Snabb Isolering och rening av Mitokondrier För Transplantation Av vävnadsdissociering Och Differential Filtration

Summary

En metod för snabb isolering av mitokondrier från däggdjurs vävnadsbiopsier beskrivs. Råtta lever eller skelettmuskelpreparat homogeniserades med en kommersiell vävnads dissociator och mitokondrier isolerades genom differentiell filtrering genom nylon mesh filter. Mitochondrial isoleringstiden är <30 minuter jämfört med 60 – 100 minuter med hjälp av alternativa metoder.

Abstract

Tidigare beskrivna mitokondriella isoleringsmetoder som använder differentiell centrifugering och / eller Ficoll gradientcentrifugering kräver 60-100 minuter att slutföra. Vi beskriver en metod för snabb isolering av mitokondrier från däggdjurs biopsier med en kommersiell vävnads dissociator och differential filtrering. I detta protokoll är manuell homogenisering ersätts med vävnaden dissociator standardiserade homogenisering cykel. Detta möjliggör enhetlig och konsekvent homogenisering av vävnad som inte är lätt att uppnå med manuell homogenisering. Efter vävnadsdissociering är homogenatet filtreras genom nylonnät filter som eliminerar repetitiva centrifugeringssteg. Som ett resultat kan mitokondrie isolering utföras på mindre än 30 min. Denna isolering protokoll ger ca 2 x 10 ¹⁰ livskraftiga och andnings kompetenta mitokondrier från 0,18 ± 0,04 g (våtvikt) vävnadsprov.

Introduction

Mitokondrier finns i varje cell i kroppen utom röda blodkroppar och är involverade i ett stort antal viktiga cellulära och metaboliska processer ^1-4. På grund av dessa många funktioner, kan mitokondriell skada ha skadliga effekter ^3. För att undersöka mitokondriell funktion och dysfunktion flera mitokondriella isoleringsmetoder har beskrivits. De tidigaste publicerade räkenskaper mitokondriell isolering datum till 1940-talet ^5-8. Den första dokumenterade försök visat mitokondriell isolering genom slipning levervävnad i en mortel, följt av centrifugering i en saltlösning vid låg hastighet ^5,8. Senare, andra grupper kompletterats det ursprungliga förfarandet och visade vävnadsfraktione baserad på differentiell centrifugering ^6-8. Dessa tidiga metoder legat till grund för aktuella tekniker som ofta innehåller homogenisering, och / eller differentialcentrifugering ^9-15. Antalet homogenizatipå och centrifugeringssteg varierar bland protokoll. Dessa repetitiva steg öka tiden för mitokondriell isolering och slutligen minska lönsamheten. Dessutom kan manuell homogenisering orsaka mitokondriell skada och inkonsekventa resultat om den inte kontrolleras ^10,16.

Nyligen använde vi homogenisering och differentialcentrifugering för att isolera mitokondrier för transplantation till hjärtmuskelvävnaden ^17,18. Denna långa isoleringsförfarande krävs ca 90 min och den kliniska tillämpningen av denna metod var därför begränsad. För att möjliggöra akut terapeutisk användning i klinisk och kirurgisk behandling har vi utvecklat en snabb mitokondriell isoleringsförfarande som kan utföras på mindre än 30 minuter.

De stora fördelarna med detta protokoll är att standardiserad vävnadsdissociering möjliggör enhetlig och konsekvent homogenisering av vävnad som inte är lätt att uppnå med manuell homogenisering. I addition, användning av differentialfiltrering i stället för differentialcentrifuge eliminerar tidskrävande och repetitiva centrifugeringssteg som möjliggör snabbare isolering av renade, livskraftiga och andnings kompetenta mitokondrier.

Förmågan att isolera livskraftiga och andnings kompetenta mitokondrier på mindre än 30 minuter möjliggör klinisk tillämpbarhet. Denna isolering protokoll har potential att användas i koronar bypass-kirurgi kirurgi (CABG) och andra terapeutiska förfaranden.

Protocol

Framställning Bered en M K-HEPES-stamlösning (pH-justering till 7,2 med KOH). Förbered 0,5 M K-EGTA stamlösning (justera pH till 8,0 med KOH). Bered 1 M KH 2 PO 4 Stock Solution. Bered en M MgCl 2 förrådslösning. Förbered homogeniseringsbuffert (pH 7,2) 300 mM sackaros, 10 mM K-HEPES och 1 mM K-EGTA. Förvara vid 4 ° C. Förbered Respiration Buffert 250 mM sackaros, 2 mM KH 2 PO 4, 10 mM MgCl…

Representative Results

En siffra som beskriver de processuella åtgärder i isolering av mitokondrier använder vävnadsdissociering och differentialfiltrering visas i figur 1. Total processtiden är mindre än 30 min. Vävnadsprover erhölls genom att använda en 6 mm biopsistans. Tissue vikten var 0,18 ± 0,04 g (våt vikt). Antalet mitokondrier isolerade bestämt med partikelstorleksräkning var 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitokondrier för skelettmuskel och 2,75 x 10 …

Discussion

För att lyckas isolera mitokondrier som använder detta protokoll är det viktigt att hålla alla lösningar och vävnadsprov på is för att bevara mitokondrie livskraft. Även när underhålls på is, kommer isolerade mitokondrier uppvisar en minskning av funktionell aktivitet över tiden ^19. Vi rekommenderar att alla lösningar och tillägg i förväg förberedda. Vi reser väga och lagra subtilisin A i 4 mg alikvoter i 1,5 ml mikrofugrör och förvara dem vid -20 ° C. Likaså BSA förvägt och lagrades …

Materials

Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit	Perkin Elmer	6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes	BD	352098
40 μm Nylon Filters	BD	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm biopsy punch	Miltex	33-36
10 μm Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-well plates, tissue culture treated	VWR	82050-732
Rotomax 120 orbital shaker	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode  Microplate Reader	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110