Introduction
आणविक कोशिका जीव विज्ञान के तेजी से प्रगति और चिकित्सा में सुधार दवाओं के लिए लगातार जरूरत संरचनात्मक जीव तेजी से और अधिक जटिल प्रोटीन संरचनाओं को देखने के लिए एक जरूरत बन गया है. ये अक्सर अपने विस्तृत तह और enzymatic गतिविधि का समर्थन करने के लिए विशेष बाद translational संशोधनों, आणविक संरक्षिकाओं और सह कारकों की आवश्यकता होती है सकते हैं. बैक्टीरियल अभिव्यक्ति सिस्टम का उपयोग कर प्राप्त किया गया है प्रोटीन डाटा बैंक में मौजूद संरचनाओं के विशाल बहुमत Whilst, प्रोकीर्योट्स इन संशोधनों की एक बड़ी संख्या में प्रदर्शन करने में असमर्थ हैं और कई आवश्यक यूकेरियोटिक सह कारकों की कमी है. इस छोटे संकेतन अणुओं से और साथ ही परमाणु, कोशिका की सतह और विस्तृत तह मशीनरी की आवश्यकता है कि स्रावित प्रोटीन के लिए सक्रिय कर रहे हैं कि बड़ी बहु सबयूनिट परिसरों के अध्ययन के लिए एक मुद्दा हो सकता है. ई की संख्या कोलाई उपभेदों इन सीमाओं 1 से कुछ दूर करने के लिए इंजीनियर किया गया है. एम के हाल के वर्षों में, हालांकि, प्रयोगवे मज़बूती से अन्य प्रणालियों 2 में व्यक्त करने के लिए अन्यथा समस्याग्रस्त हैं कि यूकेरियोटिक प्रोटीन का उत्पादन क्योंकि ammalian अभिव्यक्ति प्रणालियों बढ़ रही है. आज यह रासायनिक मध्यस्थता अभिकर्मक को वायरल पारगमन से लेकर है कि तकनीक की एक किस्म के माध्यम से स्थिर और क्षणिक स्तनधारी अभिव्यक्ति सेल लाइनों प्राप्त करने के लिए संभव है, ऐसे electroporation और प्रत्यक्ष इंजेक्शन के रूप में 3 भौतिक जीन स्थानांतरण. इन तरीकों के सभी फायदे और नुकसान का अपना स्थापित किया है, उनमें से केवल कुछ या तो बहुत महंगा है और / या समय लेने जा रहा संरचनात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं.
यहाँ हम निलंबन हो गई स्तनधारी कोशिकाओं में संरचनात्मक जीव विज्ञान के लिए प्रोटीन परिसरों व्यक्त करने के लिए एक बहुत ही सरल, तेज, सस्ती अभी तक अत्यधिक कुशल विधि का वर्णन. दृष्टिकोण (जैसे, फ्रीस्टाइल HEK 293F कोशिकाओं) एक मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) सेल लाइन की क्षणिक सह अभिकर्मक का उपयोग करता है. इन कोशिकाओं को HEK 293 CE से प्राप्त किया गया हैटू लाइन, सीरम मुक्त मीडिया का उपयोग उच्च घनत्व (जैसे फ्रीस्टाइल 293 अभिव्यक्ति के माध्यम के रूप) तक पहुंच गया, निलंबन संस्कृतियों में विकसित करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. कोशिकाओं तो क्षणिक polyethylenimine की एक branched संस्करण (पी), endocytosis 5 से मेजबान कोशिका में प्रवेश कि डीएनए / पी परिसरों के गठन से स्तनधारी कोशिकाओं 4 की एक बड़ी रेंज के लिए कार्य करने के लिए सूचित किया गया है कि एक सस्ती बहुलक अभिकर्मक का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट हैं. यह विधि छोटे पैमाने (30 एमएल) और (300 मिलीलीटर तक) बड़े पैमाने पर दोनों के लिए उपयुक्त प्रयोगों है और शुद्ध प्रोटीन परिसरों का उच्च स्तर का उत्पादन कर सकते हैं. यह जटिल तह मशीनरी, सह कारकों या बैक्टीरिया, खमीर और कीट कोशिकाओं द्वारा नहीं किया जा सकता कि विशेष बाद translational संशोधनों की आवश्यकता है कि प्रोटीन के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है.
इस प्रोटोकॉल में हम Sin3A ट्रांसक्रिप्शनल दमन परिसर से तीन प्रोटीन केंद्रीय पाड़ की अभिव्यक्ति और शुद्धि प्रस्तुत करते हैं. इस Histone के होते हैंDeacetylase 1 (HDAC1), दोषपूर्ण मुंह बंद 3 (SDS3) का शमन और स्विच स्वतंत्र 3 (Sin3A). शुद्ध जटिल उच्च throughput क्रिस्टलीकरण परीक्षण के लिए प्रयोग किया जाता है.
Protocol
नोट: प्रोटोकॉल, इसलिए अभिकर्मकों की मात्रा और मात्रा आनुपातिक बढ़ाया जाना चाहिए अभिव्यक्ति के किसी भी पैमाने के लिए उपयुक्त है. एक उपयुक्त स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यहाँ हम आसानी से क्लोनिंग (चित्रा 1) में इस्तेमाल प्रतिबंध एंजाइमों की पसंद के आधार पर एक समानता टैग के शामिल किए जाने या अपवर्जन की अनुमति देता है कि एक संशोधित pcDNA 3.1 अभिव्यक्ति वेक्टर इस्तेमाल किया. निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक बड़े पैमाने पर अभिकर्मक वर्णन करता है.
1 एल रोलर बोतलों में 1 लार्ज स्केल संस्कृति / अभिकर्मक
आगे बढ़ें और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार HEK293F निलंबन अनुकूलित कोशिकाओं को बनाए रखने. आमतौर पर 30 के बीच और 100 मिलीलीटर के स्टार्टर संस्कृतियों 250 मिलीलीटर शंक्वाकार सेल संस्कृति बोतल में बड़े हो रहे हैं.
- प्रत्येक 1 एल रोलर बोतल में 300 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर बीज कोशिकाओं.
नोट: रोलर बोतलों की एक अधिकतम करने के लिए 150 मिलीलीटर की एक न्यूनतम समायोजितनिलंबन संस्कृति की 300 मिलीलीटर. बड़े पैमाने transfections के लिए कई बोतलों का उपयोग करें. - कोशिकाओं 1.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व तक पहुँचने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर में 24 घंटा, 120 आरपीएम, और 5% सीओ 2 के लिए सेते (कोशिकाओं लगभग हर 24 घंटा विभाजित करना चाहिए).
- फिल्टर निष्फल डीएनए की 300 ग्राम की कुल पिपेट 3 सेकंड के लिए सख्ती पीबीएस के 30 मिलीलीटर और भंवर में (पूरक विधि देखें).
नोट: लाख ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं प्रति डीएनए की 1 ग्राम के कुल का प्रयोग करें. दो या दो से अधिक plasmids किया जाए तो कोशिकाओं के डीएनए का अनुपात निरंतर बनी हुई है ताकि प्रत्येक की मात्रा को कम सह ट्रांसफ़ेक्ट. - 1.2 मिलीग्राम मिलीग्राम 0.5 के जोड़ें / 3 सेकंड के लिए सख्ती पीबीएस / डीएनए समाधान और भंवर पी निष्फल फिल्टर एमएल.
- 20 मिनट के लिए आरटी पर मिश्रण सेते हैं.
- डीएनए जोड़ें / पी कोशिकाओं को मिश्रण - 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल (1.3 चरण) के घनत्व पर होना चाहिए.
- सह अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं सेतेएक और 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे, 120 आरपीएम, और 5% सीओ 2 के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर में.
- 5 मिनट के लिए 3000 XG पर कोशिकाओं centrifuging और -80 डिग्री सेल्सियस पर गोली दुकान से फसल intracellular प्रोटीन.
नोट: वैकल्पिक रूप से, संस्कृति से ऊपर माहौल 5% सीओ 2 के साथ बदल रहा है और बोतल ढक्कन बंद है अगर (गैर सीओ 2), इनक्यूबेटर मिलाते हुए एक मानक का उपयोग करें. वातावरण हर बीतने (सामान्य रूप से हर 2 दिन) पर जगह की आवश्यकता होगी.
पूरे सेल निकालने से 2 प्रोटीन जटिल शोधन
इस प्रोटोकॉल झंडा टैग प्रोटीन का उपयोग परमाणु परिसरों की शुद्धि के लिए अनुकूलित है.
- में सेल गोली Defrost ~ पूर्व ठंडा lysis बफर के 40 एमएल (100 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 50 मिमी Tris पीएच 7.5, 5% ग्लिसरॉल, 0.3% ट्राइटन X-100, प्रोटीज इनहिबिटर्स) संस्कृति के एल प्रति.
- पुनः निलंबित ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे गोली (, झाग से बचने के भंवर नहीं करने के लिए). अच्छी तरह से एक गिलास homogenizer का उपयोग कोशिकाओं फिर से निलंबित. 3 चक्र (15 सेकंड, 15 सेकंड से दूर) के लिए Sonicate. 4ºC पर 25 मिनट के लिए 30,000 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला बरकरार रहती है.
- संतुलित करना राल संतुलन बफर (100 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 50 मिमी Tris 7.5 पीएच) के साथ तीन बार धोने से संस्कृति की प्रति लीटर agarose राल पैक विरोधी झंडा के 1.25 मिलीलीटर.
- एक या एक से अधिक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में आत्मीयता राल के साथ 2.3 कदम से पूरे सेल निकालने सेते हैं और धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर 30-120 मिनट के लिए नमूना बारी बारी से.
- 4 डिग्री सेल्सियस, सतह पर तैरनेवाला त्यागें में 1 मिनट के लिए 3000 XG पर अपकेंद्रित्र.
- पूर्व ठंडा बफर 1 से 45 मिलीलीटर के साथ राल धोने (100 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 50 मिमी Tris पीएच 7.5, 5% ग्लिसरॉल, 0.3% ट्राइटन X-100). 1 मिनट के लिए 3000 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- दोहराएँ कदम 2.7 उच्च नमक बफर का उपयोग कम नमक बफर (50 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 50 मिमी Tris पीएच 7 से (300 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 50 मिमी Tris पीएच 7.5, 5% ग्लिसरॉल), पीछा.5, 5% ग्लिसरॉल) और TEV विखंडन बफर (50 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 50 मिमी Tris पीएच 7.5, 0.5 मिमी TCEP).
नोट: प्रत्येक धोने सुनिश्चित पूरी तरह नहीं रह राल फिर से निलंबित और करने के लिए पर्याप्त संक्षिप्त यानी, है. - राल की एक 10 μl नमूना ले लीजिए और विश्लेषण के लिए 2x प्रोटीन लोड हो रहा है बफर (बाध्य प्रोटीन नियंत्रण) की 1 मात्रा में पतला. राल से एंटीबॉडी को रिहा बचने के क्रम में कम करने एजेंट का प्रयोग न करें.
- एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब पूर्व ठंडा TEV दरार बफर और हस्तांतरण के 8-10 मिलीलीटर में राल फिर से निलंबित.
- जोड़ें ~ 40 मूल संस्कृति की एल प्रति (1 मिलीग्राम / एमएल पर स्टॉक से) TEV प्रोटीज की माइक्रोग्राम और नीचे कई बार pipetting और से अच्छी तरह से मिश्रण.
- प्रोटीन ऑक्सीकरण रोकने के लिए 100% एन 2 गैस के साथ ट्यूब वातावरण बदलें.
- धीरे 4ºC पर ओ / एन घुमाएगी.
- 10 मिनट के लिए 3000 XG पर अपकेंद्रित्र. एक उपयुक्त आणविक वजन कट ऑफ के साथ एक अति केन्द्रापसारक फिल्टर में स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और ध्यान केंद्रित500 μl के लिए नीचे.
- केंद्रित प्रोटीन की एक 10 μl नमूना ले लीजिए और विश्लेषण के लिए 2x प्रोटीन लोड हो रहा है बफर के 1 मात्रा में पतला. (TEV नियंत्रण eluate).
- राल की एक 10 μl नमूना ले लीजिए और विश्लेषण के लिए 2x प्रोटीन लोड हो रहा है बफर के 1 मात्रा में पतला. राल से बड़ी मात्रा में एंटीबॉडी जारी करने से बचने के लिए एजेंटों को कम करने का प्रयोग न करें. (के बाद TEV राल नियंत्रण).
- जेल निस्पंदन बफर (50 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 50 मिमी Tris पीएच 7.5, 0.5 मिमी TCEP) के साथ आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी स्तंभ संतुलित करना.
- 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से प्रोटीन फ़िल्टर
- स्तंभ में नमूना लोड और भिन्न इकट्ठा.
- कदम 2.9, 2.15 और 2.16 और विश्लेषण के लिए एक एसडीएस पृष्ठ और Coomassie दाग पर कदम 2.19 से जेल निस्पंदन अंशों से चलाने के नमूने हैं.
नोट: यह लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए कदम 2.9, 2.15 और 2.16 पूर्व जेल को छानने का काम से नमूनों की एक एसडीएस पृष्ठ को चलाने के लिए उचित है.
Representative Results
यहाँ हम HDAC1, SDS3, Sin3A त्रिगुट परिसर के 2 एल (8 x 250 मिलीलीटर संस्कृतियों) क्षणिक सह अभिकर्मक और शुद्धि दिखा. HDAC1 और SDS3 Sin3A की HDAC-बातचीत डोमेन (छिपा) के माध्यम से Sin3A के साथ बातचीत. संस्कृति के प्रति लीटर परिसर के 1 मिलीग्राम तक एक ठेठ शुद्धि पैदावार.
चित्रा संशोधित pcDNA 3.1 अभिव्यक्ति वेक्टर के 1. योजनाबद्ध. प्लाज्मिड Sin3A के अमीनो टर्मिनस पर आत्मीयता टैग और TEV दरार साइट को शामिल करने के EcoRV और EcoRI के साथ पचा किया गया था. HDAC1 और SDS3 की untagged संस्करणों क्लोन करने के लिए, वेक्टर KpnI और EcoRI के साथ पचा किया गया था.
चित्रा 2 एसडीएस पीएजीई शुद्धि की दिशा में पहला कदम दिखा. "बाध्य प्रोटीन" लेन आत्मीयता राल के लिए बाध्य जटिल से पता चलता है. TEV पाचन के बाद, Sin3A छिपाई पर टैग उपस्थित बंद cleaved है और जेल के दूसरे और तीसरे गलियों में दिखाया गया है जटिल राल से eluted है.
चित्रा प्रोटीन जटिल शुद्ध का उपयोग कर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के 3 वर्णलेख. यह समाधान में एक डिमर रूपों क्योंकि शुद्ध जटिल शून्य मात्रा में eluted ध्यान दें.
3 चित्र में दिखाया जेल निस्पंदन के भागों दिखा चित्रा 4 एसडीएस पृष्ठ.
6 कोशिकाओं / एमएल तैयार 2.3x10 में चित्रा 5 Trypan नीले दाग HEK 293F कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट हो. बड़े समूहों लगभग 25 सेकंड के लिए जोरदार vortexing द्वारा टूट किया जा सकता है, जबकि सेल ही, एक या विभाजित कोशिकाओं के रूप में मौजूद होना चाहिए.
| समस्या | संभावित कारणों | लड़ाई |
| कम प्रोटीन उपज. | कोशिकाओं की कम संख्या ट्रांसफ़ेक्ट. | सुनिश्चित करें कि सेल घनत्व 1.0 x 10 6 संस्कृति को अभिकर्मक प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ने से पहले लगभग है बनाओ. |
| कोशिकाओं को भी कई बार subcultured गया हो सकता है. | लगभग 90 पास करने के बाद नए सिरे से शेयर कोशिकाओं का प्रयोग करेंउम्र. | |
| डीएनए अपमानित या दोष के एक उच्च राशि है हो सकता है. | यकीन प्लास्मिड डीएनए इस्तेमाल किया जा रहा बनाओ 1.8 और 2.0 के बीच एक 260/280 अनुपात है. एक agarose जेल पर डीएनए चल रहा है इसकी गुणवत्ता का आकलन करने के लिए सलाह दी जाती है. | |
| प्रोटीन (ओं) व्यक्त की जा रही स्थिर या पर्याप्त घुलनशील नहीं कर रहे हैं. | पूर्व transfections स्केलिंग अप करने के लिए छोटे पैमाने में विभिन्न निर्माणों का परीक्षण करें. यकीन टैग ब्याज की प्रोटीन (ओं) की संरचना के साथ हस्तक्षेप नहीं करते हैं. | |
| प्रकोष्ठों बादलमय लग रही है और एक असामान्य रंग और / या गंध है. | प्रकोष्ठों बैक्टीरिया या खमीर से संक्रमित हैं. | अच्छा बाँझ तकनीक हर समय इस्तेमाल किया जाना चाहिए. लामिना का प्रवाह डाकू fumigating और संक्रमण के मामले में सेल संस्कृति कक्ष यूवी disinfecting समस्या युक्त मदद करता है. |
| प्रकोष्ठों कम व्यवहार्यता है. | मीडिया में गलत पीएच. | यकीन संस्कृतियों सीओ 2 5-8% पर बड़े हो रहे हैं बनाओहर समय. |
| कोशिकाओं 3.0x10 6 कोशिकाओं / एमएल से अधिक घनत्व को सुसंस्कृत किया गया है. | कोशिकाओं 2.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल तुरंत एक अभिकर्मक से पहले और कभी नहीं 6 10 x 3.0 से ऊपर कोशिकाओं / एमएल ऊपर घनत्व के लिए बड़ा हो जाना नहीं चाहिए. | |
| आत्मीयता शोधन काम नहीं किया | प्रोटीन (ओं) व्यक्त नहीं किया जा रहा है. | ऊपर देखें. |
| शुद्धीकरण शर्तों गलत हो सकता है. | (जैसे, उच्च नमक, कम नमक, पीएच.) बफर की स्थिति को समायोजित |
तालिका 1 समस्या निवारण.
| सिस्टम | लाभ | नुकसान |
| ई कोलाई |
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| पी pastoris |
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| कीट कोशिकाओं में baculovirus अभिव्यक्ति |
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| स्तनधारी सिस्टम के साथ बायोरिएक्टर |
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| HEK 293F निलंबन कोशिकाओं |
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तालिका 2 फायदे और मुख्य अभिव्यक्ति सिस्टम के नुकसान.
Discussion
हम व्यक्त और पुनः संयोजक प्रोटीन और स्तनधारी कोशिकाओं से बहु सबयूनिट परिसरों की बड़ी मात्रा में शुद्ध के लिए (पी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध lipophilic अभिकर्मक अभिकर्मकों की तुलना में बहुत कम लागत) एक सरल और लागत प्रभावी तरीका विकसित किया है. प्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में अत्यधिक शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए (260/280 1.8 के बीच और 2.0) पी के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो इष्टतम अभिकर्मक और अभिव्यक्ति दक्षता पहुंचा जा सकता है. प्रकोष्ठों serum- और एंटीबायोटिक मुक्त मीडिया में सुसंस्कृत होना चाहिए, इसलिए, बाँझ तकनीक सख्ती से महंगा है और समय लेने वाली संक्रमण से बचने के लिए Passaging और transfecting कोशिकाओं के लिए आवश्यक है. सेल व्यवहार्यता 90% या अधिक होना चाहिए और संस्कृतियों 2.5 x 10 6 कोशिकाओं की तुलना में अधिक से अधिक घनत्व के लिए विकसित किया जा नहीं करना चाहिए / तुरंत एक अभिकर्मक से पहले ऐसा करने के रूप में प्रोटीन उपज कम हो जाएगा एमएल. एक सफल अभिकर्मक के लिए, संस्कृतियों केवल एक या विभाजित कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए. क्लस्टर ताक़त से टूट किया जा सकता है30 सेकंड (चित्रा 5) को ous vortexing 20. सह अभिकर्मक में इस्तेमाल प्रत्येक प्लाज्मिड के अनुपात का अध्ययन जटिल होने का stoichiometry के अनुसार उपयोगकर्ता द्वारा अलग किया जा सकता है. एक उपयुक्त अभिव्यक्ति समय स्थापित किया जा सकता है कि इतनी अभिव्यक्ति दक्षता, ब्याज की प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. शुद्धीकरण अवांछित proteolytic गिरावट के जोखिम को कम करने के लिए हर समय प्रोटीन नमूना ठंडा रखने प्रदर्शन किया जाना चाहिए. वे अक्सर कम विलेयता और / या enzymatic गतिविधि के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप, संरचनात्मक तत्वों या कुछ प्रोटीन की सक्रिय साइटों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के बाद से टैग और शुद्धि बफ़र्स के चुनाव महत्वपूर्ण है. छोटे पैमाने transfections बड़े प्रोटीन परिसरों की शुद्धि के लिए विभिन्न निर्माणों के परीक्षण के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं.
आज, वैकल्पिक तरीकों की एक विशाल विविधता पुनः संयोजक यूकेरियोटिक प्रोटीन (तालिका 2) की अभिव्यक्ति के लिए उपलब्ध हैं. उदाहरण के लिए, Baculoviकीट कोशिकाओं में रस अभिव्यक्ति व्यापक रूप से अपने उच्च पारगमन दक्षता और अन्य वायरल प्रजातियों 6 की तुलना में cytotoxicity की कमी की वजह से किया जाता है. हालांकि, वायरस बनाने की प्रक्रिया समय लेने वाली है और इसके अस्थिरता वायरस लंबी अवधि के लिए जमा होने की अनुमति नहीं है. दूसरी ओर, खमीर अभिव्यक्ति प्रणालियों उच्च प्रोटीन पैदावार 7, जिसके परिणामस्वरूप किण्वक संस्कृतियों में कोशिकाओं को बहुत उच्च घनत्व बढ़ रही है की संभावना प्रदान करते हैं. लेकिन वे अभी भी सही ढंग से गुना और उनके प्रोटीन सहयोगियों के साथ बातचीत करने के लिए यूकेरियोटिक प्रोटीन के लिए आवश्यक बाद translational संशोधनों की पूरी विविधता की कमी है. HDAC3, उदाहरण के लिए, व्यक्त की है लेकिन ई में गुना नहीं करता कोलाई. 293F कोशिकाओं में व्यक्त हालांकि, जब हम अपने सह repressor (SMRT) और प्रोकार्योटिक कोशिकाओं में नहीं पाया जाता है जो inositol tetraphosphate (IP4) 8, की एक अणु के साथ परिसर में एक सक्रिय एंजाइम को शुद्ध करने में सक्षम थे. इस विधि को भी सेंट शुद्ध और क्रिस्टल को हल करने के लिए हमें अनुमति दी गई हैHDAC1 इसी प्रकार IP4 9 से सक्रिय है जो NuRD परिसर में MTA1 के साथ बातचीत की ructure. आदर्श रूप में, हम हमेशा अपने प्राकृतिक, शारीरिक वातावरण में यूकेरियोटिक प्रोटीन व्यक्त करना चाहते हैं. बायोरिएक्टर 10-12 में HEK 293-EBNA1 कोशिकाओं को रोजगार स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली वर्णित और प्रोटीन के बहुत उच्च स्तर की उपज है, लेकिन इन उपयोग करने के लिए जटिल हो सकता है किया गया है.
हमारे विधि बैक्टीरिया, खमीर और बायोरिएक्टर प्रणाली में अभिव्यक्ति के लिए एक सरल और सुलभ विकल्प है. अभिव्यक्ति विधि तेज है और रोलर बोतल या कुप्पी माहौल 5% सीओ 2 और मानक मिलाते इन्क्यूबेटरों उपयोग किया जाता है के साथ बदल रहा है, खासकर अगर महंगे उपकरण के उपयोग की आवश्यकता नहीं है. हम कई plasmids-transfect सीओ और संस्कृति के> 1 मिलीग्राम / एल की पैदावार के साथ अप करने के लिए पांच प्रोटीन के साथ परिसरों को शुद्ध करने के लिए इन प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है. दिलचस्प बात यह प्रणाली स्थिर अच्छी तरह से व्यवहार परिसरों की पहचान में मदद करता है. उदाहरण के लिए, पूर्व सैनिकों के लिएHDAC1 और Sin3A की बाइनरी जटिल की अभिव्यक्ति प्रोटीन की सीमित पैदावार दे दी है, अभी तक SDS3 के अलावा अधिक मात्रा 5 गुना और इसलिए उपयुक्त निर्माणों और क्रिस्टलीकरण के लिए स्थिर परिसरों के चुनाव में संरचनात्मक जीवविज्ञानी गाइड हुई.
Acknowledgments
हम यह काम और लीसेस्टर कोर जैव प्रौद्योगिकी सेवा के विश्वविद्यालय के लिए इस्तेमाल अभिव्यक्ति निर्माणों की तैयारी के लिए डॉ Xiaowen यांग (PROTEX क्लोनिंग सेवा) को धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम एक बीबीएसआरसी छात्रावस्था द्वारा समर्थित किया गया था, वेलकम ट्रस्ट कार्यक्रम और वरिष्ठ अन्वेषक अनुदान WT085408 और WT100237 और बीबीएसआरसी RM31G0224 अनुदान.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
| Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
| 250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
| Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
| Polyethylenimine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4ºC |
| Mammalian expression vector | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
| 15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
| Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |
References
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