En metod för snabb isolering av mitokondrier från däggdjurs vävnadsbiopsier beskrivs. Råtta lever eller skelettmuskelpreparat homogeniserades med en kommersiell vävnads dissociator och mitokondrier isolerades genom differentiell filtrering genom nylon mesh filter. Mitochondrial isoleringstiden är <30 minuter jämfört med 60 – 100 minuter med hjälp av alternativa metoder.
Tidigare beskrivna mitokondriella isoleringsmetoder som använder differentiell centrifugering och / eller Ficoll gradientcentrifugering kräver 60-100 minuter att slutföra. Vi beskriver en metod för snabb isolering av mitokondrier från däggdjurs biopsier med en kommersiell vävnads dissociator och differential filtrering. I detta protokoll är manuell homogenisering ersätts med vävnaden dissociator standardiserade homogenisering cykel. Detta möjliggör enhetlig och konsekvent homogenisering av vävnad som inte är lätt att uppnå med manuell homogenisering. Efter vävnadsdissociering är homogenatet filtreras genom nylonnät filter som eliminerar repetitiva centrifugeringssteg. Som ett resultat kan mitokondrie isolering utföras på mindre än 30 min. Denna isolering protokoll ger ca 2 x 10 10 livskraftiga och andnings kompetenta mitokondrier från 0,18 ± 0,04 g (våtvikt) vävnadsprov.
Mitokondrier finns i varje cell i kroppen utom röda blodkroppar och är involverade i ett stort antal viktiga cellulära och metaboliska processer 1-4. På grund av dessa många funktioner, kan mitokondriell skada ha skadliga effekter 3. För att undersöka mitokondriell funktion och dysfunktion flera mitokondriella isoleringsmetoder har beskrivits. De tidigaste publicerade räkenskaper mitokondriell isolering datum till 1940-talet 5-8. Den första dokumenterade försök visat mitokondriell isolering genom slipning levervävnad i en mortel, följt av centrifugering i en saltlösning vid låg hastighet 5,8. Senare, andra grupper kompletterats det ursprungliga förfarandet och visade vävnadsfraktione baserad på differentiell centrifugering 6-8. Dessa tidiga metoder legat till grund för aktuella tekniker som ofta innehåller homogenisering, och / eller differentialcentrifugering 9-15. Antalet homogenizatipå och centrifugeringssteg varierar bland protokoll. Dessa repetitiva steg öka tiden för mitokondriell isolering och slutligen minska lönsamheten. Dessutom kan manuell homogenisering orsaka mitokondriell skada och inkonsekventa resultat om den inte kontrolleras 10,16.
Nyligen använde vi homogenisering och differentialcentrifugering för att isolera mitokondrier för transplantation till hjärtmuskelvävnaden 17,18. Denna långa isoleringsförfarande krävs ca 90 min och den kliniska tillämpningen av denna metod var därför begränsad. För att möjliggöra akut terapeutisk användning i klinisk och kirurgisk behandling har vi utvecklat en snabb mitokondriell isoleringsförfarande som kan utföras på mindre än 30 minuter.
De stora fördelarna med detta protokoll är att standardiserad vävnadsdissociering möjliggör enhetlig och konsekvent homogenisering av vävnad som inte är lätt att uppnå med manuell homogenisering. I addition, användning av differentialfiltrering i stället för differentialcentrifuge eliminerar tidskrävande och repetitiva centrifugeringssteg som möjliggör snabbare isolering av renade, livskraftiga och andnings kompetenta mitokondrier.
Förmågan att isolera livskraftiga och andnings kompetenta mitokondrier på mindre än 30 minuter möjliggör klinisk tillämpbarhet. Denna isolering protokoll har potential att användas i koronar bypass-kirurgi kirurgi (CABG) och andra terapeutiska förfaranden.
För att lyckas isolera mitokondrier som använder detta protokoll är det viktigt att hålla alla lösningar och vävnadsprov på is för att bevara mitokondrie livskraft. Även när underhålls på is, kommer isolerade mitokondrier uppvisar en minskning av funktionell aktivitet över tiden 19. Vi rekommenderar att alla lösningar och tillägg i förväg förberedda. Vi reser väga och lagra subtilisin A i 4 mg alikvoter i 1,5 ml mikrofugrör och förvara dem vid -20 ° C. Likaså BSA förvägt och lagrades …
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL 103.542 och BCH Anesthesia Research Foundations Distinguished Trailblazer Award till den gemensamma jordbrukspolitiken.
Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
Equipment | |||
50 mL Conical Tubes | BD | 352098 | |
40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |