Overflate-plasmonresonans (SPR) er en etikett-fri fremgangsmåte for detektering av bio-molekylære vekselvirkninger i sanntid. Heri, en protokoll for en membran protein: er reseptorinteraksjon eksperiment beskrevet, mens de diskuterer fordeler og ulemper med teknikken.
Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).
Protein-protein interaksjoner (PPI); dannelse og dissosiasjon av proteinkomplekser, er sentrale hendelser i mange biologiske prosesser (f.eks, replikering, transkripsjon, oversettelse, signalisering, celle-celle kommunikasjon). Semi-kvantitative studier av PPI blir ofte utført ved hjelp av rullegardin eller immunutfellingen eksperimenter. Imidlertid er disse (og liknende) teknikker er begrenset i området fra affiniteter som kan måles (lavt mikromolområde og høyere affinitet) på grunn av vasketrinnene som er iboende i slike teknikker. Slike "end-point" teknikker kan ikke identifisere forbigående eller lav affinitet interaksjoner som ofte er av stor biologiske konsekvenser. I tillegg er den tidsmessige oppløsningen av slike metoder ytterst begrenset, vanligvis flere størrelsesordener langsommere enn utbredelsen av reaksjonen. SPR overvinner disse mangler på grunn av sin økt følsomhet og overlegen tidsmessig oppløsning 1,2. SPR er en etikett-fri metode, og som sådanmolekylær interaksjon kan måles (så lenge masse endringene kan bli detektert). I tillegg til PPI, har det vært mye brukt for å karakterisere protein-ligand, protein-medikament (eller lite molekyl), protein-DNA og protein-RNA interaksjoner 3-5. Resultatene er registrert og plottet i sann tid, noe som muliggjør hurtig endring av eksperimentelle betingelser og eksperimentelle fleksibel utforming.
Den fysiske prinsippet bak SPR baserte instrumenter er utnyttelsen av et optisk system som måler en endring av brytningsindeksen på sensoroverflaten når massen endres 2. En av de samvirkende partnere (heretter ligand) immobilisert på en polymer matrise chip og andre molekyl (heretter analytt) føres over overflaten. Analytt å bindes til liganden forandrer massen på chip overflaten. Denne masseendring er direkte og proporsjonalt relatert til endringer i brytningsindeksen til overflaten. Resultatene er plottet i sanntid ogpresenteres som respons heter (RU), som en funksjon av tid. Et slikt plott er betegnet en sensogram (f.eks, figur 1). Siden SPR følger hele tidsforløpet av interaksjonen, blir pre-likevektskinetiske hastighetskonstanter avledet, i tillegg til likevekt affiniteter. Som beskrevet nedenfor, har den pre-likevekt oppførselen til et gitt system mye informasjon, og gir et helt annet perspektiv enn likevekt alene. Når systemet er kalibrert forsøk er meget rask og krever bare små mengder av proteinmaterialet (mikrogram til nanogram mengder). Oppsamling av det komplette bevegelsesinformasjon for et gitt system kan oppnås i løpet av dager. Den høye følsomheten SPR gir målinger som ikke er mulig å bruke noen annen teknikk 6. Dette er imidlertid høy følsomhet en "tveegget sverd" siden det kan være en viktig kilde for falske positive data. Annen faktor som påvirker reflekterende indeksen er registrert og plottet på sensogram. Som sådan, apsikts kontroller må brukes til å eliminere falske positiver, og støtte fra komplementære tilnærminger er svært oppmerksom.
Figur 1 illustrerer utviklingen av en SPR eksperiment ved bruk av en NTA-belagt sensor chip. Den sensogram i panel A viser injeksjon av nikkelioner over NTA matrisen (unsubtracted data), og paneler BD vise dataene etter å subtrahere det signal som utledes fra den negative kontrollcellen. Rød og blå pilene viser injeksjon start og slutt, henholdsvis. Immobilisering av liganden på brikken gradvis forandrer massen før injeksjonen er avsluttet. Den stabile platå observert etter avslutning av ligand s injeksjon reflekterer stabil assosiasjon av liganden til overflaten (figur 1B, syklus 2). Når en stabil grunnlinje er oppnådd en buffer blir injisert i løpet av liganden og referansecellen (figur 1B, syklus 3) .Dette injeksjon tjener som en "blindprøve" og vil blitrekkes under analysen. Ved injeksjon, er mindre endringer registreres, noe som reflekterer en strømning av massen gjennom brikken. Så i en egen syklus (figur 1B, syklus 4), blir analytten injisert; den gradvise økning i RU representerer analytten tilknytning til liganden. Bindingssetene blir gradvis opptatt inntil likevekt er nådd. Så snart injeksjonen ender, en nedgang i jernbaneforetak reflekterer kompleksets dissosiasjon. Fra slike sensograms pre-likevekt og likevekts hastighetskonstanter kan avledes (se senere). Figur 1 viser en transient interaksjon mellom liganden og analytten. Når samspillet er mer stabil, er nedgangen i RU nivå tregere, noe som reflekterer en lavere k d.
Heri, beskriver vi en SPR eksperiment som tar sikte på å karakterisere interaksjonen mellom en membran transportør (vaskemiddel oppløst) og dens funksjonelle partner, dens beslektede substrat bindende protein 6,7. Den valgte model-systemet er en ATP bindende kassett (ABC) transporter, ModBC-A av Archeaglobus fulgidus. Dette systemet ble valgt for sin svært reproduserbare resultater, høy signal til støyforhold, og klassisk 'on / off "priser. I tillegg homologer ABC transportører er tilgjengelige for å tjene som viktige negative kontroller. Transportøren, ModBC (ligand A) ekstraheres fra membranen ved hjelp av vaskemiddel, renset og immobilisert på chipen. Sin løselig samspill partner, Moda, er analytten. Som en negativ kontroll-ligand, er en annen ABC-transportør RbsBC brukt ("ligand B").
SPR er en svært følsom metode for å studere molekylære interaksjoner, og er ofte den eneste tilnærming som gir sanntids overvåking av forbigående (men viktige) interaksjoner. Et eksempel er transient interaksjon presentert heri, som ikke kunne påvises ved hvilken som helst annen metode (pull-down-analyser, liposomer sedimente assays 6). Videre, mens andre fremgangsmåter er begrenset til likevekt målinger (enten kvantitativt eller kvalitativt), er SPR et av de få teknikker som måler også pre-likev…
The authors have nothing to disclose.
Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
BIAevaluation | GE Healthcare | ||
Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
Trizma base | Sigma | T1503 | |
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007–47——N | |
ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |