Protocol
1. embriyoidlerin Vücut (EB) Oluşumu
- Fare embriyo fibroblast (MEF'ler) üzerinde muhafaza edilmiştir EKH jelatin adapte. Geçiş EKH MEFS çıkarmak için% 0.1 jelatin ile kaplanmış 6 gözlü doku kültür plakası üzerine 3 kez.
- (Tablo 1) farklılaşmamış hücreleri korumak için LİF ile ESC muhafaza ortamında hücrelerin büyümesine. Emin hücreler asla 80% izdiham aşan olun. Farklılaşması için hücrelerinden (MEF'lerden çıkardıktan sonra 10 veya daha az pasajlar) düşük geçişini kullanın.
- EKH EB farklılaşması için kültürlenir önceki gün, hücreler, geçit böylece yaklaşık% 50-70 oranında konfluent ertesi gün olacaktır. Hücre pluripotensini korumak ESC bakım ortamı içinde kültürlenmesi devam edin.
- 6-çukurlu levha başına: farklılaşması, aspirat ESC bakım ortamına ve günde 1 ml fosfat tamponlu salin (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, ve 11.9 mM fosfat tamponu, pH 7.4 PBS) ile yıkayın.
- 0.25% tryps 200 ul ekleyin/ her EDTA de ve 3 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe edin.
- Farklılaşma medya 800 ul tripsin / EDTA inaktive. Pipet yukarı ve aşağı P200 ucu ile 2 ml serolojik pipet yıkmak kadar hücreleri tek bir hücre süspansiyonu içine. Medya pipet ve uç arayüzü arasında yukarı gitmez yüzden P200 ucu ucuna rahatça oturduğundan emin olun.
- Pipet yukarı ve aşağı yaklaşık 5-10 kez. Pipetle sırasında baloncuklar oluşturmak için özen gösterin.
- 15 ml konik tüp hücreleri aktarın. PBS ile 10 ml sesini getirin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 315 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı. Lif içeren Kalan ortamı çıkarmak için 5 ml PBS ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan için adım 1.4 olarak santrifüj.
- Farklılaşma medya (Tablo 2), 2 ml nihai hücre topağı tekrar.
- Bir hemasitometre veya hücre sayacı ile hücrelerin sayısı ve 10 cm'lik bir petri plakasında 6,000-10,000 hücre / ml plaka(Non-doku kültürü tedavi).
- Her ESC hattı için ampirik tam hücre / ml belirleyin. Normalde bakteri iş veya düşük yapışma plakaları için kullanılan steril Petri tabak kullanın.
NOT: En iyi sonuçlar için farklılaşma, EBS plaka takmadan süspansiyon kalır küre oluşturmalıdır. Az bağlılıkla olanları bulmak için plakaların çeşitli markaları test edin. - % 5 CO2 içeren bir 37 ° C'de doku kültürü inkübatörü içinde, ayırt EKH inkübe edin.
- Her ESC hattı için ampirik tam hücre / ml belirleyin. Normalde bakteri iş veya düşük yapışma plakaları için kullanılan steril Petri tabak kullanın.
| Reaktif | Stok | Final Konsantrasyon | Cilt | Şirket | Katalog Numarası |
| DMEM | 1x | 410 ml | S IGMA / Aldrich | D5796 | |
| FBS (ES Ekranlı) | 100% | % 15 | 75 mi | Hycione | SH30070.03E |
| Gerekli olmayan Amino Asitler | 100x | 1x | 5 mi | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamin | 100x | 1x | 5 mi | Life Technologies | 35050 |
| Penncillin / Streptomisin | 100x | 1x | 5 mi | Life Technologies | 15070 |
| β-mersaptoetanol | 14.3 M | 114 iM | 4 ul | Sigma / Aldrich | M3148 |
| , Lösemi önleyici faktörü (LİF) | 10 7 ünite / ml | 1.000 adet / ml | 50 ul | Millipore | ESG1107 |
| Reaktif | Stok | Final Konsantrasyon | Cilt | Şirket | Katalog Numarası |
| DMEM | 1x | 410 ml | Sigma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (Kullanıcı optimum farklılaşması için Ekranlı) | 100% | % 15 | 75 mi | Hycione | SH30070.03E |
| Gerekli olmayan Amino Asitler | 100x | 1x | 5 mi | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamin | 100x | 1x | 5 mi | Yaşam Technolonolojiler | 35050 |
| Penncillin / Streptomisin | 100x | 1x | 5 mi | Life Technologies | 15070 |
| β-mersaptoetanol | 14.3 M | 114 iM | 4 ul | Sigma / Aldrich | M3148 |
Tablo 2: Farklılaşma Medya.
Virüs Enfeksiyonu 2. hazırlanması EB Hücreler
- Arzu edilen gelişme aşamasında (2. gün ve 3. gün arasında), 15 ml konik bir tüp için 10 cm Petri için ikinci EBS aktarın. 5 ml PBS ile plaka yıkayın ve konik tüp yıkama ekleyin.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 315 xg'de EBS Pelet. 5 ml PBS ile EB hücreleri yıkayın.
- Çözülen hücre ayırma çözeltisi (kolajenolitik içeren proteolitik ve enzimlerin) 1 ml ilave edilir ve OCC ile 30 dakika bir 37 ° C su banyosunda tüpleri (veya inkübatör) yerleştirmek(flicking veya hafif vorteks itibaren) asional ajitasyon.
- Farklılaşma medya 1 ml ilave edilir. Pipet yukarı ve aşağı P200 pipet ucu ile 2 ml pipetle. 30-60 dakika boyunca daha 37 ° C su banyosu içinde tüp yerleştirin.
- 5 dakika boyunca 315 xg'de hücreleri aşağı Spin ve PBS ile hücreleri yıkayın.
3. Virüs Enfeksiyonu
- Farklılaşma medya 1.5 ml süspansiyon hücreleri. 6 çukurlu bir doku kültür olmayan tedavi plaka hücre süspansiyonu aktarın.
- Vaktinden önce standart teknikler ile retrovirüsü hazırlayın. Viral titreye bağlı olarak hücrelere, viral süpernatanın 5-100 ul ekleyin. Bu EBS sonraki reform engeller gibi enfeksiyon geliştirmek için polybrene katmayın.
- Oda sıcaklığında 90 dakika boyunca 2120 x g'de santrifüj ile virüs hücreleri Spinoculate.
4. Asma Damlalar Viral Enfekte EB Hücreleri Farklılaşan
- I her çukuruna farklılaşma medya 2 ml ekleyinnfected EB hücre süspansiyonu.
- Pipet multipipettors için steril bir tepkin madde rezervuarına enfekte İT hücre süspansiyonu, 3.5 ml. Sekiz 20 ul, 15-20 satırlar 15 cm'lik Petri plakanın ters kapak üzerine damla Pipeti için multipipettor kullanın.
- Petri levhasının alt yarısına steril PBS veya su ve 10 ml ilave edilir. Sonra Petri plaka üzerine düşer ve yeri ile kapağı ters çevirin. Damla odası nemlendirilmiş tutmak için baş aşağı PBS veya altında su ile kapak asılı emin olun.
- % 5.0 CO2 ile 37 ° C doku kültürü inkübatörü içinde, yemekler yerleştirin.
- 2 gün sonra, farklılaşma medya 4.5 ml, kapak ve yıkama üst edilerek damla asılı oluşan EBS toplar.
- Yeni bir 10 cm olmayan doku kültürü Petri plaka Transferi medya ve EBS. Farklılaşma medya ve 10 cm plaka transfer 3 ml ile bir kez daha kapağı yıkayın.
- Sitometrisi 8 olarak toplam akışı analizi için hücreler hasatfarklılaşma medya (-LIF) hücrelerin ilk transferi itibaren gün kültür.
Akış Sitometresi Analizi 5. hazırlanması Hücreler
- 10 ml'lik bir pipet ile 15 ml konik tüp hücreleri aktarın. 5 ml PBS ile plaka yıkayın ve aynı konik tüp transfer.
- 315 x g Pelet hücreleri. 10 ml PBS ile pelet yıkayın.
- Çözülen hücre ayırma çözeltisi 1 ml ilave edilir ve ara sıra çalkalanarak 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosunda tüpleri. Bazı hücre yüzey antijenlerinin tespit edilmesi için, tripsin, bunun yerine kullanılabilir.
- 1 ml farklılaşma medya ekleyin ve pipetlemeyin yukarı ve 2 ml pipet aşağı. Yardımcı olmak için pipet ucuna P200 ucu kullanın kırılma tek bir hücre süspansiyonu içine EB dijeste edilmiştir.
- Integral zar proteinleri, hücre yüzeyine geri dönüşüm için sırayla, 60 dakika boyunca daha 37 ° C su banyosu içinde tüp yerleştirin.
- 5 dakika boyunca 315 xg'de hücrelerini pellet haline getirmek.
- Hücreler, wi yıkayıninci% 0.1 Sığır Serum Albumin Fraksiyon PBS (IX PBS / BSA) içinde hazırlanmıştır V (BSA) ve belirli ile hücrelerin inkübe floresan etiketli antikorlar.
Hematopoetik progenitörlerin 6. Sitometrisi Analizi
- 5 ml, 12 x 75 mm yuvarlak alt tüp içinde 10 6 EB türetilen hücreler yerleştirin. Tazminat sitometre ayarlarını akışını ayarlamak için, üretici talimatlarına göre tazminat boncuk kullanmayın.
- 315 x g Pelet hücreleri. Tüp içinde kalan PBS / BSA çözeltisi içinde süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet kapalı dökün.
- ÇIK HPC algılamak için, flüoresan etiketli antikorlar ile hücrelerin inkübe: anti-fare CD41-PE (R Phycoerytherin) ve anti-fare CD117 (cKit) -APC / Cy7 (alofikosiyanin Siyanin 7).
- 1 antikorları seyreltin PBS / BSA içinde 100. Her bir örnek için seyreltilmiş 100 ul antikor ekleyin. Her bir satıcı, klonlama ve çok ya da antikor için antikorun doğru seyreltme belirler. Hücreleri tek tek etiketlenmesi için optimal seyreltme belirleyin.
- 30 dakika daha karanlıkta buz üzerinde örnekleri inkübe edin.
- 5 dakika boyunca 315 x g'de 2 ml PBS / BSA ve topak hücrelere ilave edin.
- Aspire yüzenler ve 300 ul PBS veya başka bir izotonik tampon içinde tekrar süspansiyon pelet.
- Bir hücre süzgeç kapağı (0.35 mcM) aracılığıyla filtre süspanse edilen hücreler, büyük hücreli agrega kaldırmak için.
- Bir akış sitometresindeki hücreleri analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RW4 jelatinize Bu çalışmalarda kullanılmıştır EKH (129X1 / SVJ fare suşundan). EBS farklılaşma 3 gün sonra izole edilmiştir. En iyi sonuçlar için EBS küresel ve yapışkan olmayan (Şekil 1A, B) olmalıdır. Virüs, ilgili gen ile birlikte GFP floresan markörü ile birlikte ifade spinoculation sonra EBS olarak asılı damla yöntemiyle ıslah edilmiştir. EBS başarılı 2.0, 2.5, ve 3.0 gün EBS hazırlanan hücre süspansiyonları ıslah edilmiştir. Ancak, EBS günden 4,0 EBS hazırlanan hücre süspansiyonları reform olamazdı. Enfekte olmuş ve enfekte edilmemiş hücreler arasındaki EBS kimerizmi farklılaşma 8. günde (Şekil 2A, B) floresan mikroskopi ile gözlemlenmiştir. EBS yoğunluğu genellikle EBS 100% GFP pozitif olarak görünmesini sağlar. Bununla birlikte, farklı odak düzlemlerinde odaklanan EBS (Şekil 2B) GFP pozitif ve negatif hücrelerin katkısını ortaya çıkarabilir.
FoHPC gelişme r analizi, kimerik EBS farklılaşma 8 gün sonra, tek hücre süspansiyonları olarak ayrıştırılmış. Mirn23a küme miRNA (ler) aktivitesini antagonize (Mirs-23a, 24-2, ve -27) EKH bir yetersizlik sonuçları (hazırlık el yazmalarını) kan progenitörlerde ayırt etmek. Mirn23a kümenin aşın ters bir etkiye sahip olup olmadığını belirlemek için, ESCs farklılaşmanın başlangıcı enfekte edildi. Bununla birlikte, bu, azalmış HPC oluşmasıyla sonuçlanır. Mirn23a küme 18-21 sinyalizasyon TGFB / BMP / Smad tutulabilir yana BMP4 aktive Smad1 protein 12,13 benzer EB farklı gelişim aşamalarında ifade edildiğinde, küme farklı etkileri olabilir. Bu protokol kullanılarak, EB tek hücre süspansiyonları, farklılaşmasının 3 gün sonra enfekte edildi. EBS CD41 ve CD117 hücre yüzey expressio tahlil damla asarak, reform ve daha sonra HPC nesil için 8 günde analiz edildiakış sitometreyle n. CD41 + CD117 + hücreleri tek kesin HPC 22,23 bulundurmak ise CD41 + tek pozitif hücreler, ilkel ve kesin HPC bir havuz vardır. Biz MSCV kontrol virüsü bulaşmış hücreleri (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında MSCV-mirn23a enfekte hücrelerde CD41 + HPC genel popülasyonda önemli bir artış gözlenmiştir. Şekil aynı zamanda, dönüştürülmüş EBS enfekte hücrelerin yüksek katkı elde edilebileceğini göstermektedir. Bir kontrol virüsü, hem tek başına floresan proteini ifade, hem de deneysel bir virüs ile enfekte hücreler ile enfekte EBS önemlidir. Enfekte popülasyonları (GFP +) daha sonra bir fenotipe farklılıklara karşılaştırılmalıdır. Enfekte hücreleri karşı bulaşmamış hücreleri arasındaki farklar incelendiğinde hatalı sonuçlar verebilir. (Bulaşmamış) GFP-, ve GFP + (enfekte) karşılaştırılması MSCV ve MSCV-mirn23a kültürler (Şekil 3) hem de CD41 toplumlarda bir fark var nüfustur. Bu artış olabilir,retrovirüslere proliferatif hücrelerin enfekte edilmesi.
Şekil 1: Örnek 3 Gün embriyoit Oluşumu RW4''e ESCs farklılaştırma ortamı içine ÇIK bakım ortamına ikinci devreye girer ve 10 cm plakalar içerisinde kültürlendi (A) 4X (B) görüntüleri 10X kültür 3 gün sonra geliştirilmiştir embriyoit cisimlerin gösterilmiştir... 10X görüntüde 400 bar mikron temsil eder, oysa 4X resimde bar, 1.000 mikron temsil eder.
Şekil 2: retrovıral enfekte gün 3 EB hücrelerden gelen reform sekiz gün embriyoid Organları (EB). (A) Sol taraftaki resim parlak bir alan vardır. (B) sağa floresan görüntülerin üç floresan sütun Değişik alınan aynı EB vardırodak düzlemleri ferent. 10X görüntülerde 400 bar mikron temsil eder, oysa 4X görüntülerde bar, 1.000 mikron temsil eder.
Şekil 3:. Kimerik EBS üretilen hematopoietik progenitör hücrelerin analizi Akış sitometrisi Tek hücre süspansiyonları, belirtilen retrovirüsler ile EBS D3'den ve enfekte edildi. EBS damla asarak, reform ve ek olarak 8 gün kültüre edildi. Tek hücre süspansiyonları üretilir ve CD41 ve CD117 için floresan etiketli antikorlar ile inkübe edildi. Sol el histogram planı GFP (enfekte olmayan hücreler) ve GFP + (enfekte olmuş hücreler) kapıları gösterir. Sağ panelleri CD41 pozitif hücrelerin renk nokta arsa ve CD117 ifade GFP ve GFP + kapıları gösterir. İlkel hematopoietik öncü CD41 + parçaları bulunmaktadır, ve kati progenitörler CD41 + CD hem de mevcut olduğu117- ve CD41 + CD117 + kesirler. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda ele alındığı gibi, ilgi konusu bir indüklenebilir gen ifade ÇIK klon doksisiklin sistemler kullanılarak elde edilebilir, bununla birlikte, bu satırların kuşak zaman alıcı ve emek yoğundur. Bu protokolde tarif EBS türetilmiş ESC hazırlanan tek hücre süspansiyonu ilgi konusu bir geni ifade etmek için bir yöntemdir. Bu enfekte olmuş hücreler, daha sonra, sonraki farklılaşma incelemek asılı damla ile EBS olarak yenilenmiş. Örnekte (Şekil 3), bu farklılaşma 3. günde sentezlendiklerinde mirn23a kümenin ekspresyonu hematopoietik geliştirme artırır gösterilmiştir. Bu noktada, olgunlaşmamış tohum tabaka doku gelişimi kan öncü hücrelerden meydana getirir erken mezoderm da dahil olmak üzere meydana geldi. RW4''e ESC farklılaşma, (Pax6) Ceninin (FoxA2) ve mezoderm (T Büküm ve Tbx6) (Q-RT-PCR, sayısal bir veri ters transkriptaz PCR ile tespit edilir ektoderm temsil eden genlerin sentezlenmesi için 2. ve 3. gün 'de gösterilir). Mil içinrn23a HPC üretimini arttırmak için, erken mezoderm ifade edilmesi gerekebilir. Bu teknik, bir transgen yeni reaktiflerin üretmek için çaba harcamadan zamansal ifadesi farklı etkilere sahip olup olmadığını belirlemek için yetenek sağlar. Farklı zamansal ifadesi ile bağlantılı fenotipler gözlenmesi üzerine, bir araştırmacı artık transgenin ifadesi sıkı bir şekilde kontrol edilebilir olarak uyarılabilir çizgilerini oluşturmak için çaba harcamak isteyebilir.
Ilgi konusu bir genin her iki aleli (Çift Nakavt ESCs, DKOs) silinmiş olması Bu teknik için diğer uygulamalar EKH kurtarma deneyler yer alır. Vahşi tipli geni veya iptal edilen gen mutasyona uğramış versiyonları ayırt İT diye hücrelere tekrar dahil edilebilir. Silinen geninin aşağısında bir gen tarafından fenotip Ayrıca kurtarma tahlil edilebilir olması. Bu yöntem, gözlenen fenotipleri hücre iç yapısını incelemek için kullanılabilir. Örneğin hematopoiesis, kusurları kök hücrelerin 16,24 gelişimini desteklemek için gerekli mikroçevresinin hücreleri etkileyebilir hematopoetik kök ve progenitör hücreler kendileri veya bazen kusur ya etkileyen genleri gözlenmiştir. Kusur hematopoietik progenitör hücreler için esas olan, bu sistemde, bundan sonra yabani tip geni olarak uygulanması, sadece GFP + (retroviral enfekte) hücreleri içinde hematopoietik gelişme kurtaracaktır. Kusur olmayan hücre otonom olsaydı, o zaman retrovirütik enfeksiyon, GFP + ve GFP- toplumlarda her iki gözlenmektedir hematopoetik gelişme, bir kurtarma ile sonuçlanacaktır.
Bu protokol, akış sitometrisi içinde CD41 ve CD117 de hücre yüzey ifadesi ile hematopötik projenitör hücreleri tanımlamak için kullanılır. Farklılaşma 8 gün sonra GFP enfekte Seçenek olarak ise, + hücreleri flöresanla aktive edilen hücre tasnif (FACS) ile izole edilebilir. Izole edilmiş hücreler daha sonra sp varlığı için test edilebilir,metilselüloz ortam içinde hematopoietik koloni tahlillerle ecific hematopoietik progenitörlerin daha önce tarif edildiği gibi 25,26. Benzer şekilde, RNA, kriteri hücrelerinden ekstre edilmiş ve soy spesifik genlerin ifadesi için analiz edilebilir.
Tarif edilen tekniğin avantajı, gerekli reaktifleri oluşturmak için en az bir çaba gerektirir ve gelişmekte olan EB bir transjenin geçici ifadesi için izin vermektedir. Bir floresan protein ile ilgi konusu gen ko-eksprese eden bir viral vektör kullanılabilir durumdaysa deney derhal gerçekleştirilebilir. Bu protokolü kullanmayı tercih ile dikkate alınması gereken birkaç sınırlamalar vardır. Burada anlatılan teknik analiz için yeterli bir hücre sayıda yüksek titre retrovirüs üretme yeteneğini gerektirir. Ayrıca, retrovirüs, bu kullanım, bir fenotip elde olabilir araya sokulan mutajenez neden olabilir not edin. Bununla birlikte, bu protokol, yerine enfekte olmuş hücrelerin bir havuz incelenmesi beriklonal popülasyonu, bu araya sokulan mutajenez nedeniyle bir fenotip kültürün kısa bir zamanda gözlenir daha az muhtemeldir. (Örneğin, tet sistemindeki gibi indüklenebilen bir sistem ile karşılaştırıldığında) tekniğin başlıca sınırlama daha sonraki bir zaman noktasında susturulamaz transgenin ekspresyonu ve ekspresyon seviyelerini kontrol etme özelliği yoktur. Bu sadece geçici bir şekilde gen açma izin verir, ancak daha sonraki bir zaman noktasında genin kapatılması için olanak verdiği için doksisiklin düzenlemenin kontrolü altında bir transgen ifade ESCs avantajlıdır. Örneğin doksisiklin gibi bir teşvik edici miktarının değiştirilmesi, aynı zamanda ince ayar ifade kullanıcıya sağlayacaktır. Bu retroviral protokolde transgenin kimerik ekspresyon görülmezken Son olarak uyarılabilir sistemler, bütün hücrelerde transgenin ekspresyonu için tekrarlanabilir sağlar. Olsa, yukarıda tartışıldığı gibi, bu kimerik ekspresyon bazı uygulamalarda önemli olabilir. Indüklenebilir sistemleri, açık bir şekilde sunaravantajları çok. Ancak, kolaylığı nedeniyle ve burada açıklanan tekniği gideri azalmış, birçok araştırmacı embriyonik kök hücre farklılaşması onların çalışmaları için yararlı bulacaksınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa rakip mali çıkarlarını hiçbir var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
References
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Tian, X., Kaufman, D. S. Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls. Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
- Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336, 348-352 (1988).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323, 445-448 (1986).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors. Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment. Blood. 117, 6489-6497 (2011).
- Zafonte, B. T., et al. Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window. Blood. 109, 516-523 (2007).
- Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell. 109, 29-37 (2002).
- Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).
- Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. Mesodermal patterning activity of SCL. Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).
- Kyba, M., et al. Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).
- Cao, M., et al. MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells. Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).
- Chan, M. C., et al. Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression. EMBO J. 29, 559-573 (2010).
- Huang, S., et al. Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer. 123, (2008).
- Min, S., et al. TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7. Genes Immun. 13, 621-631 (2012).
- Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo. Blood. 101, 508-516 (2003).
- Mitjavila-Garcia, M. T., et al. Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells. Development. 129, 2003-2013 (2002).
- Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews. Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).
- Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development. Embo J. 21, 2220-2230 (2002).
- Dahl, R., et al. Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor. Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).
