Protocol
1 embryoiden Body (EB) Vorming
- Gelatine-passen SER's die zijn aangehouden op de muis embryo fibroblasten (MEF). Passage SER 3 keer op 6 en weefselkweek plaat gecoat met 0,1% gelatine MEF verwijderen.
- Groeien cellen in ESC onderhoudsmedium met LIF om de cellen ongedifferentieerd (tabel 1) te houden. Zorg ervoor dat de cellen nooit meer dan 80% samenvloeiing. Gebruik lage passage (10 of minder passages na het verwijderen van MEF) cellen voor differentiatie.
- Op de dag voor SER worden gedurende EB differentiatie doorgang de cellen zodat ze ongeveer 50-70% confluent de volgende dag. Blijven kweken van cellen in ESC onderhoud medium naar cel pluripotency behouden.
- Op de dag van de differentiatie, aspiratie ESC onderhoudsmedium en wassen met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl en 11,9 mM fosfaatbuffer, pH 7,4) per putje van een 6-wells plaat.
- Voeg 200 ul van 0,25% trypsIn / EDTA aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten.
- Inactivatie van het trypsine / EDTA met 800 ul van differentiatie media. Pipet op en neer in een 2 ml serologische pipet met een P200 tip te breken-de cellen in een enkele celsuspensie. Zorg ervoor dat de p200 tip past precies op het uiteinde, zodat de media niet omhoog gaan tussen de pipet en tip-interface.
- Pipet op en neer ongeveer 5-10 keer. Zorg dat er geen luchtbellen te creëren tijdens het pipetteren.
- Overdracht cellen om een 15 ml conische buis. Breng het volume op 10 ml met PBS. Centrifugeer bij 315 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Verwijder supernatant. Was tweemaal met 5 ml PBS om de resterende media met LIF verwijderen. Centrifugeer zoals in stap 1.4 voor elke wasbeurt.
- Resuspendeer de uiteindelijke celpellet in 2 ml van differentiatie medium (tabel 2).
- Tellen cellen met een hemocytometer of celteller en plaat 6,000-10,000 cellen / ml in een 10 cm Petri schaaltje(Niet-weefselkweek behandeld).
- Bepaal de juiste cellen / ml empirisch voor elk ESC regel. Gebruik steriele Petri platen normaal gebruikt voor bacteriële werk of lage therapietrouw platen.
OPMERKING: Voor de beste differentiatie leidt, moet de EBS bollen die in suspensie blijven zonder bevestiging aan de plaat te vormen. Test verschillende merken van platen tot degenen met de minste therapietrouw te vinden. - Incubeer de differentiërende SER in een 37 ° C weefselkweek incubator met 5% CO2.
- Bepaal de juiste cellen / ml empirisch voor elk ESC regel. Gebruik steriele Petri platen normaal gebruikt voor bacteriële werk of lage therapietrouw platen.
| Reagens | Voorraad | Uiteindelijke concentratie | Deel | Bedrijf | Catalogusnummer |
| DMEM | 1x | 410 ml | S IGMA / Aldrich | D5796 | |
| FBS (ES Afgeschermde) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Niet-essentiële aminozuren | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamine | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 35050 |
| Penncillin / streptomycine | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-mercaptoethanol | 14.3 M | 114 uM | 4 ui | Sigma / Aldrich | M3148 |
| Leukemie Remmende Factor (LIF) | 10 7 eenheden / ml | 1000 eenheden / ml | 50 gl | Millipore | ESG1107 |
| Reagens | Voorraad | Uiteindelijke concentratie | Deel | Bedrijf | Catalogusnummer |
| DMEM | 1x | 410 ml | Sigma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (User Afgeschermde voor optimale differentiatie) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Niet-essentiële aminozuren | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamine | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 35050 |
| Penncillin / streptomycine | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-mercaptoethanol | 14.3 M | 114 uM | 4 ui | Sigma / Aldrich | M3148 |
Tabel 2: Differentiatie Media.
2 Voorbereiding EB Cellen voor Virus Infection
- Op het gewenste stadium van ontwikkeling (tussen dag 2 en dag 3), breng het EBS uit de 10 cm petrischaal tot 15 ml conische buis. Was de plaat met 5 ml PBS en voeg de was de conische buis.
- Pellet de EBS 315 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Was de EB cellen met 5 ml PBS.
- Voeg 1 ml van de ontdooide cellen loslaten oplossing (bevattende proteolytische en collagenolytische enzymen) en plaats de buizen in een 37 ° C waterbad (of incubator) gedurende 30 min met occasional agitatie (van vegen of licht vortexen).
- Voeg 1 ml van differentiatie media. Pipet op en neer met een pipet 2 ml van een p200 pipet tip. Plaats de buis bij 37 ° C waterbad gedurende 30-60 min weer.
- Draai de cellen af bij 315 xg gedurende 5 minuten en was de cellen met PBS.
3 Virus Infection
- Resuspendeer de cellen in 1,5 ml van differentiatie media. Breng de celsuspensie in een 6-well niet-weefselkweek behandelde plaat.
- Bereid de retrovirus door standaard technieken van tevoren. Voeg 5 tot 100 gl virus supernatant cellen afhankelijk van de virale titer. Voeg geen polybreen om infectie te verbeteren, omdat dit remt de verdere hervorming van EBS.
- Spinoculate de cellen met virus door centrifugeren bij 2120 xg gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
4 Onderscheidende Virale Besmette EB Cellen in Opknoping Drops
- Voeg 2 ml van differentiatie medium aan elk putje van infected EB celsuspensie.
- Pipetteer 3,5 ml EB geïnfecteerde celsuspensie in een steriele reagensreservoir voor multipipettors. Gebruik multipipettor 15-20 rijen van acht 20 ul druppels op het omgekeerde deksel 15 cm Petri schaaltje pipet.
- Voeg 10 ml steriel PBS of water om de onderste helft van de Petri plaat. Dan keer het deksel met de druppels en de plaats op de Petri plaat. Zorg ervoor dat de druppels opknoping ondersteboven van deksel met PBS of water onder te houden de kamer bevochtigd.
- Leg de schalen in de 37 ° C weefselkweek incubator met 5,0% CO 2.
- Na 2 dagen, verzamel EBS gevormd in de hangende druppels door het omkeren deksel en wassen met 4,5 ml van differentiatie media.
- Transfer media en EBS een nieuwe 10 cm niet-weefselkweek Petri plaat. Was het deksel nogmaals met 3 ml van differentiatie media en transfer naar de 10 cm plaat.
- Oogst cellen voor analyse door flowcytometrie na in totaal 8dagen cultuur vanaf de eerste overdracht van cellen tot differentiatie media (-LIF).
5 Voorbereiding Cellen voor doorstroomcytometer Analyse
- Overdracht cellen om een 15 ml conische buis met een 10 ml pipet. Was de plaat met 5 ml PBS en dragen dezelfde conische buis.
- Pellet de cellen bij 315 x g. Was pellets met 10 ml PBS.
- Voeg 1 ml van de ontdooide cellen onthechting oplossing en zet de buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 30 minuten met af en toe roeren. Voor detectie van bepaalde celoppervlak antigenen, kan trypsine worden gebruikt.
- Voeg 1 ml differentiatie media en pipet op en neer met een 2 ml pipet. Gebruik een P200 tip aan het eind van de pipet om break-up gedigereerd EB in enkele celsuspensie.
- Plaats de buis in een 37 ° C waterbad opnieuw voor 60 min zodat het integrale membraaneiwitten te recyclen aan het celoppervlak.
- Pellet cellen bij 315 g gedurende 5 minuten.
- Was de cellen with 0,1% runderserumalbumine fractie V (BSA) bereid in PBS (PBS / BSA) en incubeer de cellen met specifieke fluorescent gelabeld antilichamen.
6 Flowcytometrieanalyse voor hematopoietische voorlopercellen
- Plaats 10 6 EB-afgeleide cellen in een 5 ml 12 x 75 mm met ronde bodem buis. Voor het aanpassen van doorstroomcytometer compensatie, instellingen, gebruik compensatie kralen volgens de instructies van de fabrikant.
- Pellet de cellen bij 315 x g. Giet af en resuspendeer pellet in de resterende PBS / BSA-oplossing in de buis.
- Voor het detecteren ESC HPCs Incubeer de cellen met fluorescent gemerkte antilichamen: anti-muis CD41-PE (R-Phycoerytherin) en anti-muis CD117 (cKit) APC-/ CY7 (allofycocyanine Cyanine 7).
- Verdun antilichamen 1: 100 in PBS / BSA. Voeg 100 ul verdund antilichaam aan elk monster. Bepaal de juiste verdunning van antilichamen voor elke leverancier, kloon, en veel of antilichaam. Bepaal optimale verdunning voor het labelen van cellen individueel.
- Incubeer de monsters op ijs in het donker 30 minuten.
- Voeg 2 ml PBS / BSA en pellet cellen bij 315 g gedurende 5 minuten.
- Aspireren en resuspendeer pellet in 300 pi PBS of een andere isotone buffer.
- Filter geresuspendeerde cellen door een cel zeefdop (0,35 uM) om grote cel aggregaten te verwijderen.
- Analyseer cellen op een flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studies ontsloten RW4 (Afgeleid van 129X1 / SVJ muis stam) SER's werden gebruikt. EBS werden geïsoleerd op 3 dagen van differentiatie. Voor het beste resultaat moet de EBS sferische en niet-hechtende (Figuur 1A, B) zijn. Na spinoculation met virus co-expressie van de fluorescente merker GFP samen met een gen van interesse, werd EBS hervormd door de hangende druppel methode. EVSA's werden met succes hervormd uit celsuspensies bereid uit 2,0, 2,5, en 3,0 dag EBS. Echter, kon EBS niet worden hervormd uit celsuspensies bereid van de dag 4,0 EBS. De chimerisme van het EBS tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen werd waargenomen met fluorescentiemicroscopie op dag 8 van differentiatie (figuur 2A, B). De dichtheid van het EBS maakt vaak EBS weergegeven 100% GFP positief. Echter, met de nadruk op verschillende brandpunten vliegtuigen kan de bijdrage van de GFP-positieve en negatieve cellen aan het EBS (figuur 2B) te onthullen.
For analyse van HPC-ontwikkeling, werden chimeer EBS los in single cell schorsingen na 8 dagen van differentiatie. Tegenwerken van de werking van miRNA (s) van de mirn23a cluster (miRs-23a, 24-2, en -27) resulteert in een onvermogen van de SER om te differentiëren in bloedvoorlopers (Manuscript in voorbereiding). Om te bepalen of overexpressie van het mirn23a cluster heeft het tegenovergestelde effect, SER werden geïnfecteerd bij het begin van differentiatie. Dit resulteert echter in generatie verminderde HPCs. Aangezien mirn23a cluster kan worden betrokken bij TGFß / BMP / Smad signalering 18-21, kan de cluster verschillende effecten uitgedrukt in verschillende stadia van ontwikkeling EB vergelijkbaar met de BMP4 geactiveerde proteïne Smad1 12,13. Met dit protocol werden EB enkelvoudige celsuspensies geïnfecteerd na 3 dagen van differentiatie. EBS werden hervormd door opknoping druppel, en vervolgens op dag 8 voor HPC generatie geanalyseerd door het testen van CD41 en CD117 celoppervlak expression door flowcytometrie. CD41 + enkele positieve cellen zijn een pool van primitieve en definitieve HPC's, terwijl CD41 + CD117 + cellen bevatten slechts definitieve HPCs 22,23. Wij observeerden een significante stijging van de totale populatie van CD41 + HPC in de MSCV-mirn23a geïnfecteerde cellen vergeleken met de MSCV control virus geïnfecteerde cellen (figuur 3). De figuur toont ook dat een grote bijdrage van geïnfecteerde cellen het hervormde EBS worden bereikt. Het is belangrijk om EBS infecteren met een controlegroep virus dat het fluorescente eiwit alleen, en infecteren van cellen met de experimentele virus. Geïnfecteerde populaties (GFP +) vervolgens worden vergeleken voor verschillen in fenotype. Onderzoeken van verschillen tussen niet-geïnfecteerde cellen versus geïnfecteerde cellen kan leiden tot onjuiste resultaten. Vergelijking GFP (geïnfecteerde) en GFP + (geïnfecteerde) populatie er een verschil in de CD41 populaties in zowel de MSCV en MSCV-mirn23a kweken (figuur 3). Deze toename kan te wijtenom retrovirussen infecteren proliferatieve cellen.
Figuur 1: Vertegenwoordiger Dag 3 embryoiden Bodies RW4 SER werden overgeschakeld van ESC onderhoud media in differentiatie media en gekweekt in 10 cm platen (A) 4X en (B) 10X beelden worden getoond van embryoid lichamen die zich ontwikkelde na 3 dagen van de cultuur... In beeld 4X de balk geeft 1.000 micrometer, terwijl in beeld 10X de balk staat voor 400 micrometer.
Figuur 2: Acht dagen embryoiden Bodies (EB) hervormd van retrovirale geïnfecteerde dag 3 EB cellen. (A) Linker zijde zijn zonnig gebied. (B) De drie fluorescente kolommen van fluorescerende beelden naar rechts zijn dezelfde EB genomen diflende focale vliegtuigen. In de 4X beelden de balk vertegenwoordigt 1.000 micrometer, terwijl in de 10X beelden de balk vertegenwoordigt 400 micrometer.
Figuur 3:. Flowcytometrieanalyse hematopoïetische progenitorcellen, verkregen in chimère EBS Single cellen suspensies werden bereid uit d3 EBS, en geïnfecteerd met de aangegeven retrovirussen. EBS werden hervormd door opknoping druppel, en gekweekt een extra 8 dagen. Eencellige suspensies werden gegenereerd en geïncubeerd met fluorescent gelabelde antilichamen tegen CD41, en CD117. Linkerhand histogram plots tonen de GFP (niet-geïnfecteerde cellen) en GFP + (geïnfecteerde cellen) poorten. De rechter panelen tonen kleur dot plot van de cellen positief voor CD41 en CD117 expressie in de GFP en GFP + poorten. Primitieve hematopoëtische voorlopers worden in de CD41 + fracties en definitieve voorlopers aanwezig in zowel de CD41 + CD zijn117- en CD41 + CD117 + fracties. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals hierboven besproken, kan ESC klonen die induceerbare expressie van een gen van interesse worden gegenereerd met behulp doxycycline systemen echter generatie van deze lijnen is tijdrovend en arbeidsintensief. Beschreven in dit protocol is een methode om een gen van belang in een enkele celsuspensie bereid uit ESC afgeleid EBS drukken. Deze geïnfecteerde cellen worden vervolgens hervormd tot EBs door opknoping druppel op latere differentiatie te onderzoeken. In het voorbeeld (figuur 3), wordt aangetoond dat expressie van de mirn23a cluster versterkt hematopoietische ontwikkeling uitgedrukt op dag 3 van differentiatie. Op dit moment de ontwikkeling van ontluikende kiemlaag weefsel opgetreden waaronder vroege mesoderm die tot bloedvoorlopers geeft. Op dag 2 en 3 van RW4 ESC differentiatie, expressie van genen die ectoderm (Pax6) endoderm (FOXA2) en mesoderm (T, Twist en Tbx6) worden gedetecteerd door kwantitatieve reverse transcriptase PCR (Q-RT-PCR, gegevens niet getoond). Voor mirn23a naar HPC productie te verbeteren, kan het nodig zijn om uit te drukken in het begin van mesoderm. Deze techniek maakt het vermogen om te bepalen of een transgen heeft verschillende effecten op de temporele expressie gebruikten zonder veel inspanning om nieuwe reagentia te genereren. Bij het observeren fenotypes geassocieerd met verschillende temporele expressie kan een onderzoeker wil besteden nu de moeite om induceerbare lijnen waar de expressie van het transgen nauwkeurig kunnen worden gecontroleerd genereren.
Andere toepassingen voor deze techniek zijn onder meer het uitvoeren van reddings-experimenten in de SER, waar beide allelen van een gen van belang zijn verwijderd (Dubbele Knockout SER, DKO's). De wildkleur gen of gemuteerde versies van het gen is verwijderd kon worden opnieuw in de differentiërende EB cellen. Bovendien redding van een fenotype van genen stroomafwaarts van de verwijderde gen kan worden getest. Deze methode kan worden gebruikt om de cel intrinsieke aard van de waargenomen fenotypes te onderzoeken. Bijvoorbeeld in hematopoiesis, zijn defecten waargenomen in genen die ofwel de hematopoietische stamcellen en voorlopercellen zelf of soms het defect invloed kunnen cellen in de micro die nodig zijn om de ontwikkeling van stamcellen en progenitorcellen 16,24 ondersteunen beïnvloeden. In dit systeem, indien het gebrek intrinsieke hematopoietische progenitorcellen, kan herintroductie van het wildtype gen alleen redden hematopoietische ontwikkeling in de GFP + (retroviraal geïnfecteerde cellen). Als het defect waren niet-cell autonome, dan retrovirale infectie zou leiden tot redding van hematopoietische ontwikkeling wordt waargenomen in zowel GFP en GFP + populaties.
In dit protocol flowcytometrie wordt gebruikt om hematopoïetische progenitorcellen te identificeren door het celoppervlak expressie van CD41 en CD117. Ook na 8 dagen van differentiatie geïnfecteerde GFP + cellen kunnen worden geïsoleerd door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS). De geïsoleerde cellen kunnen vervolgens worden getest op de aanwezigheid van specifieke hematopoëtische voorlopers van hematopoietische Testen van kolonies in methylcellulose medium zoals reeds eerder beschreven 25,26. Evenzo kan RNA worden geëxtraheerd uit cellen gesorteerd en expressie van lijnspecifieke genen geanalyseerd.
Het voordeel van de beschreven techniek is dat het vereist minimale inspanning de benodigde reagentia gegenereerd en voor tijdelijke expressie van een transgen in de ontwikkeling EB. Als een virale vector co-expressie van het gen van belang met een fluorescent proteïne reeds beschikbare experiment kan onmiddellijk worden uitgevoerd. Er zijn enige beperkingen worden overwogen besloten dit protocol. De hier beschreven techniek vereist het vermogen om hoge-titer retrovirus produceren om voldoende cellen voor analyse hebben. Merk ook op dat het gebruik van het retrovirus kan leiden tot mutagenese die een fenotype kan opleveren. Echter, aangezien dit protocol wordt de behandeling van een pool van geïnfecteerde cellen in plaats van eenklonale populatie, is het minder waarschijnlijk dat een fenotype door mutagenese worden waargenomen korte tijd cultuur. De belangrijkste beperking van de techniek (vergeleken met een induceerbaar systeem zoals ten tet systeem) is dat expressie van het transgen kan niet worden uitgezet op een later tijdstip, en er is geen mogelijkheid om de niveaus van expressie controleren. SER dat drukken een transgen onder de controle van doxycycline verordening is voordelig aangezien het niet alleen voor het inschakelen van de gen in een tijdelijke wijze, maar ook zorgt voor het uitschakelen van het gen op een later tijdpunt. Het variëren van de hoeveelheid van een inductor, zoals doxycycline zal ook de gebruiker te fine-tunen van meningsuiting toe te staan. Tenslotte de induceerbare systemen kunnen reproduceerbare expressie van het transgen in alle cellen, terwijl in deze retrovirale protocol is er chimere expressie van het transgen. Zoals hierboven al besproken Deze chimere expressie kan waardevol zijn voor sommige toepassingen. De induceerbare systemen bieden een duidelijkeveel voordelen. Vanwege het gemak en verminderde kosten van de hier beschreven techniek, zullen veel onderzoekers het nuttig vinden om hun studie van embryonale stamcel differentiatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen bekend te maken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
References
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Tian, X., Kaufman, D. S. Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls. Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
- Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336, 348-352 (1988).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323, 445-448 (1986).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors. Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment. Blood. 117, 6489-6497 (2011).
- Zafonte, B. T., et al. Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window. Blood. 109, 516-523 (2007).
- Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell. 109, 29-37 (2002).
- Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).
- Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. Mesodermal patterning activity of SCL. Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).
- Kyba, M., et al. Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).
- Cao, M., et al. MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells. Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).
- Chan, M. C., et al. Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression. EMBO J. 29, 559-573 (2010).
- Huang, S., et al. Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer. 123, (2008).
- Min, S., et al. TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7. Genes Immun. 13, 621-631 (2012).
- Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo. Blood. 101, 508-516 (2003).
- Mitjavila-Garcia, M. T., et al. Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells. Development. 129, 2003-2013 (2002).
- Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews. Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).
- Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development. Embo J. 21, 2220-2230 (2002).
- Dahl, R., et al. Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor. Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).
