Rekombinant protein uttrykk for strukturbiologi i HEK 293F Suspension Cells: A Novel og tilgjengelig Approach

Introduction

Den raske utviklingen av molekylær cellebiologi og konstant behov for bedre medisiner i medisin har skapt et behov for strukturelle biologer å se på stadig mer komplekse proteinstrukturer. Disse kan ofte kreve spesielle post-translasjonelle modifikasjoner, molekylære anstand og co-faktorer for å støtte sin utstrakte folding og enzymatisk aktivitet. Selv om de aller fleste strukturer er tilstede i Protein Data Bank er blitt oppnådd ved hjelp av bakterielle ekspresjonssystemer, prokaryote celler er ikke i stand til å utføre et stort antall av disse modifikasjonene og mangler mange essensielle eukaryote co-faktorer. Dette kan være et problem for studiet av store multi-subenheten komplekser som aktiveres av små signalmolekyler samt for kjernekraft, celleoverflaten og utskilte proteiner som krever forseggjort folding machineries. En rekke E. coli-stammer har blitt utviklet for å overvinne noen av disse begrensningene ^en. I de senere år har imidlertid bruken av mammalian ekspresjonssystemer har vært økende fordi de pålitelig produsere eukaryote proteiner som ellers er problematisk å uttrykke i andre systemer ^2. I dag er det mulig å oppnå en stabil og transient ekspresjon pattedyrcellelinjer ved en rekke teknikker som spenner fra viral transduksjon til kjemisk-mediert transfeksjon, fysisk gen-overføring, for eksempel elektroporering og direkte injeksjon ^3. Mens alle disse metodene har sine egne fordeler og ulemper, bare et fåtall av dem er egnet for strukturelle studier som enten for dyrt og / eller tidkrevende.

Her beskriver vi en veldig enkel, rask, billig, men likevel svært effektiv metode for å uttrykke protein komplekser for strukturbiologi i henge vokst pattedyrceller. Tilnærmingen bruker transient co-transfeksjon av en Human embryonale Kidney (HEK) cellelinje (f.eks Freestyle HEK 293F celler). Disse cellene har blitt avledet fra HEK 293 cell linje, er tilpasset til å vokse i suspensjonskulturer, og nådde høye tettheter ved hjelp av serum-fritt media (slik som FreeStyle 293 Expression medium). Celler blir så forbigående transfektert ved hjelp av en forgrenet versjon av polyetylenimin (PEI), en billig polymer reagens som er blitt rapportert til å fungere for et stort utvalg av pattedyrceller ved å danne ^fire DNA / PEI-komplekser som kommer inn i vertscellen ved endocytose ^5. Denne fremgangsmåte er egnet for både liten skala (30 ml) og stor-skala (opp til 300 ml), og eksperimenter kan produsere høye nivåer av renset protein-komplekser. Det er spesielt nyttig for å studere proteiner som krever kompliserte foldemaskiner, ko-faktorer eller spesielle post-translasjonelle modifikasjoner som ikke kan utføres av bakterier, gjær-og insektceller.

I denne protokollen presenterer vi uttrykket og rensing av de tre-protein sentral stillaset fra Sin3A transcriptional undertrykkelse kompleks. Denne består av HistoneDeacetylase 1 (HDAC1), lyddemper av Defekt Silencing 3 (SDS3) og Switch uavhengig 3 (Sin3A). Det rensede kompleks brukes for high-throughput krystallisering forsøk.

Protocol

MERK: Protokollen er egnet for noe omfang av uttrykk, derfor volum og mengder av reagenser skal skaleres proporsjonalt. En egnet pattedyr ekspresjonsvektor må brukes for denne protokoll. Her har vi brukt et modifisert pcDNA 3.1 ekspresjonsvektor som enkelt gjør det mulig å inkludere eller utelukke en affinitet signal avhengig av valg av restriksjonsenzymer som brukes i klonings (figur 1). Den følgende protokoll beskriver en storskala transfeksjon.

1. Large Scale Kultur / Transfeksjon i en L Roller Flasker

Vokse og opprettholde HEK293F hengetilpassede celler i henhold til standard protokoller. Vanligvis startkulturer på mellom 30 og 100 ml er dyrket i 250 ml koniske cellekultur kolber.

1. Seed celler 0.5 x 10 ⁶ celler / ml til et endelig volum på 300 ml i hver flaske 1 L valsen.
   MERK: rulleflasker romme et minimum av 150 ml til maksimalt300 ml suspensjonskultur. For større skala transfections bruke flere flasker.
2. Inkuber i 24 timer på en orbital risteinkubator ved 37 ° C, 120 rpm, og 5% _CO2 inntil cellene nå en tetthet på 1,0 x 10 ⁶ celler / ml (celler skal deles omtrent hver 24 time).
3. Pipetter en total av 300 mikrogram av filter-sterilisert DNA (se tilleggsmetode) i 30 ml PBS og virvle kraftig i 3 sek.
   MERK: Bruk en totalt 1 mikrogram av DNA per million transfekterte celler. Hvis to eller flere plasmider som skal ko-transfektert redusere mengden av hver slik at forholdet av DNA til celler forblir konstant.
4. Tilsett 1,2 ml av 0,5 mg / ml filtersterilisert PEI til PBS / DNA-løsning og vortex kraftig i 3 sek.
5. Inkuber blandingen ved RT i 20 min.
6. Tilsett DNA / PEI blanding til cellene - som skal være i en tetthet på 1 x 10 ⁶ celler / ml (trinn 1.3).
7. Etter ko-transfeksjon, inkubere cellenei en orbital risteinkubator i ytterligere 48 timer ved 37 ° C, 120 rpm, og 5% _CO2.
8. Slakte intracellulære proteiner ved sentrifugering ved 3000 xg i celler i 5 min, og pelleten lagres ved -80 ° C.
   MERK: Alternativt bruke en standard (ikke-CO ₂₎ risteinkubator, hvis atmosfæren over kulturen blir erstattet med 5% CO ₂ og flasken lokket er forseglet. Atmosfæren må bli erstattet ved hver passasje (normalt etter 2 dager).

2. Protein-kompleks Rensing fra Whole Cell Extract

Denne protokollen er optimalisert for rensing av atom komplekser som bruker merket flagg-proteiner.

1. Opptining cellepelleten til ~ 40 ml av pre-kjølt lyseringsbuffer (100 mM kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glyserol, 0,3% Triton X-100, proteaseinhibitorer) per L av kulturen.
2. Re-suspendere pellet ved å pipettere opp og ned flere ganger (for å unngå skumdannelse, ikke vortex). Grundig re-suspendere celler ved hjelp av et glass homogenisator. Sonicate for tre sykluser (15 sek på, 15 sek av). Sentrifuger ved 30000 xg i 25 min ved 4 ° C og beholde supernatanten.
3. Stabilisere 1,25 ml anti-flag agarose pakket harpiks pr liter av kulturen ved å vaske harpiksen tre ganger med likevektsbufferen (100 mM kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5).
4. Inkuber hele celleekstrakt fra trinn 2.3 med affinitets-harpiks i en eller flere av 50 ml sentrifugerør og forsiktig rotere prøven i 30-120 min ved 4 ° C.
5. Sentrifuger ved 3000 x g i 1 min ved 4 ° C, supernatanten forkast.
6. Vask harpiksen med 45 ml av pre-avkjølt buffer 1 (100 mM kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glyserol, 0,3% Triton X-100). Sentrifuger ved 3000 x g i 1 min, og supernatanten kastes.
7. Gjenta trinn 2.7 ved hjelp av høy saltbuffer (300 mM kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glyserol), etterfulgt av lav saltbuffer (50 mM kaliumacetat, 50 mM Tris pH 70,5, 5% glyserol) og TEV Cleavage buffer (50 mM kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP).
   MERK: Sørg for hver vask er kort dvs. tilstrekkelig til fullt re-suspendere harpiks og ikke lenger.
8. Samle en 10 ul prøve av harpiks og fortynn til 1 volum av 2x protein loading buffer for analyse (bundet protein-kontroll). Ikke bruk reduksjonsmidler, for å unngå å slippe antistoff fra harpiksen.
9. Re-suspendere resin inn 8-10 ml av pre-kjølt TEV cleavage buffer og overføring til en 15 ml sentrifugerør.
10. Legg ~ 40 ug TEV protease (fra lager til 1 mg / ml) pr L av opprinnelige kultur og bland godt ved å pipettere opp og ned flere ganger.
11. Erstatt røret atmosfære med 100% N ₂ gass for å forhindre oksydasjon protein.
12. Forsiktig rotere O / N ved 4 ° C.
13. Sentrifuger ved 3000 xg i 10 min. Overfør supernatanten til et ultra sentrifugal filter med en passende molekylvekt cut-off og konsentrerened til 500 mL.
14. Samle en 10 ul prøve av det konsentrerte protein og fortynnes inn i en volum på 2x protein loading buffer for analyse. (TEV eluatet kontroll).
15. Samle en 10 ul prøve av harpiksen og fortynn til en volum på 2x protein lastebuffer for analyse. Ikke bruk reduksjonsmidler for å unngå frigjøring av store mengder antistoff fra harpiksen. (Post-TEV harpiks kontroll).
16. Stabilisere den størrelseseksklusjon kromatografikolonne med gelfiltrerings-buffer (50 mM kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP).
17. Filtrer proteinet gjennom et 0,22 mikrometer filter
18. Load prøven i kolonnen og samle fraksjonene.
19. Kjør prøver fra trinn 2.9, 2.15 og 2.16 og gelfiltreringsmetodene fraksjoner fra trinn 2.19 på en SDS-PAGE og Coomassie flekken for analyse.
    NB: Det er tilrådelig å kjøre en SDS-PAGE av prøver fra trinn 2,9, 2,15 og 2,16 før gelfiltrering for å bekrefte ekspresjon av målproteinet.

Representative Results

Her vises en 2 L (8 x 250 ml kulturer) transient ko-transfeksjon og rensing av HDAC1, SDS3, Sin3A ternært kompleks. HDAC1 og SDS3 samhandle med Sin3A gjennom HDAC-interaksjon domene (HID) av Sin3A. En typisk rense gir opp til 1 mg av komplekse per liter kultur.

Figur 1. Skjematisk av den modifiserte pcDNA 3.1 ekspresjonsvektor. Plasmidet ble spaltet med EcoRV og EcoRI for å inkludere affinitets-tag og TEV spaltningssete på aminoenden av Sin3A. Å klone ukodede versjoner av HDAC1 og SDS3, ble vektoren fordøyd med KpnI og EcoRI.

Figur 2. SDS-PAGE viser det første trinn av rensingen. The "bundet protein" lane viser komplekset bundet til affinitets-harpiks. Etter TEV fordøyelsen, er merkelappen stede på Sin3A-HID spaltes av, og komplekset elueres fra harpiksen, som vist i de andre og tredje baner av gelen.

Figur 3. Kromatogram av protein-komplekset renset ved hjelp av gelfiltrerings-kromatografi. Legg merke til at den rene komplekset eluerte i hulromsvolumet, fordi den danner en dimer i oppløsning.

Figur 4. SDS-PAGE som viser de fraksjoner av gelfiltrering er vist på figur 3.

Figur 5. trypanblått beiset HEK 293F celler ved 2.3x10 ⁶ celler / ml klar til å bli tilført. Cells skal bare være til stede som singel eller dele celler, mens store klynger kan deles opp etter kraftig risting i ca 25 sek.

Problem	Mulige årsaker	Handling
Lav protein yield.	Lavt antall celler transfektert.	Kontroller at celletettheten er tilnærmet 1,0 x 10 6 før tilsetning av transfeksjon reaksjonsblandingen til kulturen.
	Celler kan ha blitt subkultiveres for mange ganger.	Bruk friske aksje celler etter ca 90 passaldre.
	DNA kan bli degradert eller har en høy mengde av urenheter.	Kontroller at plasmid DNA som brukes har en 260/280 ratio mellom 1,8 og 2,0. Kjøring av DNA på en agarosegel er tilrådelig å vurdere kvaliteten.
	Protein (e) som blir uttrykt er ikke stabil eller løselig nok.	Test ulike konstruksjoner i liten skala før opp-skalering transfections. Pass på at kodene ikke forstyrre strukturen av proteinet (r) av interesse.
Cellene ser overskyet og har en uvanlig farge og / eller lukt.	Cellene er infisert med bakterier eller gjær.	God steril teknikk må brukes til enhver tid. FUMIGATING de laminære strømningshetter og UV-desinfisering av cellekultur rommet i tilfelle av infeksjon med hjelper problemet.
Celler har lav levedyktighet.	Feil pH i media.	Forsikre deg om at kulturer er dyrket på 5-8% CO 2til enhver tid.
	Celler som er blitt dyrket opp til en tetthet over 3.0x10 6 celler / ml.	Cellene bør ikke vokst opp til tettheter over 2,5 x 10 6 celler / ml umiddelbart før transfeksjon og aldri over 3,0 x 10 6 celler / ml.
Affinitetsrensing fungerte ikke	Protein (e) blir ikke uttrykt.	Se ovenfor.
	Rensing forhold kan være galt.	Juster buffer-betingelser (for eksempel høy salt, lav salt, pH).

Tabell 1. Feilsøking.

System	Fordeler	Ulemper
E. coli	Fastekspresjonssystem Høye proteinutbytter Billig Egnet for rimelig produksjon av isotopically merkede proteiner	Mangel på viktige anstand som kan være nødvendig for proteinfolding Mangel på mange innlegg translasjonelle modifikasjoner Kan mangle co-faktorer som er viktige for protein funksjon og / eller komplekse montering.
P. pastoris	Kan utføre de fleste av post translasjonelle modifikasjoner Billig	Mangler noen post-translasjonelle modifikasjoner Kan mangle co-faktorer som er viktige for protein funksjon og / eller komplekse montering.
Baculovirus uttrykk i insektsceller	Kan utføre alle innlegg translasjonelle modifikasjoner </ Li> Baculovirus er mindre cytotoksisk enn andre virusstammer	Forbereder viruset for transduksjon er tidkrevende Viruset er ikke stabile, og kan ikke lagres i lange perioder av gangen Insektceller kan mangle co-faktorer som er viktige for protein funksjon og / eller komplekse montering.
Bioreaktorer med pattedyr systemer	Kan utføre alle innlegg translasjonelle modifikasjoner Kan tilby alle co-faktorer som trengs for protein funksjon og komplisert montering Kan kultur celler ved svært høye tettheter Kan uttrykke alle pattedyr proteiner som krever komplekse folding machineries Svært høye proteinutbytter	Krever spesialiserte medarbeidere til å bruke bioreaktor. Kostbart utstyr kreves. Optimalisere uttrykk tilstands kan være tidkrevende.
HEK 293F henge celler	Kan utføre alle innlegg translasjonelle modifikasjoner Kan tilby alle co-faktorer som trengs for protein funksjon og komplisert montering Kan uttrykke alle pattedyr proteiner som krever kompleks folding maskiner Rask og intuitiv transfeksjon protokollen Relativt billig sammenlignet med bioreaktorer og / eller andre kommersielt tilgjengelige reagenser transfeksjon.	Selv rimelige, ikke så billig som uttrykk i bakterier

Tabell 2. Fordeler og ulemper ved hoved ekspresjonssystemer.

Discussion

Vi har utviklet en enkel og kostnadseffektiv metode (PEI koster mye mindre enn kommersielt tilgjengelige lipofile transfeksjon reagenser) for ekspresjon og rensing av store mengder av rekombinante proteiner og multi-subenheten komplekser fra pattedyrceller. Optimal transfeksjon og ekspresjon effektivitet kan oppnås hvis høyrent plasmid-DNA (260/280 mellom 1,8 og 2,0) er brukt i kombinasjon med PEI som beskrevet i protokollen delen. Cellene må dyrkes i serum-og antibiotika-fritt medium, derfor, steril teknikk er strengt nødvendig for aging og transfeksjon av celler for å unngå kostbare og tidkrevende infeksjoner. Celle levedyktighet bør være 90% eller høyere og kulturer bør ikke vokst til tettheter større enn 2,5 x 10 ⁶ celler / ml umiddelbart før en transfeksjon, da dette vil redusere proteinmengde. For en vellykket transfeksjon, bør kulturer bare inneholde én eller dele celler. Klynger kan bli brutt opp av handlekraftous virvling 20 til 30 sek (figur 5). Forholdet mellom hvert plasmid brukt i ko-transfeksjon kan varieres av brukeren i henhold til støkiometrien av komplekset som blir studert. Expression effektivitet kan optimaliseres for protein av interesse, slik at en passende uttrykk tid kan etableres. Rensing bør utføres holde prøven kald protein til alle tider for å redusere risikoen for uønsket proteolytisk nedbrytning. Valget av koder og rensing buffere er kritisk, siden de kan interferere med strukturelle elementer eller aktive områder av visse proteiner, som ofte resulterer i redusert oppløselighet, og / eller tap av enzymatisk aktivitet. Småskala transfections er spesielt nyttig for å teste forskjellige konstruksjoner for rensing av store proteinkomplekser.

I dag er et stort utvalg av alternative metoder er tilgjengelige for ekspresjon av rekombinante eukaryotiske proteiner (tabell 2). For eksempel Baculovirus ekspresjon i insektceller er mye brukt på grunn av sin høye effektivitet transduksjon og dens mangel på cytotoksisitet i forhold til andre virale arter ^6. Imidlertid er prosessen med å gjøre viruset tidkrevende og dens ustabilitet ikke tillater at viruset skal bli lagret i lange perioder. På den annen side, gjær-ekspresjonssystemer tilbyr muligheten for voksende celler til meget høye tettheter i fermenterings-kulturer, noe som resulterer i høye utbytter ⁷ protein. Men de mangler fortsatt full rekke post-translasjonelle modifikasjoner kreves for eukaryote proteiner for å kaste riktig og samhandle med sine protein partnere. HDAC3, for eksempel, er uttrykt, men ikke kaste i E. coli. Imidlertid, når det uttrykkes i 293F-celler, var vi i stand til å rense et aktivt enzym i kompleks med sitt ko-repressor (SMRT) og et molekyl av inositol tetra (IP4) ^8, som ikke finnes i prokaryote celler. Denne metoden har også tillatt oss å rense og løse krystall structure av HDAC1 samspill med MTA1 i Nurd komplekset, som er tilsvarende aktiveres av IP4 ^ni. Ideelt sett ville vi alltid liker å uttrykke eukaryote proteiner i deres naturlige, fysiologiske miljø. Pattedyr ekspresjonssystemer som anvender HEK 293-celler EBNA1 i bioreaktorer ^10-12 er blitt beskrevet og gi svært høye nivåer av protein, men disse kan være kompliserte å bruke.

Vår fremgangsmåte er en enkel og tilgjengelig alternativ til ekspresjon i bakterier, gjær og reaktorsystemer. Uttrykket metoden er hurtig og krever ikke bruk av kostbart utstyr, spesielt hvis valsen flaske eller kolbe atmosfæren erstattes med 5% _CO2 og standard risting inkubatorer benyttes. Vi har brukt disse protokollene å co-transfektere flere plasmider og rense komplekser med opptil fem proteiner med avkastning av> 1 mg / L av kultur. Interessant, hjelper systemet identifikasjon av stabile vel-artet komplekser. For eksempel, expression av det binære kompleks av HDAC1 og Sin3A ga begrenset utbytte av protein, men tillegg av SDS3 resulterte i 5 ganger høyere mengder og dermed styrer strukturelle biolog i valg av egnede konstruksjoner og stabile komplekser for krystallisering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FreeStyle HEK 293F cells	LifeTechnologies	R790-07
FreeStyle 293 Expression Medium	LifeTechnologies	12338-018
Anti-FLAG M2 Affinity Gel	SIGMA	A220
250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap	Corning	431144
Roller bottles with vented caps	Corning	01836-02
Polyethylenimine, 25 kDa, branched	Sigma-Aldrich	408727	Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4ºC
Mammalian expression vector
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8537
0.22 µm Centrifugal Filter Units	Amicon	UFC30GV00
15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)	Amicon	UFC901008
Superdex  10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17-5175-01