3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes
Summary
In this video protocol we track – at high speed and in three dimensions – fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.
Abstract
Het doel van deze video protocol te bespreken hoe uitvoeren en analyseren van een driedimensionaal fluorescerende orbitale particle tracking-experiment met een aangepaste twee-foton microscoop 1. In tegenstelling tot conventionele benaderingen (raster scan of brede veld op basis van een stapel van frames), de 3D-orbitale tracking kan lokaliseren en te volgen met een hoge ruimtelijke (10 nauwkeurigheid nm) en temporele resolutie (50 Hz frequentierespons) de 3D-verplaatsing van een bewegende fluorescerende deeltjes op lengteschalen van honderden micron 2. De methode is gebaseerd op een terugkoppelalgoritme dat de hardware van een twee-foton laser scanning microscoop om een cirkelbaan uitvoeren rond het object besturingselementen worden gevolgd: het terugkoppelingsmechanisme de fluorescerende voorwerp in het midden te bewerkstelligen door de verplaatsing van de aftastbundel 3-5. Om de voordelen van deze techniek tonen, volgden wij een snel bewegende organel, het lysosoom, in aliving cel 6,7. Cellen werden volgens standaardprotocollen, en gekleurd met een commercieel lysosoom kleurstof. We bespreken kort de hardwareconfiguratie en gedetailleerder de besturingssoftware, een 3D orbitale tracking-experiment uitgevoerd in levende cellen. We bespreken in detail de parameters vereist om de scanning microscoop bedienen en kan de beweging van de bundel in een gesloten baan rond de deeltjes. We slot tonen hoe deze werkwijze effectief kan worden gebruikt om de snelle beweging van een gemerkt lysosoom langs microtubules in 3D spoor binnen een levende cel. Lysosomen kan bewegen met een snelheid in het bereik van 0,4-0,5 um / sec, kenmerkend weergeven van een gerichte beweging langs het microtubule netwerk 8.
Introduction
Een groot aantal benaderingen ontwikkeld om datum fluorescerende deeltjes sporen in drie dimensies met behulp van een microscoop. De meeste benaderingen afhankelijk van het gebruik van snelle camera ideaal te sporen in twee dimensies, meestal in combinatie met aangepaste wijzigingen van de emissie optiek van de microscoop volgen verwezenlijking in de axiale richting. Laser scanning microscopen (hetzij confocale of twee fotonen) gewoonlijk een fluorescerend deeltje door het uitvoeren van een tijdsvolgorde van z-stacks volgen, hoewel dit proces typisch tijdrovend en levert redelijk tijdsresolutie (10 Hz) indien het deeltje wordt bijgehouden is in het centrum van een raster imaging gebied gehouden door actief terugkoppelingsmechanisme 2.
Het idee van vast blijven zitten aan het deeltje is de basis van de orbitale volgmethode. In plaats van een raster scan een cirkelbaan wordt uitgevoerd rond de fluorescerende deeltjes. De intensiteit van de fluorescentie langsde baan nauwkeurig lokaliseert het deeltje positie 4.
De gelokaliseerde positie van het deeltje kan dan worden gebruikt om de microscoop scanners en re-center de baan van het deeltje stand bedienen. De galvanometer scanners van de microscoop worden aangedreven door een analoge spanning. De AC component van deze spanning maakt het uitvoeren van een baan met de gefocusseerde laserbundel, bijvoorbeeld een sinus en cosinus golf toegepast op de X en Y aftastspiegels zal uitvoeren een cirkelbaan. De DC offset van het signaal vergemakkelijkt de positie van de baan centrum. Zodra een baan periode wordt vastgesteld en de golfvorm van het AC-signaal is geconfigureerd, het feedback systeem moet alleen de DC-component van het signaal werken.
Een software kan het fluorescerende signaal vanuit het detectors lezen moet de scanners en de detectoren controleren, om de positie van het deeltje berekenen en actualiseren de DC offingesteld. Voor een succesvolle feedback afbeelden van een zorgvuldige keuze van de baan parameters (grootte en timing) vereist en deze parameters moeten worden aangepast op basis van de eigenschappen van de fluorescerende deeltjes die het noodzakelijk volgen is.
De fysische en wiskundige fundamenten van de techniek werden in het verleden 4,5 beschreven voor zowel 2D-en 3D-toepassingen. In dit protocol beschrijven we kort de belangrijkste hardware componenten van de installatie, en in meer detail de keuze van de parameters en het monster voorbereiding die nodig is voor een typisch experiment waardoor we na de verplaatsing van een lysosoom bij een hoge temporele resolutie binnen een levende cel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ondanks de enorme vooruitgang van fluorescentiemicroscopie technieken en instrumentatie in de afgelopen jaren, bereiken banen van fluorescerende deeltjes in drie dimensies met een hoge tijdsresolutie is een uitdaging in het veld blijft. Indien hoge tijdsresolutie is tracking-deeltjes bereikt in twee dimensies, verlenging van de axiale richting brengt typisch een drastische vermindering van de frequentierespons van het systeem 10.
In deze video-protocol hebben we binnen de demonstr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516
Materials
| Name | Company | Model |
| Lysotracker DND 26 | Life technologies | L-7526 |
| tubuline tracker Green | Life technologies | T34075 |
| Mitotracker RED | Life technologies | M7512 |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | |
| Calcite polarize | Melles Griot Glan | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge technologies | M 6350 |
| Dichroic mirror | Chroma technologies | 700 DCSPXR |
| Motorized stage | ASI | MS2000 |
| Piezo | PI | P721-LLQ |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
