Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عدوى فيروسات الفئران الجنينية الجذعية المستمدة خلية خلايا الجسم مضغي لتحليل التمايز لدم

Published: October 20, 2014 doi: 10.3791/52022
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2,3
1Harper Cancer Research Institute, 2Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 3Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Protocol

1. مضغي الشكل الجسم (EB) تشكيل

  1. الجيلاتين التكيف مع المجالس الاقتصادية والاجتماعية التي حافظت على الخلايا الليفية الماوس الجنين (MEFs). المجالس الاقتصادية والاجتماعية مرور 3 مرات في 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة المغلفة مع 0.1٪ الجيلاتين لإزالة MEFs.
    1. تنمو الخلايا في وسائل الإعلام ESC الصيانة مع LIF للحفاظ على خلايا غير متمايزة (الجدول 1). جعل خلايا المؤكد لم تتجاوز 80٪ التقاء. استخدام مرور منخفضة (10 أو أقل بعد إزالة مقاطع من MEFs) الخلايا للتمايز.
  2. في اليوم قبل المجالس الاقتصادية والاجتماعية والثقافية وللEB التمايز، ومرور الخلايا بحيث أنها ستكون حوالي 50-70٪ متكدسة في اليوم التالي. الاستمرار في زراعة الخلايا ESC صيانة المتوسطة للاحتفاظ تعدد القدرات الخلية.
  3. في يوم تمايز والإعلام الصيانة نضح ESC وتغسل مع 1 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS: 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، و 11.9 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4) لكل بئر من لوحة 6 جيدا.
    1. إضافة 200 ميكرولتر من 0.25٪ trypsفي / EDTA إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    2. إبطال نشاط التربسين / EDTA مع 800 ميكرولتر من وسائل الإعلام التمايز. الماصة صعودا وهبوطا في 2 مل الماصة المصلية مع طرف P200 إلى تفكك الخلايا في تعليق خلية واحدة. تأكد من أن طرف P200 يلائم بشكل مريح على نهاية حتى وسائل الإعلام لا ترتفع بين الماصة واجهة طرف.
    3. الماصة صعودا وهبوطا بحوالي 5-10 مرات. والحرص على عدم خلق فقاعات خلال pipetting ل.
  4. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. طرح حجم 10 مل مع برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 315 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. إزالة طاف. غسل مرتين مع 5 مل PBS لإزالة ما تبقى وسائل الإعلام التي تحتوي على LIF. أجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.4 لكل غسل.
    1. resuspend الكرية خلية النهائي في 2 مل من وسائل الإعلام التمايز (الجدول 2).
  6. عد الخلايا مع عدادة الكريات أو خلية مكافحة وطبق 6،000-10،000 خلية / مل في 10 سم لوحة بيتري(ثقافة غير الأنسجة المعالجة).
    1. تحديد بالضبط خلية / مل تجريبيا لكل خط ESC. استخدام لوحات بتري معقمة تستخدم عادة للعمل بكتيرية أو لوحات التقيد منخفضة.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج التمايز، ينبغي أن تشكل EBS المجالات التي لا تزال معلقة دون ربط إلى اللوحة. اختبار العديد من العلامات التجارية لوحات منها لإيجاد أقل الالتزام.
    2. احتضان المجالس الاقتصادية والاجتماعية التفريق في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة مع 5٪ CO 2.
كاشف الأسهم تركيز النهائي حجم شركة عدد كتالوج
DMEM 1X 410 مل S IGMA / الدريتش D5796
FBS (ES المفحوص) 100٪ 15٪ 75 مل Hyclone SH30070.03E
الأحماض الأمينية غير الأساسية 100X 1X 5 مل تقنيات الحياة 11140
L-الجلوتامين 100X 1X 5 مل تقنيات الحياة 35050
Penncillin / الستبرتوميسين 100X 1X 5 مل تقنيات الحياة 15070
β-المركابتويثانول 14.3 M 114 ميكرومتر 4 ميكرولتر سيغما / الدريتش M3148
سرطان الدم التثبيطي عامل (LIF) 10 7 وحدة / مل 1،000 وحدة / مل 50 ميكرولتر ميليبور ESG1107
ontent "> الجدول 1: ESC صيانة وسائل الإعلام.

كاشف الأسهم تركيز النهائي حجم شركة عدد كتالوج
DMEM 1X 410 مل سيغما / الدريتش D5796
FBS (العضو فحص لتمايز الأمثل) 100٪ 15٪ 75 مل Hyclone SH30070.03E
الأحماض الأمينية غير الأساسية 100X 1X 5 مل تقنيات الحياة 11140
L-الجلوتامين 100X 1X 5 مل الحياة تقانةخيس 35050
Penncillin / الستبرتوميسين 100X 1X 5 مل تقنيات الحياة 15070
β-المركابتويثانول 14.3 M 114 ميكرومتر 4 ميكرولتر سيغما / الدريتش M3148

الجدول 2: التمايز وسائل الإعلام.

2. إعداد الخلايا لعدوى فيروس EB

  1. في المرحلة المطلوبة للتنمية (بين يوم 2 ويوم 3)، ونقل EBS من طبق بتري 10 سم إلى 15 مل أنبوب مخروطي. غسل لوحة مع 5 مل PBS وإضافة إلى غسل أنبوب مخروطي.
  2. بيليه EBS في 315 XG في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. غسل الخلايا EB مع 5 مل PBS.
  3. إضافة 1 مل من محلول مذاب مفرزة الخلية (يحتوي على بروتين الكولاجين والانزيمات) ووضع الأنابيب في 37 ° C حمام الماء (أو حاضنة) لمدة 30 دقيقة مع أورينتالتحريض asional (من vortexing لعبها أو الضوء).
  4. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام التمايز. الماصة صعودا ونزولا مع الماصة 2 مل مع طرف الماصة P200. وضع أنبوب في 37 ° C حمام الماء مرة أخرى لمدة 30-60 دقيقة.
  5. تدور أسفل الخلايا في 315 x ج لمدة 5 دقائق وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.

عدوى فيروس 3.

  1. resuspend الخلايا في 1.5 مل من وسائل الإعلام التمايز. نقل تعليق خلية إلى 6 جيدا غير الأنسجة الثقافة وحة المعالجة.
  2. إعداد الارتجاعي من التقنيات القياسية في وقت مبكر. إضافة 5-100 ميكرولتر من طاف الفيروسي لخلايا اعتمادا على عيار الفيروسية. لا تضيف polybrene لتعزيز العدوى لأن هذا يحول دون إصلاح لاحق من EBS.
  3. Spinoculate الخلايا مع الفيروس عن طريق الطرد المركزي في 2،120 x ج لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

4. التفريق الفيروسية الخلايا المصابة EB في قطرات شنقا

  1. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام التمايز إلى كل بئر من طnfected EB التعليق الخلية.
  2. الماصة 3.5 مل من المصابين EB تعليق خلية في خزان معقم كاشف للmultipipettors. استخدام الماصة 15-20 multipipettor إلى صفوف من ثمانية 20 ميكرولتر قطرات على الغطاء المقلوب من 15 سم لوحة بيتري.
  3. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة أو المياه إلى النصف السفلي من لوحة بيتري. ثم قلب الغطاء مع قطرات ومكان على طبق بيتري. تأكد من أن قطرات معلقة رأسا على عقب من غطاء مع برنامج تلفزيوني أو الماء أقل للحفاظ على ترطيب الغرفة.
  4. ضع الأطباق في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة مع 5.0٪ CO 2.
  5. بعد 2 أيام، جمع EBS شكلت في قطرات شنقا بواسطة قلب الغطاء والغسيل مع 4.5 مل من وسائل الإعلام التمايز.
    1. وسائل الاعلام نقل وEBS للثقافة 10 سم غير الأنسجة بيتري لوحة جديدة. غسل غطاء مرة أخرى مع 3 مل من وسائل الإعلام التمايز ونقل إلى 10 سم لوحة.
  6. حصاد الخلايا لتحليلها من قبل التدفق الخلوي بعد ما مجموعه 8أيام الثقافة بدءا من نقل الخلايا الأولية إلى وسائل الإعلام التمايز (-LIF).

5. إعداد الخلايا لتحليل تدفق عداد الكريات

  1. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل مع 10 مل الماصة. غسل لوحة مع 5 مل PBS ونقل إلى نفس أنبوب مخروطي.
  2. خلايا بيليه في 315 ز س. غسل الكريات مع 10 مل PBS.
  3. إضافة 1 مل من محلول مذاب مفرزة الخلية ووضع الأنابيب في 37 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة مع الإثارة في بعض الأحيان. للكشف عن بعض مستضدات سطح الخلية، التربسين يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك.
  4. إضافة 1 مل سائل الإعلام التمايز والماصة صعودا وهبوطا مع 2 مل الماصة. استخدام غيض P200 إلى نهاية الماصة للمساعدة في كسر المتابعة هضمها EB في تعليق خلية واحدة.
    1. وضع أنبوب في 37 ° C حمام الماء مرة أخرى لمدة 60 دقيقة حتى يتسنى للبروتينات الغشاء متكاملة لإعادة تدوير إلى سطح الخلية.
  5. بيليه الخلايا في 315 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. غسل واي خلاياال 0.1٪ مصل بقري الزلال جزء V (BSA) التي أعدت في برنامج تلفزيوني (PBS / BSA)، واحتضان الخلايا مع محددة الموسومة fluorescently الأجسام المضادة.

6. تحليل التدفق الخلوي للدم الأسلاف

  1. وضع 10 6 خلايا EB المستمدة في الجولة 5 مل 12 × 75 مم أنبوب أسفل. لضبط إعدادات تدفق عداد الكريات التعويض، استخدام الخرز التعويض وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. خلايا بيليه في 315 ز س. تخلصي من طاف و resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني المتبقية الحل / BSA في الأنبوب.
  3. للكشف عن ESC HPCS، احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الفلورسنت المسمى: مكافحة فأر CD41-PE (R-Phycoerytherin) ومكافحة فأر CD117 (cKit) -APC / CY7 (Allophycocyanin Cyanine 7).
    1. تمييع الأجسام المضادة 1: 100 في برنامج تلفزيوني / BSA. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخفف لكل عينة. تحديد الصحيح التخفيف من الأجسام المضادة لكل بائع، استنساخ، والكثير أو الأجسام المضادة. تحديد التخفيف الأمثل لوصفها الخلايا بشكل فردي.
    2. احتضان العينات على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة.
    3. إضافة 2 مل PBS / BSA وبيليه الخلايا في 315 x ج لمدة 5 دقائق.
    4. نضح وطاف بيليه resuspend في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني أو متساوي التوتر عازلة أخرى.
    5. مرشح معلق الخلايا من خلال مصفاة غطاء الخلية (0.35 ميكرومتر) لإزالة الركام الخلية الكبيرة.
    6. تحليل الخلايا على وعداد الكريات التدفق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه الدراسات مهيلم RW4 (مشتقة من 129X1 / SVJ سلالة الماوس) المجالس الاقتصادية والاجتماعية تم استخدامها. تم عزل EBS في 3 أيام من التمايز. للحصول على أفضل النتائج يجب أن يكون EBS كروية وغير ملتصقة (الشكل 1A، B). بعد spinoculation بفيروس المشارك تعبر عن GFP علامة الفلورسنت جنبا إلى جنب مع الجينات في المصالح، تم إصلاحه EBS بواسطة طريقة قطرة شنقا. تم إصلاحه EBS بنجاح من الايقاف الخلية أعدت من 2.0، 2.5، و 3.0 يوم EBS. ومع ذلك، EBS لا يمكن إصلاحه من تعليق خلية المحضرة من اليوم 4.0 EBS. لوحظ الخيمرية من EBS بين الخلايا المصابة وغير المصابة بواسطة المجهر مضان في يوم 8 من التمايز (الشكل 2A، B). كثافة EBS كثيرا ما يجعل تظهر EBS أن تكون 100٪ GFP إيجابية. ومع ذلك، مع التركيز على طائرات التنسيق المختلفة يمكن أن تكشف عن خلايا مساهمة الإيجابية والسلبية GFP إلى EBS (الشكل 2B).

FOتحليل ص التنمية HPC، تم فصلها EBS خيالية في تعليق خلية واحدة بعد 8 أيام من التمايز. استعداء نشاط ميرنا (ق) من الكتلة mirn23a (ميرس-23A، 24-2، و-27) النتائج في عدم قدرة المجالس الاقتصادية والاجتماعية للتمييز في الأسلاف الدم (مخطوط قيد الإعداد). لتحديد ما إذا overexpression من الكتلة mirn23a له تأثير معاكس، أصيبوا المجالس الاقتصادية والاجتماعية في بداية التمايز. ومع ذلك، وهذا يؤدي إلى توليد انخفضت HPCS. منذ الكتلة mirn23a يمكن أن تشارك في TGFß / BMP / لل Smad يشير 18-21، قد يكون الكتلة آثار واضحة عندما أعرب في مراحل مختلفة من تطور مماثل EB إلى BMP4 تنشيط Smad1 البروتين 12،13. باستخدام هذا البروتوكول، أصيب EB تعليق خلية واحدة بعد 3 أيام من التمايز. تم إصلاحه EBS شنقا قطرة، وبعد ذلك تحليلها في يوم 8 لتوليد HPC بواسطة معايرة CD41 وسطح الخلية CD117 expressioن التدفق الخلوي. CD41 + الخلايا إيجابية واحدة هي مجموعة من HPCS البدائية ونهائي، في حين أن الخلايا CD41 + + CD117 تحتوي فقط HPCS نهائي 22،23. لاحظنا زيادة كبيرة في عدد السكان الإجمالي للCD41 + HPCS في الخلايا MSCV-mirn23a المصابة مقارنة مع الخلايا المصابة بالفيروس السيطرة MSCV (الشكل 3). يوضح الشكل أيضا أن مساهمة عالية من الخلايا المصابة إلى EBS إصلاح لا يمكن أن يتحقق. من المهم أن تصيب EBS مع كل من فيروس تحكم تعبر عن بروتين فلوري وحدها، وكذلك تصيب الخلايا مع فيروس التجريبية. ثم ينبغي أن تقارن السكان المصابين (GFP +) للاختلافات في النمط الظاهري. دراسة الفروق بين الخلايا غير المصابة مقابل الخلايا المصابة قد تعطي نتائج خاطئة. مقارنة GFP- (غير مصاب)، وGFP + (المصابة) ظل السكان هناك فرق في السكان CD41 في كل من MSCV والثقافات MSCV-mirn23a (الشكل 3). قد تكون هذه الزيادةإلى الفيروسات التي تصيب الخلايا التكاثري.

الشكل 1
الشكل 1: 3 يوم الممثل الهيئات مضغي كانت تحول RW4 المجالس الاقتصادية والاجتماعية ESC من وسائل الاعلام وسائل الاعلام في صيانة التمايز ومثقف في 10 سم لوحات (A) وترد 4X و (B) 10X صورا لجثث مضغي الشكل التي تطورت بعد 3 أيام من الثقافة.. في الصورة 4X يمثل شريط 1،000 ميكرون، بينما في الصورة 10X يمثل شريط 400 ميكرون.

الشكل 2
الشكل 2: ثمانية يوم الهيئات مضغي الشكل (EB) إصلاحه من يوم 3 خلايا EB المصابة فيروسات. (A) يسار الصور الجانبية حقل مشرق. (B) الأعمدة الثلاثة الفلورسنت الفلورسنت من الصور إلى اليمين هي نفس EB المتنوعة التي اتخذت فيferent طائرات التنسيق. في الصور 4X يمثل شريط 1،000 ميكرون، في حين أنه في 10X الصور يمثل شريط 400 ميكرون.

الرقم 3
تم إعداد تحليل التدفق الخلوي للخلايا المكونة للدم السلف المنتجة في EBS خيالية الخلايا واحد من تعليق D3 EBS، والمصابين الفيروسات القهقرية المبين: الرقم 3. تم إصلاحه EBS شنقا قطرة، ومثقف 8 أيام إضافية. تم إنشاء تعليق خلية واحدة وحضنت مع الأجسام المضادة fluorescently المسمى إلى CD41، وCD117. تظهر قطع اليد اليسرى في الرسم البياني GFP- (الخلايا غير المصابة) وGFP + (الخلايا المصابة) بوابات. تظهر لوحات اليد اليمنى اللون نقطة مؤامرة خلايا إيجابية لCD41، CD117 والتعبير في GFP- وGFP + البوابات. تم العثور على الأسلاف البدائية المكونة للدم في CD41 + الكسور، والأسلاف نهائية موجودة في كل من CD41 + CD117-، وCD41 + + CD117 الكسور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كما نوقش أعلاه، يمكن أن تتولد استنساخ ESC التي تعبر عن inducibly الجينات ذات الاهتمام باستخدام نظم الدوكسيسيكلين، ومع ذلك، جيل من هذه السطور هو وقتا طويلا وعمالة كثيفة. الموصوفة في هذا البروتوكول هو وسيلة للتعبير عن الجينات في المصالح في تعليق خلية واحدة أعدت من ESC المستمدة EBS. ثم يتم إصلاح هذه الخلايا المصابة في EBS شنقا انخفاض لدراسة التمايز لاحق. في المثال (الشكل 3)، يتبين أن التعبير عن الكتلة mirn23a يعزز تنمية المكونة للدم عندما أعرب في يوم 3 من التمايز. عند هذه النقطة قد حدث تطور الوليدة الأنسجة طبقة الجرثومية بما في ذلك الأديم المتوسط ​​المبكر الذي يؤدي إلى الأسلاف الدم. في يوم 2 و 3 من RW4 ESC التمايز والتعبير عن الجينات تمثل الأديم الظاهر (Pax6)، تم الكشف عن الأديم الباطن (FoxA2)، والأديم المتوسط ​​(T، تويست، وTbx6) بواسطة PCR الكمي الناسخ العكسي (Q-RT-PCR، بيانات غير معروضة). لميلrn23a لتعزيز إنتاج HPC، قد تحتاج إلى أن تتجلى في الأديم المتوسط ​​في وقت مبكر. هذا الأسلوب يسمح للقدرة على تحديد ما إذا كان التحوير له تأثيرات مختلفة على تعبيرها الزمني دون إنفاق الكثير من الجهد لتوليد الكواشف الجديدة. على مراقبة الظواهر المرتبطة التعبير الزمني متميزة، محقق قد تريد أن تنفق الآن جهود لتوليد خطوط محرض حيث التعبير عن التحوير يمكن السيطرة عليها بإحكام.

وتشمل التطبيقات الأخرى لهذه التقنية إجراء التجارب الإنقاذ في المجالس الاقتصادية والاجتماعية على حد سواء حيث الأليلات من الجينات التي تهم تم حذف (مزدوجة خروج المغلوب المجالس الاقتصادية والاجتماعية، DKOs). يمكن إعادة إدخال هذا الجين wildtype أو الإصدارات تحور الجين حذف إلى خلايا EB التفريق. يمكن أن يعاير بالإضافة إلى إنقاذ النمط الظاهري عن طريق الجينات المصب من الجين حذفها. هذه الطريقة يمكن استخدامها لدراسة الطبيعة الجوهرية خلية من الظواهر المرصودة. على سبيل المثال في hematopoiesis، وقد لوحظت عيوب في الجينات التي تؤثر إما الجذعية المكونة للدم والخلايا الاصلية نفسها أو في بعض الأحيان الخلل قد يؤثر على الخلايا في المكروية أن هناك حاجة إلى دعم تطوير خلايا الجذعية والسلف 16،24. في هذا النظام، إذا كان عيب متأصل في الخلايا الاصلية المكونة للدم، ثم إعادة إدخال هذا الجين wildtype سوف انقاذ فقط تطوير المكونة للدم في GFP + الخلايا (المصابة فيروسات). إذا كان الخلل غير خلية مستقلة، ثم عدوى فيروس سيؤدي إلى الإنقاذ للتنمية المكونة للدم يجري الاحتفال في كل GFP + والسكان GFP-.

في هذا البروتوكول التدفق الخلوي يستخدم لتحديد الخلايا المكونة للدم السلف من التعبير سطح الخلية من CD41 و CD117. بدلا من ذلك، بعد 8 أيام من تمايز الخلايا المصابة GFP + يمكن عزلها مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). ويمكن بعد ذلك يعاير الخلايا معزولة عن وجود سالأسلاف المكونة للدم ecific بواسطة المقايسات مستعمرة المكونة للدم في وسائل الإعلام ميثيل كما وصفناها سابقا 25،26. وبالمثل، RNA يمكن استخراجها من خلايا فرزها وتحليلها من أجل التعبير عن جينات محددة النسب.

الاستفادة من تقنية الموضحة هو أنه يتطلب الحد الأدنى من الجهد لتوليد الكواشف اللازمة، ويسمح للتعبير الزمني للالتحوير في EB النامية. إذا كان ناقلات فيروسية شارك في التعبير عن الجينات في المصالح مع بروتين فلوري متاح بالفعل تجربة لا يمكن أن يؤديها على الفور. هناك بعض القيود التي يتعين النظر فيها مع اختيار لاستخدام هذا البروتوكول. تقنية المذكورة هنا لا تتطلب القدرة على إنتاج الارتجاعي عالية عيار لدينا عدد كاف من الخلايا لتحليلها. نلاحظ أيضا أن استخدام الارتجاعي يمكن أن يؤدي إلى إقحامي الطفرات التي يمكن أن تسفر عن النمط الظاهري. ولكن منذ هذا البروتوكول بفحص مجموعة من الخلايا المصابة بدلا منالسكان نسيلي، هو أقل احتمالا أن النمط الظاهري بسبب الطفرات إقحامي وسيراعى خلال وقت قصير من الثقافة. القيد الرئيسي للتقنية (مقارنة مع نظام محرض مثل في نظام تيت) هو أن التعبير عن التحوير لا يمكن إسكاته في نقطة زمنية لاحقة، وليس هناك القدرة على التحكم في مستويات التعبير. المجالس الاقتصادية والاجتماعية التي تعبر عن التحوير تحت سيطرة تنظيم الدوكسيسيكلين هو مفيد لأنه يسمح ليس فقط للتحول على الجين بطريقة الزمنية، ولكنه يسمح أيضا لإيقاف الجين في timepoint لاحق. سوف متفاوتة على مبلغ محفز مثل الدوكسيسيكلين أيضا تسمح للمستخدم لصقل التعبير. وأخيرا أنظمة محرض تسمح للتعبير استنساخه من التحوير في كل الخلايا، بينما في هذا البروتوكول فيروسات هناك تعبير خيالية من التحوير. كما نوقش أعلاه رغم أن هذا التعبير خيالية يمكن أن تكون ذات قيمة لبعض التطبيقات. نظم محرض تقدم بوضوحالكثير من المزايا. ولكن نظرا لسهولة وانخفاض نفقة تقنية الموضحة هنا، وسوف تجد العديد من المحققين أنه من المفيد لدراستهم من تمايز الخلايا الجذعية الجنينية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة في الكشف عنها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma/Aldrich D5796
β-mercaptoethanol Sigma/Aldrich M3148
FBS (ES Screened) Hyclone SH30070.03E
FBS (Defined) Hyclone SH30070.03
Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140
L-Glutamine Life Technologies 35050
Penn/Strep Life Technologies 15070
Trypsin/EDTA Life Technologies 25200
LIF ESGRO Millipore ESG1107
ACCUMAX Millipore SCR006
Trypsin/EDTA Life Technologies 25200
Falcon Tissue Culture Plates 6-well Fisher Scientific 08-772-1B
Falcon Non-treated Plates 6-well Fisher Scientific 08-772-49
Falcon Petri dish 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Falcon Petri dish 15 cm Fisher Scientific 08-757-148
Falcon Tube 5 ml Fisher Scientific 14-959-11A
Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap Fisher Scientific 08-771-23
White sterile resevoirs U.S.A. Scientific 111-0700
Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated Biolegend 133906
Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated Biolegend 105826
RW4 ESCs ATCC CRL-12418

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  2. Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).
  3. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  4. Tian, X., Kaufman, D. S. Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls. Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).
  5. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
  6. Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336, 348-352 (1988).
  7. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323, 445-448 (1986).
  8. Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
  9. Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).
  10. Smith-Arica, J. R., et al. Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors. Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).
  11. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
  12. Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment. Blood. 117, 6489-6497 (2011).
  13. Zafonte, B. T., et al. Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window. Blood. 109, 516-523 (2007).
  14. Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell. 109, 29-37 (2002).
  15. Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).
  16. Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. Mesodermal patterning activity of SCL. Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).
  17. Kyba, M., et al. Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).
  18. Cao, M., et al. MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells. Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).
  19. Chan, M. C., et al. Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression. EMBO J. 29, 559-573 (2010).
  20. Huang, S., et al. Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer. 123, (2008).
  21. Min, S., et al. TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7. Genes Immun. 13, 621-631 (2012).
  22. Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo. Blood. 101, 508-516 (2003).
  23. Mitjavila-Garcia, M. T., et al. Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells. Development. 129, 2003-2013 (2002).
  24. Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews. Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).
  25. Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development. Embo J. 21, 2220-2230 (2002).
  26. Dahl, R., et al. Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor. Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 92، الخلايا الجذعية الجنينية، مضغي الشكل الجسم، الخلايا المكونة للدم السلف، الارتجاعي، التعبير الجيني، جين الزمني التعبير
عدوى فيروسات الفئران الجنينية الجذعية المستمدة خلية خلايا الجسم مضغي لتحليل التمايز لدم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bikorimana, E., Lapid, D., Choi, H., … More

Bikorimana, E., Lapid, D., Choi, H., Dahl, R. Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation. J. Vis. Exp. (92), e52022, doi:10.3791/52022 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter