Miltex 33-36
10 μm Pluristrainer Pluriselect 43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C Marshall Scientific EP-5415C 
GentleMACS Dissociator  Miltenyl Biotech 130-093-235
96-well plates, tissue culture treated VWR 82050-732
Rotomax 120 orbital shaker Heidolph 544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode
 Microplate Reader
BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076
Oxytherm System Hansatech Instruments
Hemacytometer Fisher Scientific 267110

References

  1. van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
  2. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
  3. Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
  4. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).
  5. Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
  6. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  7. Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  8. Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  9. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
  10. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
  11. Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
  12. Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
  13. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
  16. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
  17. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
  18. McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
  19. Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
  20. Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
  21. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

Play Video

Cite This Article
Preble, J. M., Pacak, C. A., Kondo, H., MacKay, A. A., Cowan, D. B., McCully, J. D. Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. J. Vis. Exp. (91), e51682, doi:10.3791/51682 (2014).

View Video