Rekombinant protein Udtryk for Strukturel Biologi i HEK 293F suspensionsceller: A Novel og Adgang Approach

Introduction

Den hurtige fremskridt molekylær cellebiologi og det konstante behov for bedre lægemidler i medicin har skabt et behov for strukturelle biologer til at se på stadig mere komplekse proteinstrukturer. Disse kan ofte kræver særlige post-translationelle modifikationer, molekylchaperoner og co-faktorer til støtte for deres udførlige foldning og enzymatisk aktivitet. Mens størstedelen af ​​strukturer til stede i Protein Data Bank er blevet opnået ved anvendelse af bakterielle ekspressionssystemer, prokaryoter ikke er i stand til at udføre et stort antal af disse ændringer og mangler mange vigtige eukaryote co-faktorer. Dette kan være et problem for studiet af store multi-subunit-komplekser, der aktiveres af små signalmolekyler samt for kernekraft, celleoverfladen og udskilte proteiner, der kræver omfattende folde machineries. En række E. coli-stammer er blevet udviklet til at overvinde nogle af disse begrænsninger ^1. I de senere år, men brugen af ​​mammalian ekspressionssystemer har været stigende, fordi de pålideligt producerer eukaryote proteiner, som ellers er problematisk at udtrykke i andre systemer ^2. Dag er det muligt at opnå stabile og forbigående mammale udtryk cellelinier gennem en række teknikker, der spænder fra virustransduktion til kemisk-medieret transfektion, fysisk genoverførsel, såsom elektroporering og direkte indsprøjtning ^3. Mens alle disse metoder har deres eget sæt af fordele og ulemper, men kun få af dem er egnede til strukturelle studier, der enten er for dyre og / eller tidskrævende.

Her beskriver vi en meget enkel, hurtig, billig men særdeles effektiv metode til at udtrykke protein-komplekser til strukturel biologi i pattedyrceller suspension dyrket. Tilgangen bruger forbigående co-transfektion af en human embryonal Nyre (HEK) cellelinje (f.eks Freestyle HEK 293F celler). Disse celler er blevet afledt af HEK 293 cell linje, der er tilpasset til at vokse i suspensionskulturer, nåede høje densiteter ved hjælp af serum-frie medier (såsom FreeStyle 293 Expression medium). Cellerne bliver derefter kortvarigt transficeret ved hjælp af en forgrenet version af polyethylenimin (PEI), en billig polymert reagens, som er blevet rapporteret til at fungere i en lang række pattedyrceller ⁴ ved dannelse af DNA / PEI-komplekser, der kommer ind værtscellen ved endocytose ^5. Denne metode er velegnet til både små (30 ml) og store (op til 300 ml) eksperimenter og kan producere høje niveauer af oprenset protein-komplekser. Det er især nyttigt til at studere proteiner, der kræver komplekse folde machineries, co-faktorer eller særlige post-translationelle modifikationer, som ikke kan udføres af bakterier, gær og insektceller.

I denne protokol præsenterer vi ekspression og oprensning af de tre protein central stillads fra Sin3A transkriptionel repression kompleks. Denne består af histonDeacetylase 1 (HDAC1), undertrykker af Defekt Silencing 3 (SDS3) og Switch-uafhængig 3 (Sin3A). Det rensede kompleks anvendes til high-throughput udkrystallisering forsøg.

Protocol

BEMÆRK: Protokollen er egnet til enhver omfanget af udtryk, derfor mængder og mængder af reagenser skal skaleres proportionalt. En egnet mammal ekspressionsvektor skal anvendes til denne protokol. Her brugte vi en modificeret pcDNA 3.1 ekspressionsvektor som bekvemt tillader optagelse eller udelukkelse af et affinitetsmærke afhængig af valget af anvendte restriktionsenzymer i kloning (Figur 1). Følgende protokol beskriver en stor skala transfektion.

1. Large Scale Kultur / Transfection i 1 L rullekolber

Vokse og opretholde HEK293F suspension tilpassede celler ifølge standardprotokoller. Typisk starterkulturer på mellem 30 og 100 ml dyrkes i 250 ml koniske celledyrkningskolber.

1. Seed-celler ved 0,5 x 10 ⁶ celler / ml i et slutvolumen på 300 ml i hver 1 L rulleflaske.
   BEMÆRK: Rullekolber rumme mindst 150 ml til maksimalt300 ml suspension kultur. For større skala transfections bruge flere flasker.
2. Der inkuberes i 24 timer i en orbitalryster inkubator ved 37 ° C, 120 rpm og 5% _CO2, indtil cellerne når en densitet på 1,0 x 10 ⁶ celler / ml (celler, bør dele cirka hver 24. time).
3. Pipette alt 300 ug filtersteriliseret DNA (se supplerende metode) i 30 ml PBS og vortex kraftigt i 3 sek.
   BEMÆRK: Brug et samlet beløb på 1 ug DNA per million transficerede celler. Hvis to eller flere plasmider er til cotransficeres reducere mængden af ​​hver, således at forholdet af DNA til celler forbliver konstant.
4. Tilsæt 1,2 ml 0,5 mg / ml filtersteriliseret PEI til PBS / DNA-opløsning og vortex kraftigt i 3 sek.
5. Inkuberes blandingen ved stuetemperatur i 20 minutter.
6. Tilføj DNA / PEI blandes til cellerne - som bør være ved en densitet på 1 x 10 ⁶ celler / ml (trin 1.3).
7. Efter co-transfektion, inkuberes cellernei en orbitalryster inkubator i yderligere 48 timer ved 37 ° C, 120 rpm og 5% _CO2.
8. Harvest intracellulære proteiner ved centrifugering celler ved 3.000 xg i 5 minutter og opbevares pellet ved -80 ° C.
   BEMÆRK: Alternativt kan du bruge et standard (ikke-CO ₂₎ rysteinkubator, hvis atmosfæren over kulturen er erstattet med 5% _CO2 og flasken låget er lukket. Atmosfæren skal udskiftes ved hver passage (normalt hver 2 dage).

2. Protein-kompleks Oprensning fra helcelleekstrakt

Denne protokol er optimeret til oprensning af nukleare komplekser ved hjælp af flag-mærkede proteiner.

1. Optøning cellepellet i ~ 40 ml forkølet lysisbuffer (100 mM kaliumacetat, 50 mM Tris, pH 7,5, 5% glycerol, 0,3% Triton X-100, proteaseinhibitorer) pr liter kultur.
2. Re-suspendere pellet ved pipettering op og ned flere gange (for at undgå skumdannelse, ikke vortex). Grundigt re-suspendere celler ved hjælp af en glashomogenisator. Sonikeres i 3 cyklusser (15 sek på, 15 sek OFF). Der centrifugeres ved 30.000 xg i 25 minutter ved 4 ° C og fastholde supernatanten.
3. Ækvilibrer 1,25 ml af anti-flag, pakket agarose harpiks pr liter kultur ved at vaske tre gange med harpiks ækvilibreringsbuffer (100 mM kaliumacetat, 50 mM Tris, pH 7,5).
4. Inkubér helcelleekstrakt fra trin 2.3 med affinitet harpiks i én eller flere 50 ml centrifugerør og forsigtigt rotere prøven i 30-120 minutter ved 4 ° C.
5. Centrifuger ved 3000 x g i 1 min ved 4 ° C, kasseres supernatanten.
6. Vask harpiksen med 45 ml forkølet buffer 1 (100 mM kaliumacetat, 50 mM Tris, pH 7,5, 5% glycerol, 0,3% Triton X-100). Centrifugeres ved 3.000 x g i 1 min og kassér supernatanten.
7. Gentag trin 2.7 ved hjælp af høj-salt buffer (300 mM kaliumacetat, 50 mM Tris, pH 7,5, 5% glycerol), efterfulgt af en lav salt buffer (50 mM kaliumacetat, 50 mM Tris, pH 70,5, 5% glycerol) og TEV spaltningspuffer (50 mM kaliumacetat, 50 mM Tris, pH 7,5, 0,5 mM TCEP).
   BEMÆRK: Sørg for hver vask er kortfattet dvs tilstrækkelig til fuldt ud at re-suspendere harpiksen og ikke længere.
8. Saml en 10 pi prøve af harpiks og fortyndes i 1 volumen 2x protein påføringsbuffer til analyse (proteinbundet kontrol). Må ikke anvendes reduktionsmidler for at undgå frigørelse af antistoffet fra harpiksen.
9. Re-suspendere harpiksen i 8-10 ml af præ-kølet TEV spaltning buffer og overføres til et 15 ml centrifugerør.
10. Tilføj ~ 40 ug af TEV-protease (fra lager ved 1 mg / ml) pr L af oprindelig kultur og bland godt ved pipettering op og ned adskillige gange.
11. Udskift rør atmosfære med 100% _N2 gas for at forhindre proteinoxidation.
12. Forsigtigt dreje O / N ved 4ºC.
13. Centrifugeres ved 3.000 x g i 10 min. Supernatanten overføres til en ultra centrifugal filter med en passende molekylvægt cut-off og koncentrerened til 500 pi.
14. Saml en 10 pi prøve af det koncentrerede protein og fortyndes i 1 volumen 2x protein loadingbuffer til analyse. (TEV eluat kontrol).
15. Saml en 10 pi prøve af harpiksen og fortyndes i 1 volumen 2x protein loadingbuffer til analyse. Brug ikke reduktionsmiddel for at undgå frigivelse af store mængder antistof fra harpiksen. (Post-TEV harpiks kontrol).
16. Ækvilibrer gelpermeationskromatografien kolonne med gelfiltrering puffer (50 mM kaliumacetat, 50 mM Tris, pH 7,5, 0,5 mM TCEP).
17. Filtreres proteinet gennem et 0,22 um filter
18. Indlæs prøven i kolonnen og indsamle fraktioner.
19. Kør prøver fra trin 2.9, 2.15 og 2.16 og gelfiltrering fraktioner fra trin 2,19 på en SDS-PAGE og Coomassie-farvning til analyse.
    BEMÆRK: Det er tilrådeligt at køre en SDS-PAGE af prøver fra trin 2,9, 2,15 og 2,16 før gelfiltrering at bekræfte ekspressionen af ​​målproteinet.

Representative Results

Her viser vi en 2 L (8 x 250 ml kulturer) forbigående co-transfektion og oprensning af HDAC1, SDS3, Sin3A ternære kompleks. HDAC1 og SDS3 interagere med Sin3A gennem HDAC-interaktion domæne (HID) i Sin3A. En typisk oprensningsudbytter op til 1 mg kompleks per liter kultur.

Figur 1. Skematisk af den modificerede pcDNA 3.1 ekspressionsvektor. Plasmidet blev fordøjet med EcoRV og EcoRI til at omfatte affinitet-taggen og TEV-spaltningssted på aminoterminalen af Sin3A. Til kloning ukodede versioner af HDAC1 og SDS3 blev vektoren fordøjet med Kpnl og EcoRI.

Figur 2. SDS-PAGE viser det første trin i oprensningen. Den "bundet protein" bane viser komplekset bundet til affinitetsharpiksen. Efter TEV fordøjelse tagget stede på Sin3A-HID fraspaltet og komplekset elueres fra harpiksen, som vist i den anden og tredje baner af gelen.

Figur 3. Kromatogram af protein-kompleks oprenset ved hjælp af gelpermeationskromatografi. Bemærk, at den rene kompleks eluerede i det tomme volumen, fordi det danner en dimer i opløsning.

Figur 4. SDS-PAGE viser fraktioner af gelfiltrering i figur 3 viste.

Figur 5. trypanblå bejdset HEK 293F celler ved 2.3x10 ⁶ celler / ml klar til at blive transficeret. Celler bør kun være til stede som en enkelt eller delende celler, mens store klynger kan blive brudt op ved kraftig vortex ca. 25 sek.

Problem	Mulige årsager	Handling
Lav proteinudbytte.	Lavt antal af celler transficeret.	Sørg celledensitet er ca 1,0 x 10 6 før tilsætning af transfektion reaktionsblandingen til kulturen.
	Cellerne kunne have været subkultur for mange gange.	Brug friske stock celler efter ca 90 passaldre.
	DNA'et kan nedbrydes eller har en stor mængde af urenheder.	Sørg for, at plasmid-DNA, der anvendes, har en 260/280 forholdet mellem 1,8 og 2,0. Kørsel af DNA på en agarosegel er tilrådeligt at vurdere dens kvalitet.
	Protein (r) udtrykkes ikke er stabil eller opløselig nok.	Afprøve forskellige konstruktioner i lille skala før opskalering transfektionerne. Sørg tags ikke forstyrrer strukturen af ​​proteinet (r) af interesse.
Celler ser overskyet og har en usædvanlig farve og / eller lugt.	Celler inficeret med bakterier eller gær.	God steril teknik skal anvendes på alle tidspunkter. Gasning af de laminare flow hætter og UV-desinfektion cellekulturen rum i tilfælde af infektion hjælper indeholdende problemet.
Celler har lav levedygtighed.	Forkert pH i medierne.	Sørg kulturer dyrkes ved 5-8% af CO 2på alle tidspunkter.
	Cellerne er blevet dyrket til en densitet i 3.0x10 6 celler / ml.	Celler bør ikke vokset op til densiteter over 2,5 x 10 6 celler / ml umiddelbart før en transfektion og aldrig over 3,0 x 10 6 celler / ml.
Affinitetsoprensning fungerede	Protein (s) bliver ikke udtrykt.	Se ovenfor.
	Renseanlæg betingelser kan være forkert.	Juster bufferbetingelser (fx højt saltindhold, lavt saltindhold, pH).

Tabel 1. Fejlfinding.

System	Fordele	Ulemper
E. coli	Hurtigekspressionssystem Høje proteinudbytter Billig Egnet til overkommelige produktion af isotopmærkede proteiner	Mangel på vigtige chaperoner, der kan kræves for protein foldning Mangel på mange posttranslationelle modifikationer Kan mangle co-faktorer, der er vigtige for proteinernes funktion og / eller komplekst.
P. pastoris	Kan udføre størstedelen af ​​post-translationelle modifikationer Billig	Mangler nogle post-translationelle modifikationer Kan mangle co-faktorer, der er vigtige for proteinernes funktion og / eller komplekst.
Baculovirusekspression i insektceller	Kan udføre alle post translationelle modifikationer </ Li> Baculovirus er mindre cytotoksisk end andre virusstammer	Forberedelse af virus i transduktionen er tidskrævende Virussen er ikke stabilt og ikke kan opbevares i længere perioder Insektceller kan mangle co-faktorer, der er vigtige for protein-funktion og / eller komplekst.
Bioreaktorer med pattedyrsystemer	Kan udføre alle post translationelle modifikationer Kan give alle co-faktorer, der er nødvendige for protein funktion og kompleks samling Kan kulturen celler ved meget høje tætheder Kan udtrykke alle pattedyrproteiner, der kræver komplekse folde machineries Meget høj proteinudbytter	Kræver specialiseret personale til at bruge bioreaktoren. Dyrt udstyr er påkrævet. Optimering udtryk tilstandr kan være tidskrævende.
HEK 293F suspensionsceller	Kan udføre alle post translationelle modifikationer Kan give alle co-faktorer, der er nødvendige for protein funktion og kompleks samling Kan udtrykke alle pattedyrproteiner, der kræver kompleks foldning maskiner Hurtig og intuitiv transfektionsprotokol Relativt billige sammenlignet med bioreaktorer og / eller andre kommercielt tilgængelige transfektionsreagenser.	Selv overkommelige, ikke så billig som udtryk i bakterier

Tabel 2. Fordele og ulemper ved de vigtigste ekspressionssystemer.

Discussion

Vi har udviklet en enkel og omkostningseffektiv metode (PEI koster meget mindre end kommercielt tilgængelige lipofile transfektionsreagenser) til ekspression og oprensning af store mængder af rekombinante proteiner og multi-subunit-komplekser fra pattedyrceller. Kan nås Optimal transfektion og ekspression effektivitet, hvis meget rent plasmid-DNA (260/280 mellem 1,8 og 2,0) anvendes i kombination med PEI som beskrevet i protokollen sektion. Celler skal dyrkes i serum-og antibiotika-fri medier derfor steril teknik er strengt nødvendigt til passage og transfektion af celler med henblik på at undgå kostbare og tidskrævende infektioner. Cellelevedygtigheden skal være 90% eller højere og kulturer bør ikke vokset til densiteter større end 2,5 x 10 ⁶ celler / ml umiddelbart før en transfektion, da dette vil reducere proteinudbytte. For en vellykket transfektion bør kulturer kun indeholde en enkelt eller delende celler. Klynger kan brydes op af vigørskellige vortexblanding 20 til 30 sekunder (figur 5). Forholdet mellem hvert plasmid anvendt i co-transfektion kan varieres af brugeren i overensstemmelse med støkiometrien af ​​komplekset blev undersøgt. Expression effektivitet kan optimeres for proteinet af interesse, så der kan etableres et passende udtryk tid. Oprensning bør udføres holde proteinprøven koldt på alle tidspunkter for at reducere risikoen for uønsket proteolytisk nedbrydning. Valget af tags og rensning buffere er kritisk, da de kan forstyrre strukturelle elementer eller aktive steder af visse proteiner, der ofte resulterer i reduceret opløselighed og / eller tab af enzymatisk aktivitet. Lille skala transfektioner er særligt nyttige til at teste forskellige konstruktioner til oprensning af store protein-komplekser.

Dag, en lang række alternative metoder er tilgængelige for ekspression af rekombinante eukaryote proteiner (tabel 2). For eksempel Baculovirus ekspression i insektceller er almindeligt anvendt på grund af sin høje transduktion effektivitet og dens mangel på cytotoksicitet i sammenligning med andre virale arter ^6. Men fremgangsmåden til fremstilling af virussen er tidskrævende og dens ustabilitet ikke tillader virus, der skal opbevares i lange perioder. På den anden side, gær ekspressionssystemer giver muligheden for at dyrke celler til meget høje tætheder i fermentorbetingelser kulturer, hvilket resulterer i høje proteinudbytter ^7. Men de mangler stadig den fulde vifte af post-translationelle modifikationer, der kræves for eukaryote proteiner til at folde korrekt og interagere med deres protein partnere. HDAC3, for eksempel udtrykkes, men ikke fold i E. coli. Men når det udtrykkes i 293F-celler, var vi i stand til at oprense et aktivt enzym i kompleks med dets co-repressor (SMRT) og et molekyle inositol tetraphosphat (IP4) ^8, som ikke er fundet i prokaryote celler. Denne metode har også tilladt os at rense og løse krysructure af HDAC1 interagere med MTA1 i NuRD kompleks, som ligeledes aktiveres af IP4 ^9. Ideelt set ville vi altid gerne udtrykke eukaryote proteiner i deres naturlige, fysiologiske miljø. Mammale ekspressionssystemer anvender HEK 293-EBNA1 celler i bioreaktorer ^10-12 er blevet beskrevet og give meget høje niveauer af protein, men disse kan være vanskelig at anvende.

Vores metode er en enkel og tilgængelig alternativ til udtryk i bakterier, gær og bioreaktor-systemer. Udtrykket metode er hurtig og ikke kræver brug af dyrt udstyr, især hvis rullen flaske eller kolbe atmosfære er erstattet med 5% CO ₂ og standard rystende inkubatorer anvendes. Vi har brugt disse protokoller til at co-transfektion flere plasmider og rense komplekser med op til fem proteiner med udbytter på> 1 mg / l af kulturen. Interessant, at systemet hjælper identifikation af stabile velopdragne komplekser. For eksempel abpression af den binære kompleks af HDAC1 og Sin3A gav begrænsede udbytter af protein, men tilsætning af SDS3 resulterede i 5 gange højere mængder og dermed styrer den strukturelle biolog i valg af egnede konstruktioner og stabile komplekser til krystallisation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FreeStyle HEK 293F cells	LifeTechnologies	R790-07
FreeStyle 293 Expression Medium	LifeTechnologies	12338-018
Anti-FLAG M2 Affinity Gel	SIGMA	A220
250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap	Corning	431144
Roller bottles with vented caps	Corning	01836-02
Polyethylenimine, 25 kDa, branched	Sigma-Aldrich	408727	Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4ºC
Mammalian expression vector
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8537
0.22 µm Centrifugal Filter Units	Amicon	UFC30GV00
15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)	Amicon	UFC901008
Superdex  10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17-5175-01