Rekombinant proteinuttryck för strukturbiologi i HEK 293F Suspension Celler: A Novel och Accessible Approach

Introduction

Den snabba utvecklingen av molekylär cellbiologi och det ständiga behovet av förbättrade läkemedel inom medicin har skapat ett behov av strukturella biologer att titta på allt mer komplexa proteinstrukturer. Dessa kan ofta kräver särskilda post-translationella modifieringar, molekylära chaperoner och co-faktorer för att stödja deras arbetade vikning och enzymatisk aktivitet. Medan den stora majoriteten av strukturer som finns i Protein Data Bank har erhållits med hjälp av bakteriella expressionssystem, prokaryoter inte kan utföra ett stort antal av dessa ändringar och saknar många viktiga eukaryota co-faktorer. Detta kan vara ett problem för studiet av stora multi subenhet komplex som aktiveras av små signalmolekyler och för nukleär, cellytan och utsöndrade proteiner som kräver genomarbetade fällbara maskinerier. Ett antal E. coli-stammar har utvecklats för att övervinna några av dessa begränsningar ^1. Under senare år har emellertid användning av mammalian expressionssystem har ökat eftersom de tillförlitligt producerar eukaryota proteiner som annars problematiskt att uttrycka i andra system ^2. Idag är det möjligt att erhålla stabila och övergående däggdjursuttryckscellinjer genom olika tekniker som sträcker sig från viral transduktion till kemisk-medierad transfektion, fysisk genöverföring såsom elektroporering och direktinsprutning ^3. Även om alla dessa metoder har sin egen uppsättning av fördelar och nackdelar, bara ett fåtal av dem är lämpliga för strukturstudier vara antingen för dyra och / eller tidskrävande.

Här beskriver vi en mycket enkel, snabb, billig men mycket effektiv metod för att uttrycka proteinkomplex för strukturbiologi i suspensions odlas däggdjursceller. Det tillvägagångssätt använder transient samtransfektion av en human embryonal njure (HEK) cellinje (t.ex. Frisim HEK 293F-celler). Dessa celler har härletts från HEK 293 cell linje, är anpassade att växa i suspensionskulturer, når höga densiteter med användning serumfritt medium (såsom FreeStyle 293 Expression medium). Celler sedan transient med hjälp av en förgrenad version av polyetylenimin (PEI), en billig polymera reagens som har rapporterats fungera för ett stort utbud av däggdjursceller ⁴ genom att bilda DNA / PEI-komplex som kommer in i värdcellen genom endocytos ^5. Denna metod är lämplig för både liten skala (30 ml) och storskalig (upp till 300 ml) experiment och kan producera höga nivåer av renade proteinkomplex. Det är särskilt användbart för att studera proteiner som kräver komplexa fällbara maskiner, co-faktorer eller specifika posttranslationella modifieringar som inte kan utföras av bakterier, jäst och insektsceller.

I detta protokoll presenterar vi uttrycket och reningen av de tre-proteinet central byggnadsställning från Sin3A transkription repression komplex. Denna består av HistonDeacetylase 1 (HDAC1), Suppressor av Defekt Tysta 3 (SDS3) och Switch oberoende 3 (Sin3A). Det renade komplexet används för hög genomströmning kristallisering prövningar.

Protocol

OBS: Protokollet är lämplig för alla skala uttryck, alltså volymer och mängder av reagenser ska skalas proportionellt. En lämplig däggdjursexpressionsvektor måste användas för detta protokoll. Här använde vi en modifierad pcDNA 3.1 expressionsvektor som bekvämt medger inkludering eller uteslutning av en affinitetsmärkning, beroende på val av restriktionsenzymer som används i kloning (Figur 1). Följande protokoll beskriver en storskalig transfektion.

1 Large Scale Kultur / Transfektion i 1 L rullfläskor

Väx och upprätthålla HEK293F suspensionsanpassade celler enligt standardprotokoll. Typiskt startkulturer av mellan 30 och 100 ml odlas i 250 ml koniska cellodlingsflaskor.

1. Seed-celler vid 0,5 x 10 ⁶ celler / ml i en slutvolym av 300 ml i varje 1 L rullflaska.
   OBSERVERA: rullfläskor rymma minst 150 ml till högst300 ml suspensionskultur. För större skala transfections använder flera flaskor.
2. Inkubera under 24 h i en orbitalskak inkubator vid 37 ° C, 120 varv per minut, och 5% _CO2 tills cellerna når en densitet av 1,0 x 10 ⁶ celler / ml (celler bör dela ungefär var 24 h).
3. Pipet totalt 300 pg av filtersteriliserad DNA (se kompletterande metod) i 30 ml PBS och skaka kraftigt för 3 sek.
   OBS: Använd totalt 1 ng DNA per miljon transfekterade celler. Om två eller flera plasmider är att samtransfekteras minska mängden av varje, så att förhållandet av DNA till celler förblir konstant.
4. Lägg 1,2 ml 0,5 mg / ml filtersteriliserad PEI till PBS / DNA-lösningen och skaka kraftigt för 3 sek.
5. Inkubera blandningen vid RT under 20 min.
6. Lägg DNA / PEI mix till cellerna - som bör vara vid en densitet av 1 x 10 ⁶ celler / ml (steg 1.3).
7. Efter samtransfektion, inkubera cellernai en orbitalskak inkubator under ytterligare 48 h vid 37 ° C, 120 varv per minut, och 5% _CO2.
8. Harvest intracellulära proteiner genom centrifugering av cellerna vid 3000 x g under 5 min och lagra pelleten vid -80 ° C.
   OBS: Alternativt kan man använda en standard (icke-CO ₂₎ skakinkubator, om atmosfären ovanför kulturen är ersatt med 5% CO ₂ och locket Flaskan försluts. Stämningen kommer att behöva bytas ut vid varje passage (normalt vart 2 dagar).

2 Protein-komplex Rening från helcellextrakt

Detta protokoll är optimerat för reningen av nukleära komplex med användning av FLAG-märkta proteiner.

1. Upptining cellpelleten i ~ 40 ml för-kyld lysbuffert (100 mM kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glycerol, 0,3% Triton X-100, proteashämmare) per liter kultur.
2. Återuppslamma pelleten genom att pipettera upp och ned flera gånger (för att undvika skumbildning, inte vortex). Grundligt återsuspendera celler med hjälp av en glashomogenisator. Sonikera i 3 cykler (15 sek på, 15 sek av). Centrifugera vid 30.000 xg under 25 minuter vid 4 ° C och behålla överstående.
3. Jämvikta 1,25 ml av anti-flag packade agaros harts per liter kultur genom tvättning tre gånger med harts ekvilibreringsbuffert (100 mM kaliumacetat, 50 mM Tris, pH 7,5).
4. Inkubera helcellextrakt från steg 2.3 med affinitetsharts i en eller flera 50 ml centrifugrör och rotera försiktigt provet i 30-120 minuter vid 4 ° C.
5. Centrifugera vid 3000 xg under 1 min vid 4 ° C, kassera supernatanten.
6. Tvätta hartset med 45 ml i förväg kyld buffert 1 (100 mM kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glycerol, 0,3% Triton X-100). Centrifugera vid 3000 xg under 1 minut och kassera supernatanten.
7. Upprepa steg 2,7 med användning av buffert med hög salthalt (300 mM kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glycerol), följt av buffert med låg salthalt (50 mM kaliumacetat, 50 mM Tris, pH 70,5, 5% glycerol) och TEV Cleavage Buffer (50 mM kaliumacetat, 50 mM Tris, pH 7,5, 0,5 mM TCEP).
   OBS: Se till varje tvätt är kort dvs tillräckligt för att fullt ut åter avbryta hartset och inte längre.
8. Samla ett prov av harts 10 l och späd till 1 volym 2x protein buffert för analys (bundet protein kontroll). Använd inte reduktionsmedel för att undvika frigörande av antikroppen från hartset.
9. Återuppslamma massan till 8-10 ml i förväg kyld TEV klyvningsbuffert och överför till en 15 ml centrifugrör.
10. Lägg ~ 40 pg av TEV proteas (från lager vid 1 mg / ml) per liter ursprungliga kulturen och blanda väl genom att pipettera upp och ned flera gånger.
11. Byt ut röret atmosfär med 100% _N2-gas för att förhindra protein oxidation.
12. Rotera försiktigt O / N vid 4 ° C.
13. Centrifugera vid 3000 xg under 10 minuter. Överför supernatanten till en ultracentrifugeringsfilter med en lämplig molekylvikt cut-off och koncentreraned till 500 | il.
14. Samla ett prov av den koncentrerade protein 10 pl och späd till en volym av 2x proteinladdningsbuffert för analys. (TEV eluat kontroll).
15. Samla ett prov av hartset 10 pl och späd till en volym av 2x proteinladdningsbuffert för analys. Använd inte reduktionsmedel för att undvika att släppa stora mängder antikroppar från hartset. (Post-TEV hartskontroll).
16. Jämvikta storleksuteslutande kromatografi kolonn med gelfiltrering buffert (50 mM kaliumacetat, 50 mM Tris, pH 7,5, 0,5 mM TCEP).
17. Filtrera proteinet genom ett 0,22 pm filter
18. Ladda provet i kolonnen och samla fraktioner.
19. Kör prover från steg 2,9, 2,15 och 2,16 och gelfiltreringen fraktionerna från steg 2,19 på en SDS-PAGE och Coomassie-färgning för analys.
    OBS: Vi rekommenderar att köra en SDS-PAGE av prover från steg 2.9, 2.15 och 2.16 före gelfiltrering för att bekräfta uttryck av målproteinet.

Representative Results

Här visar vi en 2 L (8 x 250 ml kulturer) transient samtransfektion och rening av HDAC1, SDS3, Sin3A temära komplexet. HDAC1 och SDS3 interagera med Sin3A genom HDAC-interaktionsdomän (HID) i Sin3A. En typisk renings ger upp till 1 mg komplex per liter kultur.

Figur 1 Schematisk bild av den modifierade pcDNA 3,1 expressionsvektor. Plasmiden digererades med EcoRV och EcoRI för att innefatta affinitetstaggen och TEV-klyvningsstället på aminoänden av Sin3A. För att klona omärkta versioner av HDAC1 och SDS3 ades vektorn klövs med Kpnl och EcoRI.

Figur 2 SDS-PAGE visar det första steget av rening. Den "bundna proteinet" lane visar komplexet bundet till affinitetsharts. Efter TEV matsmältningen, är taggen närvarande på Sin3A-HID klyvs av och komplexet elueras från hartset som visas i den andra och tredje körfält av gelen.

Figur 3 Kromatogram av protein-komplex renades med användning av storleksuteslutningskromatografi. Notera att det rena komplexet elueras i hålrumsvolymen, eftersom det bildar en dimer i lösning.

Figur 4 SDS-PAGE som visar de fraktioner av gelfiltreringen visas i figur 3.

Figur 5 Trypanblått-färgade HEK 293F celler vid 2.3x10 ⁶ celler / ml redo att transfekteras. Celler bör endast förekomma som enstaka eller delande celler, medan stora kluster kan brytas upp genom kraftig virvelbildning i ca 25 sek.

Problem	Möjliga orsaker	Åtgärd
Låg proteinavkastning.	Låg antal celler transfekterade.	Se till celldensiteten är ca 1,0 x 10 6 före tillsats av transfektion reaktionsblandningen till odlingen.
	Celler kan ha subodlades för många gånger.	Använd färska lagerceller efter ca 90 passåldrar.
	DNA kan nedbrytas eller har en hög mängd av föroreningar.	Se till att plasmid-DNA som används har en 260/280 förhållandet mellan 1,8 och 2,0. Körning av DNA på en agarosgel är tillrådligt att bedöma dess kvalitet.
	Protein (er) uttrycks inte är stabila eller lösliga tillräckligt.	Testa olika konstruktioner i liten skala innan upp-skalning transfektionerna. Se till taggar inte stör strukturen av protein (er) av intresse.
Celler ser grumlig och har en ovanlig färg och / eller lukt.	Celler infekteras med bakterier eller jäst.	Bra steril teknik måste användas vid alla tillfällen. Fumigating de laminarflowhuvar och UV-desinfektion cellodlingsrummet vid infektion bidrar med problemet.
Celler har låg lönsamhet.	Fel pH i media.	Försäkra dig om att kulturer odlas vid 5-8% CO2hela tiden.
	Celler har odlats upp till en densitet över 3,0x10 6 celler / ml.	Celler bör inte vuxit upp till densiteter över 2,5 x 10 6 celler / ml omedelbart före en transfektion och aldrig över 3,0 x 10 6 celler / ml.
Affinitetsrening fungerade inte	Protein (s) inte uttrycks.	Se ovan.
	Reningsförhållanden kan vara fel.	Justera buffertförhållanden (t.ex. hög salthalt, låg salthalt, pH.)

Tabell 1 Felsökning.

System	Fördelar	Nackdelar
E. coli	Snabbexpressionssystem Hög proteinutbyten Inexpensive Lämplig för den prisvärda produktion av isotopmärkta proteiner	Brist på viktiga följeslagare som kan krävas för proteinveckning Brist på många posttranslationella modifieringar Kan sakna co-faktorer som är viktiga för proteinfunktion och / eller komplicerad montering.
P. pastoris	Kan utföra majoriteten av posttranslationella modifieringar Inexpensive	Saknar vissa posttranslationella modifieringar Kan sakna co-faktorer som är viktiga för proteinfunktion och / eller komplicerad montering.
Baculovirus expression i insektsceller	Kan utföra alla posttranslationella modifieringar </ Li> Baculovirus är mindre cytotoxiska än andra virusstammar	Förbereda viruset för transduktion är tidskrävande Viruset är inte stabil och inte kan lagras under långa tidsperioder Insektsceller kan sakna co-faktorer som är viktiga för proteinfunktion och / eller komplicerad montering.
Bioreactors med däggdjurssystem	Kan utföra alla posttranslationella modifieringar Kan ge alla co-faktorer som behövs för proteinfunktion och komplex montering Can kulturceller vid mycket höga densiteter Kan uttrycka alla däggdjursproteiner som kräver komplexa fällbara maskinerier Mycket höga proteinutbyten	Kräver specialiserad personal för att använda bioreaktorn. Dyr utrustning krävs. Optimera uttryck Förhållandes kan vara tidskrävande.
HEK 293F suspensionsceller	Kan utföra alla posttranslationella modifieringar Kan ge alla co-faktorer som behövs för proteinfunktion och komplex montering Kan uttrycka alla däggdjursproteiner som kräver komplexa fällbara maskiner Snabb och intuitiv transfektionsprotokoll Relativt billigt jämfört med bioreaktorer och / eller andra kommersiellt tillgängliga transfektionsreagens.	Även prisvärd, inte så billig som uttryck i bakterier

Tabell 2 Fördelar och nackdelar med huvudsakliga expressionssystem.

Discussion

Vi har utvecklat en enkel och kostnadseffektiv metod (PEI kostar mycket mindre än kommersiellt tillgängliga lipofila transfektionsreagens) för att uttrycka och rena stora mängder av rekombinanta proteiner och fler subenhet komplex från däggdjursceller. Optimal transfektion och uttryck effektivitet kan uppnås om mycket rent plasmid-DNA (260/280 mellan 1,8 och 2,0) används i kombination med PEI som beskrivs i protokollet avsnittet. Celler bör odlas i serum-och antibiotikafritt medium därför steril teknik är absolut nödvändigt för passaging och transfektion av celler i syfte att undvika kostsamma och tidskrävande infektioner. Cellviabilitet bör vara 90% eller högre och kulturer inte får odlas till densiteter större än 2,5 x 10 ⁶ celler / ml omedelbart före en transfektion, eftersom detta kommer att minska proteinavkastning. För en lyckad transfektion bör kulturer bara innehålla enkla eller delande celler. Kluster kan brytas upp av kraftligt virvling 20-30 sek (Figur 5). Förhållandet av varje plasmid som används i sam-transfektion kan varieras av användaren i enlighet med stökiometrin för komplexet som studeras. Expression effektivitet kan optimeras för proteinet av intresse, så att man kan fastställa en lämplig expressionstiden. Rening ska utföras hålla proteinprovet kallt hela tiden för att minska risken för oönskad proteolytisk nedbrytning. Valet av taggar och reningsbuffertar är kritisk, eftersom de kan störa konstruktionselement eller aktiva områden av vissa proteiner, ofta resulterar i minskad löslighet och / eller förlust av enzymatisk aktivitet. Småskaliga transfektioner är särskilt användbara för att testa olika konstruktioner för rening av stora proteinkomplex.

Idag, en stor variation av alternativa metoder är tillgängliga för uttryck av rekombinanta eukaryota proteiner (Tabell 2). Exempelvis Baculovirus uttryck i insektsceller används ofta på grund av dess höga transduktion effektivitet och dess brist på cytotoxicitet i jämförelse med andra virusarter ^6. Dock är processen att göra viruset tidskrävande och dess instabilitet tillåter inte det virus som skall lagras under långa perioder. Å andra sidan, jästexpressionssystem erbjuder möjligheten att odla celler till mycket höga densiteter i jästanken kulturer, vilket resulterar i höga proteinutbyten ^7. Men de fortfarande saknade fullständig mängd posttranslationella modifieringar som erfordras för eukaryota proteiner att vikas korrekt och interagera med sina proteinpartner. HDAC3 exempelvis uttrycks men inte vika i E. coli. Emellertid när den uttrycks i 293F-celler, kunde vi för att rena ett aktivt enzym i komplex med dess sam-repressor (SMRT) och en molekyl av inositoltetrafosfat (IP4) ^8, som inte påträffas i prokaryota celler. Metoden har också gett oss möjlighet att rena och lösa kristallen structure av HDAC1 interagera med MTA1 i NuRD komplexet, som på liknande sätt aktiveras av IP4 ^9. Helst skulle vi alltid vilja uttrycka eukaryota proteiner i sin naturliga, fysiologiska miljön. Däggdjursexpressionssystem som använder HEK 293-EBNA1 celler i bioreaktorer ^10-12 har beskrivits och ger mycket höga nivåer av protein, men dessa kan vara komplicerat att använda.

Vår metod är ett enkelt och lättillgängligt alternativ till uttryck i bakterier, jäst och bioreaktorsystem. Uttrycket Metoden är snabb och kräver inte användning av dyr utrustning, i synnerhet om rullflaska eller-kolv atmosfär ersätts med 5% _CO2 och standard skakande inkubatorer används. Vi har använt dessa protokoll till co-transfektera flera plasmider och rena komplex med upp till fem proteiner med utbyten av> 1 mg / L av kultur. Intressant, hjälper systemet att identifiera stabila väluppfostrade komplex. Exempelvis expression av det binära komplexet av HDAC1 och Sin3A gav begränsade utbyten av protein, men tillägg av SDS3 resulterade i 5-faldigt högre belopp och därmed styr den strukturella biologen i valet av lämpliga konstruktioner och stabila komplex för kristallisering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FreeStyle HEK 293F cells	LifeTechnologies	R790-07
FreeStyle 293 Expression Medium	LifeTechnologies	12338-018
Anti-FLAG M2 Affinity Gel	SIGMA	A220
250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap	Corning	431144
Roller bottles with vented caps	Corning	01836-02
Polyethylenimine, 25 kDa, branched	Sigma-Aldrich	408727	Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4ºC
Mammalian expression vector
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8537
0.22 µm Centrifugal Filter Units	Amicon	UFC30GV00
15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)	Amicon	UFC901008
Superdex  10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17-5175-01