Protocol
1. embrioides Corporal (EB) Formação
- Gelatina-se adaptar CES que foram mantidos em fibroblastos de embrião de ratinho (MEFs). CES passagem 3 vezes na placa de 6 poços de cultura de tecidos revestidas com gelatina a 0,1% para remover MEFs.
- Cultivar células em meio de manutenção com LIF ESC para manter as células indiferenciadas (Tabela 1). Faça células certeza nunca superior a 80% de confluência. Use baixa passagem (10 ou menos passagens após a remoção de MEFs) células de diferenciação.
- No dia antes da CES são cultivadas durante a diferenciação EB, a passagem das células, de forma que será de aproximadamente 50-70% confluentes no dia seguinte. Continuar a cultura de células em meio de manutenção de ESC para reter pluripotência das células.
- No dia da diferenciação, meios de manutenção aspirado ESC e lava-se com 1 ml de fosfato salino tamponado (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM e 11,9 mM de tampão fosfato, pH 7,4) por poço de uma placa de 6 poços.
- Adicionar 200 ul de 0,25% Trypsem / EDTA a cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 3 min.
- Inactivar a tripsina / EDTA com 800 ul de meios de diferenciação. Pipeta cima e para baixo em um 2 ml pipeta sorológica com uma ponta p200 para quebrar-se as células em uma suspensão de células individuais. Certifique-se de que a ponta p200 se encaixa perfeitamente no final, para a mídia não subir entre a pipeta e interface de ponta.
- Pipeta cima e para baixo cerca de 5-10 vezes. Tome cuidado para não criar bolhas durante a pipetagem.
- Transferência de células para um tubo cônico de 15 ml. Traga-se o volume para 10 ml com PBS. Centrifugar a 315 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante. Lavar duas vezes com 5 ml de PBS para remover a mídia restantes contendo LIF. Centrifuga-se como no passo 1.4 para cada lavagem.
- Ressuspender o sedimento final de células em 2 ml de meio de diferenciação (Tabela 2).
- Contar as células com um hemocitómetro ou contador de células e a placa 6.000-10.000 células / ml numa placa de 10 centímetros de Petri(Cultura de tecido não-tratado).
- Determine as exatas células / ml empiricamente para cada linha ESC. Use placas de Petri estéreis normalmente utilizados para o trabalho bacteriana ou placas de baixa adesão.
NOTA: Para obter os melhores resultados de diferenciação, as EBs devem formar esferas que permanecem em suspensão sem anexar a placa. Teste várias marcas de placas para encontrar aquelas com menos aderência. - Incubar os CES diferenciadores em um 37 ° C tecido cultura incubadora com 5% de CO 2.
- Determine as exatas células / ml empiricamente para cada linha ESC. Use placas de Petri estéreis normalmente utilizados para o trabalho bacteriana ou placas de baixa adesão.
| Reagente | Banco | Concentração final | Volume | Empresa | Número de Catálogo |
| DMEM | 1x | 410 ml | S IGMA / Aldrich | D5796 | |
| FBS (ES filtrada) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Não-essencial Aminoácidos | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamina | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 35050 |
| Penncillin / Estreptomicina | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-mercaptoetanol | 14,3 M | 114 mM | 4 l | Sigma / Aldrich | M3148 |
| Fator Inibidor de Leucemia (LIF) | 10 7 unidades / ml | 1000 unidades / ml | 50 ul | Millipore | ESG1107 |
| Reagente | Banco | Concentração final | Volume | Empresa | Número de Catálogo |
| DMEM | 1x | 410 ml | Sigma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (User selecionados para diferenciação ideal) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Não-essencial Aminoácidos | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamina | 100x | 1x | 5 ml | Vida Tecnologia degias | 35050 |
| Penncillin / Estreptomicina | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-mercaptoetanol | 14,3 M | 114 mM | 4 l | Sigma / Aldrich | M3148 |
Tabela 2: Diferenciação Media.
2. preparação de células EB à infecção pelo Vírus
- Na fase de desenvolvimento desejado (entre o dia 2 e dia 3), transfira as EBs do 10 centímetros de Petri para tubo de 15 ml. Lava-se a placa com 5 ml de PBS e adicionar a lavagem para o tubo cónico.
- Agregar as CEs a 315 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Lave as células EB com 5 ml de PBS.
- Adicionar 1 ml de solução de separação de células descongelado (contendo enzimas proteolíticas e colagenolíticas) e colocar os tubos num banho de água a 37 C ° (incubadora) ou durante 30 minutos com occagitação asional (a partir de um movimento súbito ou luz vórtice).
- Adicionar 1 ml de mídia diferenciação. Pipeta cima e para baixo com uma pipeta 2 ml com uma ponta de pipeta p200. Colocar o tubo em banho-maria a 37 ° C de novo durante 30-60 minutos.
- Girar as células a 315 xg durante 5 min e lava-se as células com PBS.
Infecção 3 Vírus
- Ressuspender as células em 1,5 ml de meio de diferenciação. Transferência da suspensão de células para uma de 6 poços de cultura de tecidos não-placa tratada.
- Prepare a retrovírus por técnicas convencionais antes do tempo. Adicionar 5 a 100 mL de sobrenadante virai para células dependendo título viral. Não adicione polibrene para melhorar a infecção, pois isso inibe a reforma posterior da EBS.
- Spinoculate as células com o vírus por centrifugação a 2120 xg durante 90 min à temperatura ambiente.
4. Diferenciando virais células EB infectados em gotas de suspensão
- Adicionar 2 ml de meio de diferenciação em cada poço de infected EB suspensão de células.
- Pipetar 3,5 ml de suspensão de células infectadas em EB um reservatório de reagente estéril para multipipettors. Utilizar a pipeta de multipipettor 15-20 filas de oito 20 ul gotas sobre a tampa invertida da placa de Petri 15 centímetros.
- Adicionar 10 ml de PBS estéril ou água para a metade inferior da placa de Petri. Em seguida, inverter a tampa com as gotas e coloque sobre a placa de Petri. Certifique-se de que as gotas estão pendurados de cabeça para baixo a partir da tampa com PBS ou água abaixo para manter a câmara úmida.
- Coloque os pratos no 37 ° C tecido cultura incubadora com 5,0% de CO 2.
- Após 2 dias, recolher EB formadas na suspensão, invertendo a tampa cai e lavagem com 4,5 mL de meios de diferenciação.
- Transferência de Mídia e EBS para uma nova cultura 10 centímetros não-tecido placa de Petri. Lava-se a tampa, uma vez mais com 3 ml de meio de diferenciação e de transferência para a placa de 10 cm.
- Células colheita para análise por citometria de fluxo depois de um total de 8dias de cultura a partir da transferência inicial de células de mídia diferenciação (-LIF).
5. As células que se preparam para Análise de Fluxo Cytometer
- Transferir as células para um tubo de 15 ml com uma pipeta de 10 ml. Lava-se a placa com 5 ml de PBS e transferir para o mesmo tubo cónico.
- Células de pellets em 315 x g. Lave pellets com 10 ml PBS.
- Adicionar 1 ml de solução de separação de células descongelada e colocar os tubos num banho de água a 37 C ° durante 30 min, com agitação ocasional. Para a detecção de alguns antigénios de superfície celular, a tripsina pode ser usado em substituição.
- Adicionar 1 ml de mídia de diferenciação e pipeta cima e para baixo com uma pipeta de 2 ml. Utilizar uma ponta de p200 para a ponta da pipeta para ajudar a quebrar-se digerido EB em suspensão de célula única.
- Colocar o tubo num banho de água a 37 ° C de novo durante 60 minutos a fim de que as proteínas de membrana integrais para reciclar para a superfície da célula.
- Sedimentar as células a 315 xg durante 5 min.
- Lave o wi célulasth 0,1% Albumina de soro bovino Fracção V (BSA) preparada em PBS (PBS / BSA) e incuba-se as células com anticorpos específicos fluorescente etiquetado.
6 Análise do Fluxo Citometria de Progenitores hematopoiéticos
- Colocam-se 10 6 células EB derivados em 5 ml 12 x 75 mm redondo tubo inferior. Para ajustar as definições de compensação citômetro de fluxo, use esferas de compensação de acordo com as instruções do fabricante.
- Células de pellets em 315 x g. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em solução de PBS / BSA residual no tubo.
- Para detectar ESC HPCs, incubar as células com anticorpos fluorescentes rotulado: anti-rato CD41-PE (R-Phycoerytherin) e anti rato-CD117 (c-kit) -APC / Cy7 (aloficocianina Cyanine 7).
- Dilui-se os anticorpos 1: 100 em PBS / BSA. Adicionar 100 ul de anticorpo diluído em cada amostra. Determine a diluição correta de anticorpos para cada fornecedor, clone, e muito ou anticorpo. Determinar a diluição óptima para a marcação de células individualmente.
- Incubar as amostras em gelo no escuro durante 30 min.
- Adicionar 2 ml de células de PBS / BSA e pelotas a 315 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e pellet ressuspender em 300 mL de PBS ou outro tampão isotônica.
- Filtrar ressuspensas células através de um coador de células tampão (0,35 M) para remover grandes agregados celulares.
- Analise as células em um citômetro de fluxo.
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Representative Results
Nestes estudos gelatinizadas RW4 (derivado de 129X1 / SvJ rato tensão) CES foram utilizados. EB foram isolados em 3 dias de diferenciação. Para melhores resultados, os CEs deve ser de forma esférica e não aderentes (Figura 1A, B). Após spinoculation com vírus que co-expressam a GFP marcador fluorescente, juntamente com um gene de interesse, EB foram reformada pelo método de gota suspensa. EB foram reformados com sucesso a partir de suspensões de células preparadas a partir de 2,0, 2,5 e 3,0 dias CEs. No entanto, a EBS não poderia ser reformada a partir de suspensões de células preparadas a partir de dia 4.0 EBS. O quimerismo das CEs entre as células infectadas e não infectadas foi observada por microscopia de fluorescência no dia 8 de diferenciação (Figura 2A, B). A densidade da EB muitas vezes faz com que as CEs parecem ser 100% de GFP positivo. No entanto, concentrando-se em diferentes planos focais pode revelar a contribuição das células positivas e negativas para GFP para a EB (Figura 2B).
For análise de desenvolvimento de HPC, EB quiméricos foram dissociados em suspensões de células isoladas após 8 dias de diferenciação. Antagonizar a actividade da miARN (s) do grupo mirn23a (miRs-23a, 24-2, e -27) resulta na incapacidade de CES de se diferenciar em células progenitoras de sangue (manuscrito em preparação). Para determinar se a sobre-expressão do cluster mirn23a tem o efeito oposto, CES foram infectadas com o início da diferenciação. No entanto, isso resulta na geração de diminuição da PAP. Uma vez que o aglomerado mirn23a pode estar envolvido na TGFß / BMP / Smad sinalização 18-21, o conjunto pode ter efeitos distintos quando expressas em diferentes estágios de desenvolvimento semelhantes a EB BMP4 activated protein Smad1 12,13. Usando este protocolo, EB suspensões unicelulares foram infectados após 3 dias de diferenciação. EBS foram reformadas por enforcamento queda, e, posteriormente, analisados no dia 8 para geração HPC através do ensaio e CD41 na superfície celular CD117 expression por citometria de fluxo. CD41 + células positivas individuais são um conjunto de HPCs primitivas e definitivas, enquanto que as células CD41 + CD117 + conter apenas HPCs definitivos 22,23. Observou-se um aumento significativo na população total de CD41 + HPCs nas células MSCV-mirn23a infectados em comparação com as células controle vírus MSCV infectados (Figura 3). A figura também mostra que uma elevada contribuição de células infectadas com os CEs reformadas podem ser alcançados. É importante para infectar EB com tanto o vírus de controlo que expressa a proteína fluorescente sozinho, bem como infecção de células com o vírus experimental. Populações infectadas (GFP +) deve então ser comparada as diferenças de fenótipo. Examinando as diferenças entre as células não infectadas contra as células infectadas podem dar resultados errados. Comparando GFP (não infectada), e GFP + (infectados) populações existe uma diferença nas populações de CD41 em ambas as culturas e MSCV MSCV-mirn23a (Figura 3). Este aumento pode ser devidoa retrovírus infectar células proliferativas.
Figura 1: Day Representante três corpos embrióides RW4 CES foram mudaram de mídia manutenção ESC em mídia de diferenciação e cultivadas em placas de 10 cm (A) 4X e (B) 10X imagens são mostradas de corpos embrióides que se desenvolveram depois de 3 dias de cultura... Na imagem de 4X a barra representa 1.000 um, enquanto que a imagem de 10X a barra representa 400 um.
Figura 2: Oito dias corpos embrióides (EB) reformadas a partir do dia 3 células infectadas EB retrovirais. (A) Esquerda imagens lado são de campo claro. (B) As três colunas fluorescentes de imagens fluorescentes para a direita são as mesmas EB tomado em difrentes planos focais. Nas imagens 4X a barra representa 1.000 um, enquanto que nas imagens de 10X a barra representa 400 um.
Figura 3:. Análise de citometria de fluxo de células progenitoras hematopoiéticas produzidas em células individuais quiméricas EB suspensões foram preparadas a partir d3 EB, e infectadas com retrovírus indicados. EBS foram reformadas por enforcamento queda, e cultivadas um adicional de 8 dias. As suspensões de células isoladas foram gerados e incubadas com anticorpos marcados com fluorescência para CD41 e CD117. Parcelas mão esquerda do histograma mostram a GFP (células não infectadas) e GFP + (células infectadas) portões. Os painéis do lado direito mostram a cor do ponto de trama de células positivas para CD41, CD117 e expressão do GFP e GFP + portões. Progenitores hematopoiéticos primitivos são encontrados nas CD41 + frações, e progenitores definitivos estão presentes tanto no CD + CD41117-, e CD41 + CD117 + frações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Como discutido acima, os clones do CES por indução que expressam um gene de interesse pode ser gerada usando sistemas de doxiciclina, no entanto, a geração destas linhas é demorado e trabalhoso. Descrito no presente protocolo é um método de expressar um gene de interesse em suspensão de células individuais preparados a partir de derivados CES CEs. Estas células infectadas são então reformada em EBs por enforcamento queda para examinar diferenciação subseqüente. No exemplo (Figura 3), é mostrado que a expressão do cluster mirn23a melhora o desenvolvimento hematopoiético quando expresso no dia 3 de diferenciação. Neste ponto do desenvolvimento de tecido de camada germinal nascente ocorreu incluindo mesoderma no início, que dá origem a células progenitoras de sangue. No dia 2 e 3 de RW4 CES diferenciação, expressão de genes que representam ectoderme (Pax6), endoderme (Foxa2), e mesoderme (t, torção, e Tbx6) são detectados através de PCR quantitativa de transcriptase inversa (Q-RT-PCR, dados não mostrada). Para mirn23a para aumentar a produção de HPC, que pode necessitar de ser expressa em mesoderme precoce. Esta técnica permite a capacidade de determinar se um transgene tem efeitos diferentes sobre a sua expressão temporal sem despender muito esforço para gerar novos reagentes. Ao observar fenotipos associados com a expressão temporal distinto, um investigador pode agora passar quer o esforço para gerar linhas indutíveis, onde a expressão do transgene pode ser rigorosamente controlados.
Outras aplicações para esta técnica incluem a realização de experimentos de resgate na CES, onde ambos os alelos de um gene de interesse foram apagados (Knockout Duplo CES, DKOS). O gene de tipo selvagem ou as versões modificadas do gene eliminado, pode ser reintroduzido em células EB diferenciadores. Adicionalmente resgate de um fenótipo de genes a jusante do gene pode ser suprimido ser ensaiada. Este método pode ser usado para examinar a natureza intrínseca da célula dos fenótipos observados. Por exemplo, em hematopoiesis, os defeitos foram observados em genes que afetam tanto o tronco hematopoéticas e as próprias células progenitoras ou, por vezes, o defeito pode afetar as células do microambiente que são necessários para apoiar o desenvolvimento de células-tronco e progenitoras 16,24. Neste sistema, se o defeito é inerente às células progenitoras hematopoiéticas, em seguida, a reintrodução do gene do tipo selvagem será apenas resgatar desenvolvimento hematopoiético a células infectadas retrovirais (GFP) +. Se o defeito eram não-celular autónoma, em seguida, a infecção retroviral resultaria em um resgate de desenvolvimento hematopoiético a ser observado em ambas as populações de GFP + e GFP.
Neste protocolo de citometria de fluxo é utilizada para identificar células progenitoras hematopoiéticas pela expressão à superfície da célula de CD41 e CD117. Alternativamente, após 8 dias de diferenciação GFP + células infectadas pode ser isolado por meio de fluorescência de células activadas (FACS). As células isoladas pode ser então ensaiado quanto à presença de spprogenitores hematopoiéticos ecific por ensaios de colônias hematopoéticas em media metilcelulose como já descrito anteriormente 25,26. Do mesmo modo, o RNA pode ser extraído de células escolhidas e analisadas para a expressão de genes específicos de linhagem.
A vantagem da técnica descrito é que requer o mínimo de esforço para gerar os reagentes necessários, e permite a expressão temporal de um transgene no desenvolvimento de EB. Se um vector viral que co-expressam o gene de interesse com uma proteína fluorescente é já disponível a experiência pode ser realizada imediatamente. Existem algumas limitações que devem ser considerados com a escolha de usar este protocolo. A técnica aqui descrita exige a capacidade de produzir retrovírus de título elevado para ter um número suficiente de células para análise. Note também que a utilização do retrovírus podem resultar em mutagénese de inserção que poderia originar um fenótipo. Entretanto, desde que este protocolo está a analisar um conjunto de células infectadas em vez de umpopulação clonal, que é menos provável que um fenótipo devido a mutagénese de inserção será observado ao longo do curto tempo de cultura. A principal limitação da técnica (em comparação com um sistema indutivel tal como no sistema tet) é que a expressão do transgene, não pode ser silenciado em um ponto de tempo mais tarde, e não há nenhuma possibilidade de controlar os níveis de expressão. CES que expressam um transgene sob o controlo de regulação de doxiciclina é vantajoso uma vez que permite não só para ligar o gene de uma forma temporal, mas também permite desligar o gene de cada ponto de tempo posterior. Variando a quantidade de um indutor, como doxiciclina também vai permitir que o usuário expressão afinar. Finalmente os sistemas indutíveis para permitir a expressão reprodutível do transgene em todas as células, enquanto que no presente protocolo retroviral há expressão quimérica do transgene. Como discutido acima, embora esta expressão quimérico poderia ser valioso para algumas aplicações. Os sistemas indutíveis oferece claramente umasérie de vantagens. No entanto, devido à facilidade e diminuição da despesa da técnica descrita aqui, muitos investigadores vai encontrá-lo útil para os seus estudos de diferenciação de células-tronco embrionárias.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros competitivos para divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
References
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