Protocol
1. Embryoidkörper (EB) Bildung
- Gelatine-Anpassung WSR, die auf Mausembryo-Fibroblasten (MEF) gehalten wurden. Passage WSR 3 mal am 6. Gewebekulturplatte mit 0,1% Gelatine beschichtet, um MEFs entfernen.
- Wachsen Zellen im ESC Wartung Medien mit LIF, um die Zellen undifferenziert (Tabelle 1) zu halten. Stellen Sie sicher, Zellen 80% Konfluenz nie überschreiten. Verwenden Sie niedrige Durchgang (10 oder weniger Stellen nach dem Entfernen von MEF-Zellen) für die Differenzierung.
- Am Tag vor WSR sind für EB Differenzierung kultiviert, Durchgang die Zellen, so dass sie etwa 50-70% konfluent am nächsten Tag. Weiter Kultivieren von Zellen in Erhaltungsmedium ESC zu Zelle Pluripotenz behalten.
- Am Tag der Differenzierung, absaugen ESC Erhaltungsmedium und Waschen mit 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 11,9 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) pro Vertiefung einer 6-Well-Platte.
- Geben Sie 200 ul von 0,25% trypsin / EDTA zu jeder Vertiefung und bei 37 ° C für 3 min.
- Inaktivierung des Trypsin / EDTA mit 800 ul der Differenzierung Medien. Pipette auf und ab in einem 2 ml-Pipette mit einer serologischen p200 Spitze gegen Aufbruch der Zellen in einer Einzelzellsuspension. Sicherzustellen, dass die p200 Spitze passt genau auf das Ende so Medien geht nicht zwischen der Pipettenspitze und Schnittstelle.
- Pipette auf und ab ca. 5-10 mal. Achten Sie darauf, Blasen beim Pipettieren erstellen.
- Übertragungszellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Um das Volumen auf 10 ml mit PBS. Zentrifuge bei 315 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Überstand entfernen. Zweimal waschen mit 5 ml PBS Reste enthält, LIF entfernen. Zentrifuge nach Schritt 1.4 für jede Waschung.
- Resuspendieren endgültige Zellpellet in 2 ml Differenzierungsmedium (Tabelle 2).
- Zählen von Zellen mit einer Zählkammer oder Zellzähler und Platte 6.000-10.000 Zellen / ml in einer 10 cm Petrischale(Nicht-Gewebekultur-behandelten).
- Bestimmen Sie die genaue Zellen / ml empirisch für jede Zeile ESC. Sterile Petrischalen in der Regel für die bakterielle Arbeit oder geringe Haftung Platten verwendet.
HINWEIS: Die besten Ergebnisse Differenzierung, sollte das EBS Kugeln, die in Suspension bleiben, ohne Befestigung an der Platte zu bilden. Testen Sie mehrere Marken von Platten, um diejenigen mit der geringsten Einhaltung zu finden. - Die Differen WSR inkubieren bei 37 ° C Brutschrank mit 5% CO 2.
- Bestimmen Sie die genaue Zellen / ml empirisch für jede Zeile ESC. Sterile Petrischalen in der Regel für die bakterielle Arbeit oder geringe Haftung Platten verwendet.
| Reagens | Lager | Endkonzentration | Volumen | Firma | Katalognummer |
| DMEM | 1x | 410 ml | S igma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (ES abgeschirmt) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Nicht-essentielle Aminosäuren | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 35050 |
| Penncillin / Streptomycin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-Mercaptoethanol | 14,3 M | 114 uM | 4 ul | Sigma / Aldrich | M3148 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | 10 7 Einheiten / ml | 1.000 Einheiten / ml | 50 ul | Millipore | ESG1107 |
| Reagens | Lager | Endkonzentration | Volumen | Firma | Katalognummer |
| DMEM | 1x | 410 ml | Sigma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (User Abgeschirmte für optimale Differenzierung) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Nicht-essentielle Aminosäuren | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamin | 100x | 1x | 5 ml | Leben TechnoloGies | 35050 |
| Penncillin / Streptomycin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-Mercaptoethanol | 14,3 M | 114 uM | 4 ul | Sigma / Aldrich | M3148 |
Tabelle 2: Differenzierung Medien.
2. Vorbereitung EB Zellen für Virus-Infektion
- Bei der gewünschten Ausbaustufe (zwischen Tag 2 und Tag 3), übertragen Sie die EVG aus der Petrischale 10 cm bis 15 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte mit 5 ml PBS und fügen Sie den zu waschen, um die konische Röhre.
- Pellet die EVG bei 315 × g bei Raumtemperatur für 5 min. Mit 5 ml PBS waschen Sie die EB-Zellen.
- 1 ml der aufgetauten Zellablösung Lösung (mit proteolytischen Enzymen und kollagenolytischen) und legen Sie die Röhrchen in einem 37 ° C warmen Wasserbad (oder Inkubator) für 30 min mit occasional Agitation (von schnippen oder Licht Vortex).
- 1 ml Differenzierungsmedium. Pipette auf und ab mit einer 2-ml-Pipette mit einem p200 Pipettenspitze. Das Röhrchen wird in 37 ° C warmen Wasserbad wieder für 30-60 min.
- Spin-Down der Zellen bei 315 xg für 5 min und waschen Sie die Zellen mit PBS.
3. Virus-Infektion
- Resuspendieren der Zellen in 1,5 ml Differenzierungsmedium. Übertragen der Zellsuspension auf eine 6-Well-Gewebekultur nicht behandelten Platte.
- Bereiten Sie das Retrovirus durch Standardverfahren vor der Zeit. Hinzufügen von 5 bis 100 ul Virusüberstand, um Zellen abhängig von viralen Titer. Sie Polybren nicht hinzufügen, um eine Infektion zu erhöhen, da dies hemmt die spätere Reformation der EVG.
- Spinoculate der Zellen mit Virus durch Zentrifugieren bei 2.120 × g für 90 min bei Raumtemperatur.
4. Differenzierung Viral Infizierte EB Zellen in hängenden Tropfen
- 2 ml Differenzierungsmedium in jede Vertiefung infected EB Zellsuspension.
- Pipette 3,5 ml EB infizierten Zellsuspension in ein steriles Reagenz Reservoir für multipipettors. Verwenden Sie die multipipettor 15-20 Reihen von acht 20 ul Tropfen auf dem umgekehrten Deckel des 15 cm Petrischale pipettieren.
- 10 ml steriler PBS oder Wasser auf die untere Hälfte der Petrischale. Dann kehren die Deckel mit den Tropfen und Ort auf die Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen auf den Kopf von Deckel mit PBS oder Wasser unten hängen zu halten, der Kammer befeuchtet.
- Die Schalen werden in den 37 ° C Brutschrank mit 5,0% CO 2.
- Nach 2 Tagen sammeln EBs Tropfen durch Invertieren Deckel und Waschen mit 4,5 ml Differenzierungsmedium im hängenden gebildet.
- Übertragungsmedien und EBS zu einem neuen 10 cm nicht-Gewebekulturpetrischale. Mit 3 ml Differenzierungsmedium und Transfer zum 10 cm Teller waschen Sie den Deckel wieder.
- Ernten der Zellen für die Analyse durch Durchflusszytometrie nach insgesamt 8Tagen Kultur ausgehend von der anfänglichen Übertragung von Zellen auf Differenzierungsmedium (-LIF).
5. Vorbereitung Zellen für Durchflusszytometer-Analyse
- Übertragungszellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen mit einer 10-ml-Pipette. Waschen Sie die Platte mit 5 ml PBS und Transfer zum gleichen konischen Rohr.
- Pellet-Zellen bei 315 x g. Pellets mit 10 ml PBS waschen.
- 1 ml der aufgetauten Zellablösung Lösung und legen Sie die Röhrchen in einem 37 ° C Wasserbad für 30 min mit gelegentlichem Rühren. Für den Nachweis von bestimmten Zelloberflächenantigenen, kann Trypsin stattdessen verwendet werden.
- 1 ml Differenzierung Medien und pipettieren nach oben und unten mit einem 2-ml-Pipette. Verwenden Sie ein p200 Spitze zum Ende der Pipette zu helfen, brechen-up verdaut EB in Einzelzellsuspension.
- Das Röhrchen wird in ein 37 ° C Wasserbad für 60 min wieder, damit die integrale Membranproteine auf der Zelloberfläche zu recyceln.
- Pellet-Zellen bei 315 × g für 5 min.
- Waschen Sie die Zellen with 0,1% Rinderserumalbumin Fraktion V (BSA) in PBS (PBS / BSA) hergestellt und Inkubation der Zellen mit spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern.
6. Durchflusszytometrie-Analyse für hämatopoetische Vorläufer
- Platz 10 6 EB-abgeleiteten Zellen in einem 5 ml 12 x 75 mm Rundrohr unten. Zur Einstellung Durchflusszytometer Korrektureinstellungen verwenden Entschädigung Perlen nach Herstelleranweisungen.
- Pellet-Zellen bei 315 x g. Überstand abgießen und Pellet in Rest PBS / BSA-Lösung in der Röhre.
- Zum Erfassen ESC HPC, Inkubation der Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörper: anti-Maus-CD41-PE (R-Phycoerythrin) und Anti-Maus-CD117 (CKIT) -APC / CY7 (Allophycocyanin Cyanin 7).
- Verdünnte Antikörper 1: 100 in PBS / BSA. 100 ul des verdünnten Antikörpers zu jeder Probe. Bestimmen Sie die richtige Verdünnung des Antikörpers für jeden Lieferanten, Klon und viel oder Antikörper. Bestimmen Sie optimale Verdünnung für die Markierung von Zellen einzeln.
- Proben auf Eis inkubieren im Dunkeln für 30 min.
- 2 ml PBS / BSA-und Pellet-Zellen bei 315 × g für 5 min.
- Überstand wird abgesaugt und das Pellet erneut in 300 ul PBS oder einem isotonischen Puffer.
- Filter resuspendierten Zellen durch eine Zelle Sieb Kappe (0,35 uM), um große Zellaggregate zu entfernen.
- Analysieren Zellen mit einem Durchflusszytometer.
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Representative Results
In diesen Studien verkleistert RW4 (abgeleitet von 129X1 / SVJ Mausstamm) WSR verwendet wurden. EBs wurden nach 3 Tagen der Differenzierung isoliert. Für beste Ergebnisse sollte das EBS kugelförmig und nicht haft (Abbildung 1A, B). Nach spinoculation mit Virus co-exprimieren, die Fluoreszenzmarker GFP zusammen mit einem Gen von Interesse wurden EBs des Hängetropfenverfahren reformiert. EBs wurden erfolgreich aus Zellsuspensionen von 2,0, 2,5 und 3,0 Tage EVG vorbereitet reformiert. Allerdings könnte EVG nicht aus Zellsuspensionen von Tag 4.0 EVG vorbereitet reformiert werden. Der Chimärismus des EBS zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen wurde durch Fluoreszenzmikroskopie an Tag 8 der Differenzierung (2A, B) beobachtet. Die Dichte des EBS macht oft das EBS zu sein scheinen 100% GFP positiv. Jedoch, die sich auf verschiedenen Fokusebenen können zeigen, den Beitrag der GFP positiven und negativen Zellen an die EVG (2B).
For Analyse der HPC-Entwicklung, wurden chimären EVG in Einzelzellsuspensionen nach 8 Tagen der Differenzierung dissoziiert. Entgegenwirken der Aktivität der miRNA (n) des mirn23a Cluster (miRs-23a, 24-2 und -27) führt zu einer Unfähigkeit der WSR auf (in Vorbereitung Manuskript) in Blutvorläuferzellen differenzieren. Zu bestimmen, ob die Überexpression des mirn23a Cluster hat den gegenteiligen Effekt, wurden WSR zu Beginn der Differenzierung infiziert. Dies resultiert jedoch in der Erzeugung einer verminderten HPC. Da die mirn23a Cluster kann in TGFß / BMP / Smad beteiligt Signalisierungs 18-21 kann der Cluster unterschiedliche Wirkungen haben, wenn in verschiedenen Stadien der Entwicklung EB ähnlich der BMP4 aktiviert Smad1 Protein 12,13 ausgedrückt. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden Einzelzellsuspensionen EB nach 3 Tagen der Differenzierung infiziert. EBs wurden von hängenden Tropfen durch Testen CD41 und CD117 Zelloberfläche expressio reformiert, und anschließend bei Tag 8 für HPC-Generation analysiertn durch Durchflusszytometrie. CD41 + Einzel positiven Zellen sind ein Pool von primitiven und definitiven HPC, während CD41 + CD117 + Zellen enthalten nur endgültige HPC 22,23. Wir beobachteten einen signifikanten Anstieg in der Gesamtpopulation von CD41 + HPC in der MSCV-mirn23a infizierten Zellen im Vergleich zu den Kontroll MSCV-Virus infizierten Zellen (Figur 3). Die Figur zeigt auch, dass ein hoher Anteil der infizierten Zellen, um den reformierten EBs erreicht werden. Es ist wichtig, EBs sowohl mit einem Kontrollvirus das fluoreszierende Protein allein exprimiert, sowie Infektion von Zellen mit dem experimentellen Virus infizieren. Infizierten Populationen (GFP +) sollte dann für Unterschiede im Phänotyp verglichen werden. Prüfung Unterschiede zwischen nicht-infizierten Zellen gegenüber infizierten Zellen können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Vergleichen GFP (nicht infizierten) und GFP + (infiziert) Populationen gibt es einen Unterschied in der CD41 Populationen sowohl in der MSCV und MSCV-mirn23a Kulturen (Figur 3). Dieser Anstieg kann durch seinRetroviren infizieren proliferativen Zellen.
Abbildung 1: Repräsentative Tag 3 Embryoidkörpern RW4 WSR wurden von ESC Wartung Medien in Differenzierungsmedium eingeschaltet und in 10 cm-Platten kultiviert (A) 4X und (B) 10X Bilder werden von Embryoidkörpern, die nach 3 Tagen der Kultur entwickelt gezeigt... Im 4X Bild der Balken stellt 1000 um, während in der 10X Bild der Balken repräsentiert 400 um.
Abbildung 2: Acht Tage Embryoidkörpern (EB) von retroviralen infizierten Tag 3 EB Zellen reformiert. (A) linken Seite Bilder sind hell Feld. (B) Die drei Spalten der fluoreszierenden Leuchtstoff Bilder auf der rechten Seite sind die gleichen EB in dif genommenschiedlichen Brennebenen. In den 4X-Bilder der Balken stellt 1000 um, während in den 10X Bilder der Balken repräsentiert 400 um.
Abbildung 3:. Durchflusszytometrie von hämatopoetischen Vorläuferzellen in chimären EBs produziert Einzelzellen-Suspensionen wurden aus d3 EBs mit den genannten Retroviren hergestellt und infiziert. EBs wurden von hängenden Tropfen reformiert, und kultiviert eine zusätzliche 8 Tage. Einzelzellsuspensionen wurden erzeugt und mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern gegen CD41 und CD117 inkubiert. Linke Hand Histogramm Plots zeigen die GFP (nicht-infizierten Zellen) und GFP + (infizierte Zellen) Tore. Die rechte Hand Tafeln zeigen Farbpunkt Grundstück von Zellen positiv für CD41, CD117 und Ausdruck in der GFP und GFP + Tore. Primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen werden in den CD41 + Fraktionen gefunden, und endgültige Vorfahren sowohl in der CD41 + CD vorhanden sind117- und CD41 + CD117 +-Fraktionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wie oben diskutiert, können Klone, die ESC induzierbar ein Gen von Interesse exprimieren mit Doxycyclin Systeme erzeugt werden, jedoch ist die Erzeugung dieser Leitungen zeitaufwendig und arbeitsintensiv. In diesem Protokoll beschrieben ist eine Methode, um ein Gen von Interesse in Einzelzellsuspension von ESC vorbereitet abgeleitet EVG auszudrücken. Diese infizierten Zellen werden dann durch hängenden Tropfen auf nachfolgende Differenzierung zu untersuchen, in EBs reformiert. In dem Beispiel (Figur 3) wird gezeigt, dass die Expression des mirn23a Cluster verbessert hämatopoetischen Entwicklung, wenn am Tag 3 der Differenzierung exprimiert. An diesem Punkt der Entwicklung des werdenden Keimgewebe aufgetreten einschließlich der frühen Mesoderm, die zu Blutvorläuferzellen gibt. Am Tag 2 und 3 der RW4 ESC Differenzierung, die Expression von Genen, die Ektoderm (Pax6), Entoderm (FOXA2) und Mesoderm (T, Twist und Tbx6) werden durch quantitative Reverse-Transkriptase-PCR (Q-RT-PCR, Daten nicht erkannt dargestellt). Für mirn23a HPC-Produktion zu steigern, muss es eventuell in der frühen Mesoderm ausgedrückt werden. Diese Technik ermöglicht die Fähigkeit zu bestimmen, ob ein Transgen hat unterschiedliche Wirkungen auf ihre zeitliche Expression ohne Aufwendung viel Aufwand neue Reagenzien zu erzeugen. Nach Beobachtung Phänotypen mit unterschiedlichen zeitlichen Expression assoziiert, ein Ermittler möchten Sie vielleicht jetzt verbringen die Mühe induzierbaren Linien, in denen die Expression des Transgens streng kontrolliert werden können erzeugen.
Andere Anwendungen für diese Technik gehören die Durchführung einer Rettungsversuche in WSR, in denen beide Allele des Gens von Interesse wurden gelöscht (Doppel KO WSR DKOS). Das Wildtyp-Gen oder mutierte Versionen der deletierte Gen konnte in die Differen EB-Zellen wieder eingeführt werden. Zusätzlich Rettung eines Phänotyps von Genen stromabwärts von dem Gen gelöscht getestet werden. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Zelle intrinsische Natur der beobachteten Phänotypen zu untersuchen. Zum Beispiel in hematopoiesis wurden Defekte in Genen, die entweder die hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen selbst oder manchmal den Mangel kann Zellen in der Mikroumgebung, die benötigt werden, um die Entwicklung von Stammzellen und Vorläuferzellen zu unterstützen 16,24 beeinflussen beeinflussen beobachtet. In diesem System wird, wenn der Mangel eigen hämatopoetischen Vorläuferzellen und dann die Wiedereinführung des Wildtyp-Gens nur Rettung hämatopoetischen Entwicklung in der GFP + (retroviral infizierten Zellen). Wenn der Mangel waren Nicht Zelle autonom, dann retrovirale Infektion würde zu einer Rettung von hämatopoetischen Entwicklung führen, dass sowohl GFP + und GFP-Populationen beobachtet.
In diesem Protokoll ist die Durchflusszytometrie verwendet, um hämatopoetische Vorläuferzellen durch die Zelloberflächenexpression von CD41 und CD117 zu identifizieren. Alternativ, nach 8 Tagen der Differenzierung infiziert GFP +-Zellen konnte durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert werden. Die isolierten Zellen können dann auf das Vorhandensein von sp untersucht werdenecific hämatopoetische Vorläufer von hämatopoetischen Kolonie-Assays in Methylcellulose Medien als wir zuvor beschrieben 25,26. In ähnlicher Weise kann RNA aus sortierten Zellen extrahiert und auf die Expression von linienspezifischen Genen analysiert werden.
Der Vorteil des beschriebenen Verfahrens ist, dass es erfordert wenig Aufwand, um die benötigten Reagenzien zu erzeugen, und ermöglicht eine zeitliche Expression eines Transgens in den Entwicklungs EB. Falls ein viraler Vektor co-exprimieren, die das Gen von Interesse mit einem fluoreszierenden Protein ist bereits der Versuch sofort durchgeführt werden. Es gibt ein paar Einschränkungen bei der Auswahl dieses Protokoll nutzen berücksichtigt werden. Die hier beschriebene Technik erfordert die Fähigkeit, hohe Titer-Retrovirus zu produzieren, um eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Analyse haben. Beachten Sie auch, dass die Verwendung des Retrovirus in Insertionsmutagenese, die einen Phänotyp ergeben könnte. Da jedoch dieses Protokoll prüft einen Pool von infizierten Zellen anstelle einerklonalen Population, ist es weniger wahrscheinlich, dass ein durch Insertionsmutagenese Phänotyp wird über die kurze Zeit der Kultur beobachtet werden. Die Hauptbeschränkung der Technik (im Vergleich zu einer induzierbaren System, wie in Tet-System) ist, dass die Expression des Transgens nicht zu einem späteren Zeitpunkt, zum Schweigen gebracht werden, und es gibt keine Möglichkeit, das Niveau der Expression zu steuern. WSR, die ausdrücken, ein Transgen unter der Kontrolle eines Doxycyclin-Regelung ist vorteilhaft, da es ermöglicht, nicht nur für das Einschalten des Gens in einer zeitlichen Weise, sondern ermöglicht auch das Ausschalten des Gens zu einem späteren Zeitpunkt. Variieren der Menge eines Induktors wie Doxycyclin wird dem Benutzer auch die Feinabstimmung der Expression ermöglichen. Schließlich induzierbaren Systeme ermöglichen reproduzierbare Expression des Transgens in den Zellen, während in diesem retroviralen Protokoll ist chimären Expression des Transgens. Wie oben diskutiert kann dies allerdings chimären Expressions wertvoll für einige Anwendungen geeignet sein. Die induzierbare Systeme bieten eine deutlichviele Vorteile. Aufgrund der Leichtigkeit und verringerte Kosten der hier beschriebenen Technik wird viele Forscher es nützlich für das Studium der Differenzierung embryonaler Stammzellen zu finden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen zu legen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
References
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