Protocol
1. embryoïdes corps (EB) Formation
- Gélatine adapter CES qui ont été maintenues sur des fibroblastes d'embryon de souris (MEF). CES Passage 3 fois sur 6 et la plaque de culture de tissus enduits de gélatine à 0,1% pour enlever MEF.
- Cultiver les cellules dans les médias d'entretien ESC avec FRV pour maintenir les cellules indifférenciées (tableau 1). Assurez-vous que les cellules ne dépassent jamais 80% de confluence. Utilisez passage bas (10 ou moins après la suppression de passages MEF) cellules de différenciation.
- A la veille de CES sont cultivées pour la différenciation EB, passage des cellules de sorte qu'ils seront environ 50-70% de confluence le lendemain. Continuer à cultiver des cellules dans le milieu de la maintenance ESC pour conserver la pluripotence cellulaire.
- Le jour de la différenciation, les médias de maintenance ESC aspiration et laver avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, et 11,9 mM de tampon phosphate, pH 7,4) dans chaque puits d'une plaque à 6 puits.
- Ajouter 200 ul de 0,25% trypsen / EDTA à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
- Inactiver la trypsine / EDTA avec 800 pi de milieu de différenciation. Pipette de haut en bas dans une pipette sérologique de 2 ml avec une pointe de p200 de débâcle des cellules dans une suspension de cellules isolées. Assurez-vous que la pointe de p200 s'adapte parfaitement sur la fin si les médias ne vont pas entre la pipette et l'interface de pointe.
- Pipet haut et bas environ 5-10 fois. Prenez soin de ne pas créer des bulles au cours de la pipette.
- les cellules de transfert à un tube conique de 15 ml. Amener le volume à 10 ml avec du PBS. Centrifuger à 315 g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirer le surnageant. Laver deux fois avec 5 ml de PBS pour éliminer les restes de fluides contenant des FRV. Centrifugeuse à l'étape 1.4 pour chaque lavage.
- Remettre en suspension le culot cellulaire finale dans 2 ml de milieu de différenciation (tableau 2).
- Compter les cellules avec un hémocytomètre ou cellulaire contre la plaque et 6,000-10,000 cellules / ml dans une plaque de 10 cm de Pétri(Culture non-tissu traité).
- Déterminer exactement les cellules / ml empiriquement pour chaque ligne ESC. Utilisez des boîtes de Pétri stériles normalement utilisés pour le travail des bactéries ou des plaques de faible adhérence.
REMARQUE: Pour de meilleurs résultats de différenciation, les ballasts électroniques doivent former des sphères qui restent en suspension sans fixer à la plaque. Testez plusieurs marques de plaques de trouver ceux qui ont le moins l'adhésion. - Incuber les CES de différenciation dans une culture tissulaire C incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2.
- Déterminer exactement les cellules / ml empiriquement pour chaque ligne ESC. Utilisez des boîtes de Pétri stériles normalement utilisés pour le travail des bactéries ou des plaques de faible adhérence.
| Réactif | Stock | Concentration finale | Volume | Entreprise | Numéro de catalogue |
| DMEM | 1x | 410 ml | S IGMA / Aldrich | D5796 | |
| FBS (ES blindé) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Acides aminés non essentiels | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-glutamine | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 35050 |
| Penncillin / streptomycine | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-mercaptoéthanol | 14,3 M | 114 uM | 4 pi | Sigma / Aldrich | M3148 |
| Inhibition de la leucémie Factor (LIF) | 10 7 unités / ml | 1000 unités / ml | 50 pi | Millipore | ESG1107 |
| Réactif | Stock | Concentration finale | Volume | Entreprise | Numéro de catalogue |
| DMEM | 1x | 410 ml | Sigma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (Projeté utilisateur de différenciation optimale) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Acides aminés non essentiels | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-glutamine | 100x | 1x | 5 ml | Vie Technologies | 35050 |
| Penncillin / streptomycine | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-mercaptoéthanol | 14,3 M | 114 uM | 4 pi | Sigma / Aldrich | M3148 |
Tableau 2: Différenciation des médias.
2. préparation de cellules EB pour infection par le virus
- Au stade de développement souhaité (entre les jours 2 et 3), transférer les ballasts électroniques de la boîte de 10 cm de Pétri à 15 ml tube conique. Laver la plaque avec 5 ml de PBS et ajouter le lavage au tube conique.
- Pellet les EB à 315 g à la température ambiante pendant 5 min. Laver les cellules EB avec 5 ml de PBS.
- Ajouter 1 ml de solution de détachement cellulaire décongelée (protéolytique contenant des enzymes et collagénolytiques) et placer les tubes dans un bain d'eau à 37 ° (ou incubateur) pendant 30 min avec occagitation asional (agitation ou de lumière vortex).
- Ajouter 1 ml de milieu de différenciation. Pipette de haut en bas avec une pipette de 2 ml avec une pointe p200 de la pipette. Placer le tube à 37 ° C bain d'eau à nouveau pendant 30 à 60 min.
- Centrifuger les cellules à 315 xg pendant 5 min et laver les cellules avec du PBS.
3. infection par le virus
- Remettre en suspension les cellules dans 1,5 ml de milieu de différenciation. Transférer la suspension cellulaire à un tissu non traité culture plaque à 6 puits.
- Préparer le retrovirus par des techniques classiques à l'avance. Ajouter 5 à 100 ul de surnageant viral dans des cellules en fonction de titre viral. Ne pas ajouter polybrene pour améliorer infection comme cela inhibe la réforme ultérieure de EB.
- Spinoculate les cellules avec le virus par centrifugation à 2120 xg pendant 90 min à température ambiante.
4. différenciation des cellules virales EB infectés dans les baisses suspendus
- Ajouter 2 ml de milieu de différenciation à chaque puits d'infected EB de suspension de cellules.
- Pipeter 3,5 ml de suspension cellulaire infectée EB dans un réservoir de réactif pour multipipettors stérile. Utilisez le multipipettor à pipeter 15-20 rangées de huit 20 pi gouttes sur le couvercle inversé de la plaque 15 cm de Pétri.
- Ajouter 10 ml de PBS stérile ou de l'eau à la partie inférieure de la plaque de Petri. Puis inverser le couvercle avec les gouttes et le lieu sur la plaque de Petri. Assurez-vous que les gouttes sont suspendus la tête en bas couvercle avec du PBS ou de l'eau ci-dessous pour garder la chambre humidifiée.
- Placez les plats à la 37 ° C tissu incubateur de culture avec 5,0% de CO 2.
- Après 2 jours, recueillir EB formés dans le rideau de gouttes d'inversion couvercle et lavage avec 4,5 ml de milieu de différenciation.
- médias de transfert et EBS pour une nouvelle culture de 10 cm non-tissu boîte de Pétri. Laver le couvercle une fois de plus avec 3 ml de milieu de différenciation et le transfert de la plaque de 10 cm.
- cellules de récolte pour l'analyse par cytométrie en flux après un total de 8culture jours à compter de la cession initiale de cellules sur un support de différenciation (-LIF).
5. cellules Préparation pour l'analyse cytomètre en flux
- Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml avec une pipette de 10 ml. Laver la plaque avec 5 ml de PBS et transférer dans le même tube conique.
- cellules de granules à 315 x g. Laver pastilles avec 10 ml de PBS.
- Ajouter 1 ml de solution décongelée de détachement cellulaire et placer les tubes dans un bain d'eau à 37 ° pendant 30 minutes avec agitation occasionnelle. Pour la détection de certains antigènes de surface des cellules, la trypsine peut être utilisé à la place.
- Ajouter 1 ml de milieu de différenciation et pipette de haut en bas avec une pipette de 2 ml. Utilisez une pointe de p200 à la fin de la pipette pour aider à briser-up digéré EB en suspension de cellules isolées.
- Placer le tube dans un bain d'eau à 37 C ° pendant encore 60 min pour que les protéines membranaires intégrales à recycler à la surface de la cellule.
- Pellet cellules à 315 g pendant 5 min.
- Laver les cellules wie 0,1% de sérum albumine bovine fraction V (BSA) préparé dans du PBS (PBS / BSA) et incuber les cellules avec des anticorps marqués par fluorescence spécifique.
6 Analyse des flux cytométrie de progéniteurs hématopoïétiques
- Placer 10 6 cellules EB dérivés dans 5 ml de 12 x 75 mm tube rond en bas. Pour régler cytomètre en flux réglages de compensation, utiliser des billes de rémunération selon les instructions du fabricant.
- cellules de granules à 315 x g. Verser le surnageant et remettre le culot en solution résiduelle PBS / BSA dans le tube.
- Pour la détection de l'ESC CAH, incuber les cellules avec des anticorps marqués par fluorescence: anti-souris CD41-PE (R-phycoérythrine) et anti-CD117 de souris (cKit) -APC / CY7 (Allophycocyanine Cyanine 7).
- Diluer anticorps 1: 100 dans du PBS / BSA. Ajouter 100 ul d'anticorps dilué dans chaque échantillon. Déterminer la dilution correcte des anticorps pour chaque fournisseur, clone, et beaucoup ou anticorps. Déterminer la dilution optimale pour le marquage de cellules individuellement.
- Incuber des échantillons sur la glace dans l'obscurité pendant 30 min.
- Ajouter 2 ml de cellules PBS / BSA et granulés à 315 g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 300 pi de PBS ou un autre tampon isotonique.
- Filtrer les remises en suspension des cellules à travers un bouchon de crépine de cellule (0,35 M) pour enlever les grands agrégats de cellules.
- Analyser les cellules sur un cytomètre de flux.
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Representative Results
Dans ces études gélatinisées VR4 (dérivée de la souche de souris 129X1 / SvJ) CES ont été utilisés. EB ont été isolés à 3 jours de différenciation. Pour obtenir les meilleurs résultats EBS doivent être sphériques et non-adhérente (Figure 1A, B). Après spinoculation avec le virus co-exprimant la GFP marqueur fluorescent avec un gène d'intérêt, EB ont été reformé par la méthode de la goutte pendante. EB ont été réformés avec succès à partir de suspensions cellulaires préparées à partir de 2.0, 2.5 et 3,0 jours EB. Cependant, EB ne pouvait pas être réformé à partir de suspensions cellulaires préparées à partir de 4.0 jour EB. Le chimérisme des ballasts électroniques entre les cellules infectées et non infectées a été observée par microscopie de fluorescence à jour de différenciation 8 (figure 2A, B). La densité de l'EB rend souvent les ballasts électroniques semblent être 100% GFP positive. Cependant, en se concentrant sur différents plans focaux peut révéler la contribution des cellules GFP positives et négatives à l'EBS (figure 2B).
Foanalyse de r de développement HPC, EB chimériques ont été dissocié en suspensions de cellules isolées après 8 jours de différenciation. Contrarier l'activité des miARN (s) du cluster de mirn23a (Mirs-23a, 24-2, et -27) se traduit par une incapacité des CES à se différencier en progéniteurs sanguins (manuscrit en préparation). Afin de déterminer si la surexpression de la grappe de mirn23a a l'effet inverse, CES ont été infectées à l'apparition de la différenciation. Cependant, cela se traduit par la génération de CAH a diminué. Depuis le cluster de mirn23a peut être impliqué dans TGFß / BMP / Smad signalisation 18-21, le cluster peut avoir des effets distincts exprimé à différents stades de développement EB similaires à la BMP4 activé Smad1 protéine 12,13. En utilisant ce protocole, EB suspensions monocellulaires ont été infectées au bout de 3 jours de différenciation. EB ont été réformés par goutte suspendue, et ensuite analysé au jour 8 pour la production d'HPC en dosant CD41 et la surface des cellules CD117 expression par cytométrie de flux. CD41 + cellules positives simples sont d'une piscine des CAH primitives et définitives, alors que les cellules CD41 + CD117 + ne contiennent que des CAH définitives 22,23. Nous avons observé une augmentation significative de la population totale de CD41 + HPC dans les cellules infectées MSCV-mirn23a rapport aux cellules le virus de commande de MSCV infectées (figure 3). La figure montre aussi qu'une contribution élevée des cellules infectées aux EB réformées peut être atteint. Il est important d'infecter à la fois avec EB un virus témoin exprimant la protéine fluorescente seul, ainsi que l'infection de cellules avec le virus expérimental. Les populations infectées (GFP +) devraient ensuite être comparés à des différences dans le phénotype. L'examen des différences entre les cellules non infectées par rapport aux cellules infectées peuvent donner des résultats erronés. La comparaison GFP (non infectés), et GFP + (infectés) Populations il ya une différence dans les populations de CD41 à la fois dans la MSCV et cultures MSCV-mirn23a (figure 3). Cette augmentation peut être dueà infecter les cellules prolifératives rétrovirus.
Figure 1: Jour représentant 3 corps embryoïdes RW4 CES sont passés de l'ESC médias d'entretien dans les milieux de différenciation et de culture en plaques de 10 cm (A) 4X et (B) 10X images sont présentées de corps embryoïdes qui se sont développées après 3 jours de culture... Dans l'image 4X la barre représente 1000 um, alors que dans l'image 10 fois la barre représente 400 um.
Figure 2: corps embryoïdes Huit jours (EB) réformées de jour 3 cellules infectées rétroviraux EB. (A) la main gauche des images secondaires sont champ lumineux. (B) Les trois colonnes fluorescentes d'images fluorescentes à droite sont les mêmes EB pris dans difFERENT plans focaux. Dans les images 4X la barre représente 1000 um, alors que dans les images 10X la barre représente 400 um.
Figure 3:. Analyse de cytométrie en flux des cellules progénitrices hématopoïétiques produites en EB chimériques suspensions de cellules uniques ont été préparées à partir de d3 EB, et infectées par les retrovirus indiqués. EB ont été réformés par goutte suspendue, et cultivé supplémentaires 8 jours. Suspensions de cellules isolées ont été générées et incubées avec des anticorps marqués par fluorescence à CD41, CD117 et. Gauche parcelles de l'histogramme de la main montrent la GFP (cellules non infectées) et GFP + (cellules infectées) portes. Les panneaux de droite montrent point de couleur parcelle de cellules positives pour CD41, CD117 et d'expression dans la GFP et GFP + portes. Progéniteurs hématopoïétiques primitives sont présents dans les fractions CD41 +, des progéniteurs et définitives sont présents à la fois dans la CD41 + CDDe 117, et CD41 + CD117 + fractions. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Comme discuté ci-dessus, les clones qui expriment de manière inductible ESC un gène d'intérêt peuvent être générés en utilisant des systèmes de doxycycline, toutefois, la production de ces lignes est de temps et de main-d'oeuvre. Décrite dans ce protocole est une méthode pour exprimer un gène d'intérêt dans la suspension cellulaire unique préparé à partir ESC dérivé EB. Ces cellules infectées sont ensuite réformé en EB en goutte suspendue pour examiner la différenciation ultérieure. Dans l'exemple (Figure 3), il est démontré que l'expression de la grappe de mirn23a favorise le développement hématopoïétique exprimé à jour 3 de la différenciation. A ce stade, le développement du tissu de la couche de germe naissant s'est produite comprenant mésoderme précoce qui donne naissance à des progéniteurs sanguins. Au jour 2 et 3 de la différenciation RW4 ESC, l'expression de gènes représentant ectoderme (Pax6), l'endoderme (FoxA2), et le mésoderme (T, Twist, et TBX6) sont détectés par PCR de la transcriptase inverse quantitative (Q-RT-PCR, données non représenté). Pour kmrn23a pour améliorer la production de HPC, il faudra peut-être exprimé dans le mésoderme tôt. Cette technique permet la capacité de déterminer si un transgène a des effets différents sur l'expression temporelle sans dépenser beaucoup d'efforts pour générer de nouveaux réactifs. Après observation des phénotypes associés à l'expression temporelle distincte, un enquêteur peut vouloir passer maintenant l'effort pour générer des lignées inductibles où l'expression du transgène peut être étroitement contrôlée.
D'autres applications de cette technique comprennent l'exécution d'expériences de sauvetage dans les CES où les deux allèles d'un gène d'intérêt ont été supprimés (Double Knockout CES, DKOS). Le gène de type sauvage ou des versions mutées du gène délété peuvent être réintroduits dans les cellules EB différenciation. En outre le sauvetage d'un phénotype de gènes en aval du gène peut être supprimé doser. Cette méthode peut être utilisée pour examiner la nature intrinsèque de la cellule de phénotypes observés. Par exemple, dans hematopoiesis, les défauts ont été observés dans les gènes qui affectent soit la souche hématopoïétique et des cellules progénitrices eux-mêmes ou parfois le défaut peut affecter les cellules dans le microenvironnement qui sont nécessaires pour soutenir le développement des cellules souches et progénitrices 16,24. Dans ce système, si le défaut est intrinsèque aux cellules progénitrices hématopoïétiques, puis réintroduction du gène de type sauvage ne sauver développement hématopoïétique dans la GFP + (cellules infectées rétroviraux). Si le défaut était non-cellule autonome, alors infection rétrovirale se traduirait par une opération de sauvetage du développement hématopoïétique étant observée dans les deux GFP + et GFP populations.
Dans ce protocole de cytométrie en flux est utilisée pour identifier des cellules progénitrices hématopoïétiques par l'expression de surface cellulaire de CD41 et CD117. En variante, après 8 jours de différenciation infectées cellules GFP + ont pu être isolés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Les cellules isolées peuvent ensuite être testés pour la présence de spprogéniteurs hématopoïétiques ecific par des essais de colonies hématopoïétiques dans les médias méthylcellulose comme nous l'avons décrit précédemment 25,26. De même, l'ARN peut être extrait à partir de cellules triées et analysées pour l'expression de gènes spécifiques de la lignée.
L'avantage de la technique décrite est qu'il nécessite un minimum d'effort pour générer les réactifs nécessaires, et permet l'expression temporelle d'un transgène dans l'EB développement. Si un vecteur viral co-exprimant le gène d'intérêt avec une protéine fluorescente est déjà disponible l'expérience peut être effectuée immédiatement. Il ya quelques limitations à prendre en compte avec le choix d'utiliser ce protocole. La technique décrite ici ne nécessite la capacité de produire des retrovirus à titre élevé d'avoir un nombre suffisant de cellules pour l'analyse. A noter également que l'utilisation du retrovirus peut entraîner une mutagenèse d'insertion qui pourraient donner un phénotype. Toutefois, depuis ce protocole examine un pool de cellules infectées au lieu d'unpopulation clonale, il est moins probable qu'un phénotype en raison de la mutagenèse par insertion sera observée au cours de la courte période de culture. La principale limitation de la technique (par rapport à un système inductible par exemple au système tet) est que l'expression du transgène ne peut pas être réduit au silence à un point de temps plus tard, et il n'y a aucune possibilité de contrôler les niveaux d'expression. CES qui expriment un transgène sous le contrôle de régulation de la doxycycline est avantageuse car elle permet non seulement pour mettre en marche le gène d'une manière temporelle, mais permet également de désactiver le gène à un point de temps plus tard. La variation de la quantité d'un inducteur comme la doxycycline permettra également à l'utilisateur de l'expression affiner. Enfin, les systèmes inductibles permettent une expression reproductible du transgène dans toutes les cellules, tandis que, dans ce protocole, il est rétroviral expression du transgène chimérique. Comme discuté ci-dessus que cette expression chimère pourrait être utile pour certaines applications. Les systèmes inductibles offrent clairement unbeaucoup d'avantages. Toutefois, en raison de la facilité et la diminution de la charge de la technique décrite ici, de nombreux chercheurs se trouver utile pour des études de différenciation de cellules souches embryonnaires.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun intérêt financier concurrents à divulguer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
References
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