Introduction
De snelle vooruitgang van de moleculaire celbiologie en de constante behoefte aan betere geneesmiddelen in de geneeskunde heeft behoefte aan structurele biologen om te kijken naar steeds complexere eiwitstructuren gemaakt. Deze zal vaak een bepaalde post-translationele modificaties, moleculaire chaperones en co-factoren om hun uitgebreide vouwen en enzymatische activiteit te ondersteunen. Hoewel de overgrote meerderheid van de structuren in de Protein Data Bank zijn verkregen middels bacteriële expressiesystemen, prokaryoten niet in staat zijn een groot aantal van deze modificaties uitvoeren en missen veel eukaryote essentiële co-factoren. Dit kan een probleem voor de studie van grote multi-subunit complexen die worden geactiveerd door kleine signaalmoleculen en voor nucleaire celoppervlak en uitgescheiden eiwitten die uitgebreide vouwen machines vereisen. Een aantal van E. coli stammen zijn ontworpen om een aantal van deze beperkingen 1 ondervangen. De laatste jaren is het gebruik van mammalian expressie systemen is toegenomen, omdat ze betrouwbaar produceren eukaryote eiwitten die anders problematisch uit te drukken in andere systemen 2. Tegenwoordig is het mogelijk om stabiele en transiënte zoogdierexpressie cellijnen verkregen door een verscheidenheid van technieken die variëren van virale transductie naar chemische gemedieerde transfectie, fysische genoverdracht zoals elektroporatie en directe injectie 3. Hoewel al deze methoden hebben hun eigen set voordelen en nadelen, enkele daarvan zijn geschikt voor structurele studies die ofwel te duur en / of tijdrovend.
Hier beschrijven we een zeer eenvoudige, snelle, goedkope maar zeer efficiënte methode voor het uitdrukken van eiwitcomplexen voor structurele biologie in suspensie gegroeid zoogdiercellen. De aanpak maakt gebruik van tijdelijke co-transfectie van een menselijke embryonale nier (HEK) cellijn (bijvoorbeeld Freestyle HEK 293F-cellen). Deze cellen zijn afgeleid van de HEK 293-cell lijn, aangepast om te groeien in suspensie culturen bereiken hoog dichtheden met serumvrij medium (zoals FreeStyle 293 Expression Medium). Cellen worden vervolgens voorbijgaand getransfecteerd met een vertakte versie van polyethyleenimine (PEI), een goedkope polymere reagens welke is gemeld functioneren voor een groot aantal zoogdiercellen 4 door het vormen van DNA / PEI-complexen die de ontvangende cel binnen door endocytose 5. Deze werkwijze is geschikt voor zowel kleinschalige (30 ml) en grote (tot 300 ml) experimenten en kan hoge niveaus van gezuiverd eiwit complexen produceren. Het is bijzonder nuttig voor het bestuderen van eiwitten die complexe vouwen machines, co-factoren of bepaalde post-translationele modificaties die niet kan worden uitgevoerd door bacteriën, gisten en insectencellen vereisen.
In dit protocol presenteren we de expressie en zuivering van de drie-eiwit centrale steiger van de transcriptionele repressie Sin3A complex. Deze bestaat uit histonDeacetylase 1 (HDAC1), Suppressor van Defecte zwijgen 3 (SDS3) en Switch-onafhankelijke 3 (Sin3a). Het gezuiverde complex wordt gebruikt voor high-throughput kristallisatie trials.
Protocol
OPMERKING: Het protocol is geschikt voor elke schaal van meningsuiting, dus volumes en hoeveelheden reagentia moeten proportioneel worden geschaald. Een geschikte zoogdierlijke expressievector worden gebruikt voor dit protocol. Hier gebruikten we een gemodificeerde pcDNA 3.1 expressievector die gemakkelijk kan de niet opnemen van een affiniteit tag afhankelijk van de keuze van restrictie-enzymen die bij de klonering (Figuur 1). Het volgende protocol beschrijft een grootschalig transfectie.
1 Large Scale Cultuur / Transfection in 1 L Roller Flessen
Groei en onderhouden HEK293F-suspensie aangepaste cellen volgens standaard protocollen. Typisch starter cultures van 30 tot 100 ml worden gekweekt in 250 ml konische celkweekkolven.
- Zaadcellen 0.5 x 10 6 cellen / ml in een uiteindelijk volume van 300 ml per 1 L rolfles.
OPMERKING: Rolflessen geschikt minste 150 ml tot maximaal300 ml suspensie cultuur. Voor grotere schaal transfecties gebruik van meerdere flessen. - Incubeer gedurende 24 uur in een orbitale schudder incubator bij 37 ° C, 120 rpm en 5% CO2 totdat de cellen een dichtheid van 1,0 x 10 6 cellen / ml bereikt (cellen ongeveer om de 24 uur verdelen).
- Pipetteer een totaal van 300 ug van DNA-filter gesteriliseerde (zie aanvullende methode) in 30 ml PBS en vortex krachtig gedurende 3 sec.
OPMERKING: Gebruik een totaal van 1 ug DNA per miljoen getransfecteerde cellen. Indien twee of meer plasmiden worden geco-transfecteerd vermindering van de hoeveelheid van elk zodat de verhouding van DNA aan cellen constant blijft. - Voeg 1,2 ml van 0,5 mg / ml filter-gesteriliseerd PEI de PBS / DNA-oplossing en vortex krachtig gedurende 3 sec.
- Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Voeg de DNA / PEI mixen om de cellen - die moet worden bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml (stap 1.3).
- Na co-transfectie Incubeer de cellenin een orbitale schudder incubator voor een verdere 48 uur bij 37 ° C, 120 rpm en 5% CO2.
- Harvest intracellulaire proteïnen door centrifugeren cellen bij 3000 g gedurende 5 min en bewaar de pellet bij -80 ° C.
OPMERKING: U een standaard (niet-CO2) schudincubator, indien de atmosfeer boven de kweek wordt vervangen door 5% CO2 en het deksel fles werd afgesloten. De atmosfeer moet worden vervangen bij elke passage (gewoonlijk om de 2 dagen).
2 eiwit-complex Zuivering van Whole Cell Extract
Dit protocol is geoptimaliseerd voor de zuivering van nucleaire complexen met vlag gemerkte eiwitten.
- Ontdooi celpellet in ~ 40 ml voorgekoeld lysis buffer (100 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glycerol, 0,3% Triton X-100, proteaseremmers) per L cultuur.
- Re-schorten de pellet door en neer te pipetteren meerdere malen (ter voorkoming van schuimvorming, niet vortex). Grondig opnieuw te schorten cellen met behulp van een glazen homogenisator. Ultrasone trillingen gedurende 3 cycli (15 sec aan, 15 seconden uit). Centrifugeer bij 30.000 xg gedurende 25 min bij 4 ° C en bewaar supernatant.
- Equilibreer 1,25 ml anti-flag verpakt agarose hars per liter kweek door driemaal wassen met hars equilibratiebuffer (100 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 7,5).
- Incubeer de gehele celextract uit stap 2.3 met de affiniteit hars in een of meer 50 ml centrifugebuizen en het monster voorzichtig zwenken 30-120 min bij 4 ° C.
- Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C, supernatans.
- Spoel de hars met 45 ml voorgekoeld 1 buffer (100 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glycerol, 0,3% Triton X-100). Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 1 minuut en gooi supernatant.
- Herhaal stap 2.7 met hoge zout buffer (300 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glycerol), gevolgd door lage zout buffer (50 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 70,5, 5% glycerol) en TEV Splitsing buffer (50 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP).
OPMERKING: Zorg ervoor dat elke wasbeurt is kort dus, voldoende om weer volledig op te schorten van de hars en niet langer. - Neem een 10 gl monster hars en verdun tot 1 volume van 2x eiwitbelading buffer voor analyse (gebonden eiwit control). Gebruik reductiemiddelen gebruiken om te voorkomen los het antilichaam van de hars.
- Resuspendeer de hars in 8-10 ml voorgekoeld TEV splitsing buffer en overbrengen in een 15 ml centrifugebuis.
- Voeg ~ 40 ug TEV protease (uit voorraad 1 mg / ml) per L oorspronkelijke cultuur en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen.
- Vervang buis sfeer met 100% N2 gas aan eiwit oxidatie te voorkomen.
- Voorzichtig draai O / N bij 4 ° C.
- Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 10 minuten. Breng de bovenstaande in een ultra centrifugaal filter met een geschikt moleculair gewicht cut-off en concentrerentot 500 pi.
- Neem een 10 ul monster van de geconcentreerde proteïneoplossing en verdun tot 1 volume van 2x eiwitbelading buffer voor analyse. (TEV elueren controle).
- Neem een 10 ul monster van de hars en verdun tot 1 volume van 2x eiwitbelading buffer voor analyse. Gebruik reductiemiddelen om te voorkomen uitlaten van grote hoeveelheden antilichaam uit de hars. (Post-TEV hars controle).
- Equilibreer de size exclusion chromatografie kolom met gelfiltratie buffer (50 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP).
- Filtreer het eiwit door een 0,22 urn filter
- Plaats het monster in de kolom en het verzamelen van de fracties.
- Doorgaan monsters van stappen 2.9, 2.15 en 2.16 en gelfiltratie fracties van stap 2.19 op SDS-PAGE en Coomassie kleuring voor analyse.
Opmerking: Het is raadzaam om een SDS-PAGE van de monsters lopen van stappen 2.9, 2.15 en 2.16 voor gelfiltratie om expressie van het doeleiwit bevestigen.
Representative Results
Hier laten we een 2 L (8 x 250 ml kweken) transiënte co-transfectie en zuivering van het HDAC1, SDS3, Sin3a ternair complex. HDAC1 en SDS3 interactie met Sin3a door de HDAC-interactie domein (HID) van Sin3a. Een typische zuivering levert tot 1 mg complex per liter kweek.
Figuur 1 Schematische voorstelling van de gemodificeerde pcDNA 3.1 expressievector. Het plasmide werd gedigereerd met EcoRV en EcoRI om de affiniteit-tag en TEV splitsingsplaats op de amino terminus van Sin3a omvatten. Om untagged versies van HDAC1 en SDS3 klonen werd de vector geknipt met KpnI en EcoRI.
Figuur 2 SDS-PAGE toont de eerste stap van de zuivering. De "gebonden eiwit" laan toont de complex gebonden aan de affiniteit hars. Na digestie TEV, is de onderhavige tag op Sin3a-HID afgesplitst en het complex wordt geëlueerd uit de hars zoals in de tweede en derde lanen van de gel.
Figuur 3 Chromatogram van eiwit-complex gezuiverd middels grootte-uitsluitingschromatografie. Merk op dat de pure complex elueerde in het lege volume omdat het vormt een dimeer in oplossing.
Figuur 4 SDS-PAGE die de fracties van de gelfiltratie getoond in figuur 3.
Figuur 5 trypan blue-gekleurde HEK 293F cellen op 2.3x10 6 cellen / ml direct worden getransfecteerd. Cellen dienen alleen aanwezig als enkele of delende cellen, terwijl grote clusters spoedig kunnen worden verbroken door krachtig vortexen gedurende ongeveer 25 sec.
| Probleem | Mogelijke oorzaken | Actie |
| Laag eiwit opbrengst. | Een gering aantal cellen getransfecteerd. | Controleer celdichtheid ongeveer 1,0 x 10 6 voor de transfectie reactiemengsel toe te voegen aan de kweek. |
| Cellen misschien te vaak in subcultuur. | Gebruik verse voorraad cellen na ongeveer 90 pasleeftijden. | |
| DNA kan worden afgebroken of een grote hoeveelheid verontreinigingen. | Zorg ervoor dat de plasmide-DNA wordt gebruikt heeft een 260/280 verhouding tussen 1,8 en 2,0. Running het DNA op een agarose gel is wenselijk om de kwaliteit te evalueren. | |
| Eiwit (s) worden uitgedrukt zijn niet stabiel of oplosbare genoeg. | Test verschillende constructies in kleine schaal voorafgaand aan de opschaling van de transfecties. Controleer markeringen niet interfereert met de structuur van het eiwit (ten) van belang. | |
| Cellen zien er troebel en hebben een ongewone kleur en / of geur. | Cellen geïnfecteerd met bacteriën of gist. | Geschikt steriele techniek worden gebruikt op elk moment. Ontsmetten van de afzuigkappen met laminaire stroming en UV-desinfectie van de celkweek kamer in geval van een infectie helpt met het probleem. |
| Cellen hebben een lage levensvatbaarheid. | Verkeerde pH in de media. | Zorg ervoor dat culturen worden gekweekt bij 5-8% CO 2allen tijde. |
| Cellen werden gekweekt tot een dichtheid dan 3.0x10 6 cellen / ml. | De cellen moeten niet worden gekweekt tot dichtheden dan 2,5 x 10 6 cellen / ml, vlak voor een transfectie en nooit boven 3,0 x 10 6 cellen / ml. | |
| Affiniteitszuivering werkte niet | Eiwit (s) niet wordt uitgedrukt. | Zie hierboven. |
| Zuivering omstandigheden kan het mis hebben. | Pas buffer omstandigheden (bijvoorbeeld hoge zout, laag zout, pH.) |
Tabel 1: Problemen oplossen.
| Systeem | Voordelen | Nadelen |
| E. coli |
|
|
| P. pastoris |
|
|
| Baculovirus expressie in insectencellen |
|
|
| Bioreactoren met zoogdiersystemen |
|
|
| HEK 293F suspensiecellen |
|
|
Tabel 2: Voor-en nadelen van de belangrijkste expressie systemen.
Discussion
We hebben een eenvoudige en kosteneffectieve methode ontwikkeld (PEI kost veel minder dan commercieel verkrijgbare transfectie reagentia lipofiele) voor expressie en zuivering van grote hoeveelheden recombinante eiwitten en multi-subunit complexen zoogdiercellen. Optimale transfectie en expressie-efficiëntie kan worden verwezenlijkt indien zeer zuiver plasmide-DNA (260/280 tussen 1,8 en 2,0) wordt gebruikt in combinatie met PEI zoals beschreven in het protocol. Cellen worden gekweekt in serum en antibiotica vrije media derhalve steriele techniek strikt vereist is voor passage en cellen te transfecteren om kostbare en tijdrovende infecties te voorkomen. Cellevensvatbaarheid moet 90% of hoger en culturen niet worden gekweekt tot dichtheden van meer dan 2,5 x 10 6 cellen / ml, vlak voor een transfectie, omdat dit zal eiwit opbrengst verminderen. Voor een succesvolle transfectie, moet culturen eenmalig of delende cellen bevatten. Clusters kan worden gebroken door de krachtous vortexen 20 tot 30 seconden (Figuur 5). De verhouding van elk plasmide in de co-transfectie kan worden gevarieerd door de gebruiker volgens de stoichiometrie van het complex onderzocht. Expressie efficiëntie kan worden geoptimaliseerd voor het eiwit van belang, zodat een geschikte expressievector tijd kan worden vastgesteld. Zuivering worden uitgevoerd waarbij de eiwitmonster koud allen tijde het risico van ongewenste proteolytische afbraak verminderen. De keuze van labels en zuivering buffers is kritisch, omdat deze kunnen interfereren met bouwelementen of actieve plaatsen van bepaalde eiwitten, vaak resulterend in verminderde oplosbaarheid en / of verlies van enzymatische activiteit. Kleinschalige transfecties zijn bijzonder bruikbaar voor het testen van verschillende constructen voor de zuivering van grote eiwitcomplexen.
Vandaag, een grote verscheidenheid van alternatieve methoden zijn beschikbaar voor de expressie van recombinante eukaryotische eiwitten (Tabel 2). Bijvoorbeeld, Baculovirus expressie in insectencellen wordt veel gebruikt vanwege zijn hoge transductie efficiëntie en het gebrek aan cytotoxiciteit in vergelijking met andere virale soort 6. Echter, het proces van het virus is tijdrovend en instabiliteit niet toestaat het virus worden opgeslagen voor lange periodes. Anderzijds, gist expressiesystemen bieden de mogelijkheid groeiende cellen tot zeer hoge dichtheden in fermentor culturen resulteert in hoge opbrengsten eiwit 7. Maar nog steeds hun volledige verscheidenheid van post-translationele modificaties vereist eukaryote eiwitten te kunnen vouwen en interactie met hun eiwit partners. HDAC3 bijvoorbeeld uitgedrukt maar niet vouwen in E. coli. Echter, uitgedrukt in 293F cellen, konden we actief enzym in complex zuiveren met co-repressor (SMRT) en een molecuul inositol tetrafosfaat (IP4) 8, die niet in prokaryote cellen. Deze methode is ook toegestaan ons te zuiveren en op te lossen de kristallen structure van HDAC1 interactie met MTA1 in de NuRD complex, die eveneens wordt geactiveerd door IP4 9. Idealiter zouden we het altijd leuk om eukaryote eiwitten in hun natuurlijke, fysiologische omgeving uit te drukken. Zoogdierexpressiesystemen gebruik HEK 293-cellen in bioreactoren EBNA1 10-12 zijn beschreven en leveren zeer veel eiwitten, maar deze kunnen complex te gebruiken.
Onze werkwijze is eenvoudig en toegankelijk alternatief voor expressie in bacteriën, gist en bioreactor systemen. De uitdrukking werkwijze is snel en vereist niet het gebruik van dure apparatuur vereisen, met name wanneer de wals fles of kolf atmosfeer vervangen door 5% CO2 en standaard schudden incubators worden gebruikt. We hebben deze protocollen gebruikt om meerdere plasmiden co-transfecteren en zuiveren complexen met maximaal vijf eiwitten met opbrengsten van> 1 mg / l kweek. Interessant is dat het systeem helpt de identificatie van stabiele goed opgevoede complexen. Bijvoorbeeld, expressie van de binaire complex van HDAC1 en Sin3a gaf beperkte opbrengsten van eiwit, maar toevoeging van SDS3 resulteerde in 5 keer hoger bedragen en daarmee leidt de structurele bioloog in de keuze van geschikte constructies en stabiele complexen voor kristallisatie.
Acknowledgments
We zouden graag Dr Xiaowen Yang (PROTEX klonen dienst) bedanken voor het opstellen van de expressie constructen gebruikt voor dit werk en de Universiteit van Leicester Core Biotechnology Services. Dit werk werd ondersteund door een BBSRC studententijd, de Wellcome Trust programma en Senior Investigator subsidies WT085408 & WT100237 en BBSRC verlenen RM31G0224.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
| Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
| 250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
| Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
| Polyethylenimine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4ºC |
| Mammalian expression vector | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
| 15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
| Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |
References
- Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
- Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold. Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).
- Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery. Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).
- Beljelarskaya, S. N. Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).
- Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).
- Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).
- Millard, C. J., Watson, P. J., et al. Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates. Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).
- Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins. CSH protocols. , pdb.prot4977 (2008).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).
- Baldi, L., Muller, N., et al. Transient Gene Expression in Suspension HEK‐293 Cells: Application to Large‐Scale Protein Production. Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).
