Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

זיהום retroviral של Murine גזע עוברי תאי Embryoid גוף תא נגזר לניתוח של בידול המטופואטיות

Published: October 20, 2014 doi: 10.3791/52022
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2,3
1Harper Cancer Research Institute, 2Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 3Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Protocol

.1 Embryoid גוף גיבוש (EB)

  1. ג'לטין-להסתגל ESCs שנשמר על fibroblasts עובר עכבר (MEFs). ESCs מעבר 3 פעמים בצלחת תרבית רקמת 6 היטב מצופים בג'לטין 0.1% להסיר MEFs.
    1. לגדל תאים בתקשורת תחזוקת ESC עם LIF כדי לשמור על התאים שלא עברו התמיינות (טבלה 1). להפוך תאים בטוחים לא יעלו על מפגש 80%. השתמש במעבר נמוך (10 או פחות מעברים לאחר הסרת מMEFs) תאים לבידול.
  2. ביום שלפני ESCs בתרבית לבידול EB, מעבר תאים כך שהם יעמדו על כ 50-70% ומחוברות למחרת. המשך culturing תאים בינוני תחזוקת ESC כדי לשמור על pluripotency תא.
  3. ביום הבידול, תקשורת תחזוקה לשאוב ESC ולשטוף עם 1 מ"ל בופר פוספט (PBS: 137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, ו11.9 מ"מ חיץ פוספט, pH 7.4) לכל טוב של צלחת 6 היטב.
    1. הוסף 200 μl של tryps 0.25%ב/ EDTA היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
    2. להשבית טריפסין / EDTA עם 800 μl של תקשורת בידול. Pipet למעלה ולמטה בpipet סרולוגיות 2 מ"ל עם קצה p200 לשבור-up תאים לתוך השעיה תא בודדת. ודא שקצה p200 ישתלב בנוחות בסופו של הדבר כל כך התקשורת לא עולה בין pipet וממשק קצה.
    3. Pipet כ 5-10 פעמים למעלה ולמטה. יש להיזהר שלא ליצור בועות בpipetting.
  4. העברת תאי צינור חרוטי 15 מ"ל. להעלות את עוצמת הקול ל10 מ"ל עם PBS. צנטריפוגה ב315 XG למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. הסר supernatant. שטוף פעמיים עם 5 מ"ל PBS להסיר תקשורת שנותרה מכילה LIF. צנטריפוגה כמו בשלב 1.4 לכל שטיפה.
    1. Resuspend תא גלולה הסופי ב2 מ"ל של תקשורת בידול (טבלה 2).
  6. ספירת תאים עם דלפק hemocytometer או תא וצלחת 6,000-10,000 תאים / מ"ל ​​בצלחת פטרי 10 סנטימטר(התרבות שאינן רקמות שטופלה).
    1. לקבוע את התאים / מ"ל ​​המדויק באופן אמפירי עבור כל קו ESC. להשתמש בצלחות פטרי סטרילית משמשות בדרך כלל לעבודה בקטריאלי או צלחות היענות נמוכות.
      הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר בידול, EBS צריך טופס תחומים שנותרו בהשעיה מבלי לצרף לצלחת. לבדוק כמה מותגים של צלחות למצוא את אלה עם הדבקות לפחות.
    2. דגירה ESCs ההבחנה בתרבית רקמת חממה 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
מגיב המניה ריכוז סופי נפח חברה מספר קטלוגי
DMEM 1x 410 מ"ל S igma / אולדריץ D5796
FBS (ES הוקרן) 100% 15% 75 מ"ל Hyclone SH30070.03E
שאינם חיוני חומצות אמינו 100x 1x 5 מ"ל חיים טכנולוגיים 11140
L-גלוטמין 100x 1x 5 מ"ל חיים טכנולוגיים 35,050
Penncillin / סטרפטומיצין 100x 1x 5 מ"ל חיים טכנולוגיים 15070
β-mercaptoethanol 14.3 M 114 מיקרומטר 4 μl סיגמא / אולדריץ M3148
לוקמיה מעכבת פקטור (LIF) 10 7 יחידות / מ"ל 1,000 יחידות / מ"ל 50 μl Millipore ESG1107
ontent "> טבלת 1: ESC תחזוקת מדיה.

מגיב המניה ריכוז סופי נפח חברה מספר קטלוגי
DMEM 1x 410 מ"ל סיגמא / אולדריץ D5796
FBS (משתמש מוקרן לבידול אופטימלי) 100% 15% 75 מ"ל Hyclone SH30070.03E
שאינם חיוני חומצות אמינו 100x 1x 5 מ"ל חיים טכנולוגיים 11140
L-גלוטמין 100x 1x 5 מ"ל החיים TECHNOLOחיס 35,050
Penncillin / סטרפטומיצין 100x 1x 5 מ"ל חיים טכנולוגיים 15070
β-mercaptoethanol 14.3 M 114 מיקרומטר 4 μl סיגמא / אולדריץ M3148

טבלה 2: מדיה בידול.

2 תאי EB הכנה לוירוס זיהום

  1. בשלב הרצוי של פיתוח (בין היום 2 ויום 3), להעביר את EBS מצלחת פטרי 10 סנטימטר לצינור חרוטי 15 מ"ל. לשטוף את הצלחת עם 5 מ"ל PBS ולהוסיף לשטוף את צינור חרוטי.
  2. גלולה EBS ב315 XG בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. שוטף את תאי EB עם 5 מ"ל PBS.
  3. הוסף 1 מ"ל של תמיסה מופשרת ניתוק תא (מפרקי חלבונים המכילים אנזימי collagenolytic) ולמקם את הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס (או חממה) עבור 30 דקות עם OCCתסיסה asional (ממצליף או vortexing אור).
  4. הוסף 1 מ"ל של תקשורת בידול. Pipet למעלה ולמטה עם pipet 2 מ"ל עם קצה pipet p200. מניחים את הצינור באמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים שוב ל30-60 דקות.
  5. ספין למטה התאים ב 315 XG למשך 5 דקות ולשטוף את התאים עם PBS.

זיהום .3 וירוס

  1. Resuspend התאים 1.5 מ"ל של תקשורת בידול. מעבירים את ההשעיה התא לצלחת תרבות שאינה רקמה 6 היטב שטופלה.
  2. הכן את רטרווירוס על ידי טכניקות סטנדרטיים מבעוד מועד. להוסיף 5 עד 100 μl של supernatant הנגיפי לתאים בהתאם לכייל נגיף. אל תוסיף polybrene כדי לשפר את הזיהום כמו זה מעכב את הרפורמה הבאה של EBS.
  3. Spinoculate תאים עם וירוס על ידי צנטריפוגה ב2,120 XG ל90 דקות בטמפרטורת חדר.

.4 ההתמיינות תאי EB נגועות ויראלי בטיפות תליה

  1. הוסף 2 מ"ל של תקשורת בידול היטב בכל infected EB השעיה תא.
  2. Pipet 3.5 מ"ל של השעיה תא EB נגועה לתוך מאגר מגיב סטרילי לmultipipettors. השתמש בmultipipettor לpipet 15-20 שורות של שמונה 20 μl טיפות על המכסה ההפוך של 15 סנטימטר צלחת פטרי.
  3. הוסף 10 מ"ל של PBS או מים סטריליים למחצית התחתונה של צלחת פטרי. ואז להפוך את המכסה עם הטיפות ומקום לצלחת פטרי. ודא שהטיפין תלויות במהופך ממכסה עם PBS או מים מתחת כדי לשמור על התא humidified.
  4. מניחים את הכלים בתרבית רקמת חממת 37 מעלות צלזיוס עם .5.0% CO 2.
  5. לאחר 2 ימים, לאסוף EBS נוצר בתליית טיפות על ידי היפוך מיכסה וכביסה עם 4.5 מ"ל של תקשורת בידול.
    1. תקשורת העברה וEBS לצלחת פטרי תרבות 10 סנטימטר שאינה רקמה חדשה. שטוף את המכסה פעם נוספת עם 3 מ"ל של תקשורת בידול והעברה לצלחת 10 סנטימטר.
  6. קציר תאים לניתוח על ידי cytometry זרימה לאחר כולל של 8תרבות ימים החל מהעברה הראשונית של תאים לתקשורת בידול (-LIF).

.5 תאי הכנה לניתוח תזרים Cytometer

  1. העבר את התאים לצינור חרוטי 15 מ"ל עם 10 מ"ל pipet. לשטוף את הצלחת עם 5 מ"ל PBS ולהעביר לאותו צינור חרוטי.
  2. תאים גלולה ב315 x גרם. לשטוף כדורים עם 10 מ"ל PBS.
  3. הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תא מופשרת ומניח את הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, כאשר מדי פעם תסיסה. לצורך זיהוי של כמה אנטיגנים פני תא, טריפסין מקומם, ניתן להשתמש.
  4. הוסף 1 מ"ל תקשורת בידול וpipet למעלה ולמטה עם pipet 2 מ"ל. השתמש בקצה p200 לסוף pipet כדי לעזור לשבור-up מתעכל EB לתוך השעיה תא בודדת.
    1. מניחים את הצינור באמבטית 37 מעלות צלזיוס מים שוב ל60 דקות על מנת שחלבוני הקרום נפרד למחזר אל פני השטח התא.
  5. גלולה תאים ב315 XG למשך 5 דקות.
  6. שטוף את wi התאים0.1% V ה שור הסרום אלבומין חלק (BSA) שהוכן בPBS (PBS / BSA) ודגירת התאים עם ספציפי מתויג fluorescently נוגדנים.

.6 ניתוח cytometry זרימה לאבות המטופואטיות

  1. הנח 10 6 תאים EB נגזרים במ"מ 5 מ"ל 12 x 75 עגול צינור תחתון. לכוונון זרימת cytometer הגדרות פיצוי, להשתמש חרוזים פיצוי בהתאם להוראות יצרן.
  2. תאים גלולה ב315 x גרם. יוצקים את supernatant וגלול גלולים בפתרון PBS / BSA שייר בצינור.
  3. לאיתור ESC HPCs, דגירה התאים עם נוגדני ניאון שכותרתו: אנטי עכבר CD41-PE (R-Phycoerytherin) ו-APC אנטי עכבר CD117 (cKit) / Cy7 (Allophycocyanin Cyanine 7).
    1. לדלל נוגדני 1: 100 בPBS / BSA. הוספה של נוגדן מדולל 100 μl לכל דגימה. לקבוע את הדילול הנכון של נוגדן עבור כל ספק, שיבוט, והרבה או נוגדן. לקבוע דילול אופטימלי לתיוג תאים בנפרד.
    2. דגירה דגימות על קרח בחושך במשך 30 דקות.
    3. הוסף 2 מ"ל תאי PBS / BSA וגלול ב315 XG למשך 5 דקות.
    4. לשאוב supernatant וגלול גלול ב300 μl של PBS או אחר חיץ איזוטוני.
    5. תאי סינון resuspended דרך כובע מסננת תא (0.35 מיקרומטר) כדי להסיר אגרגטים תא גדולים.
    6. לנתח תאים על cytometer זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במחקרים אלה gelatinized RW4 (נגזר מזן עכבר 129X1 / SVJ) ESCs היו בשימוש. EBS היו מבודד ב3 ימים של בידול. לקבלת התוצאות הטובות ביותר EBS צריך להיות (איור 1 א ', ב') כדורי ולא חסיד. לאחר spinoculation עם וירוס שיתוף להביע GFP סמן פלואורסצנטי יחד עם גן של עניין, EBS היו רפורמה בשיטת הטיפה התלויה. EBS היו רפורמה בהצלחה מהשעיות תא שהוכנו מ2.0, 2.5, ו3.0 יום EBS. עם זאת, EBS לא ניתן היה רפורמה מהשעיות תא שהוכנו מהיום 4.0 EBS. Chimerism של EBS בין תאים נגועים ולא נגועים נצפה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ביום 8 של בידול (איור 2 א, ב '). הצפיפות של EBS לעתים קרובות הופכת את EBS נראה 100 GFP% חיוביים. עם זאת, התמקדות במטוסי מוקד שונים יכולה לחשוף את תרומתם של תאים חיוביים ושליליים GFP לEBS (איור 2).

Foניתוח r של פיתוח HPC, EBS chimeric היה ניתק לתוך השעיות תא בודדות לאחר 8 ימים של בידול. להרגיז את הפעילות של מירנה (ים) של אשכול mirn23a (מירס-23a, 24-2, ו-27) תוצאות בחוסר יכולת של ESCs להתמיין לתאי אב בדם (כתב יד בהכנה). כדי לקבוע אם ביטוי יתר של אשכול mirn23a יש ההשפעה ההפוכה, ESCs נדבקו בתחילת הבידול. עם זאת, זה תוצאות בדור של הירידה בHPCs. מאז אשכול mirn23a עשוי להיות מעורב בTGFß / BMP / סמאד איתות 18-21, האשכול עשוי להיות השפעות שונות כאשר הביעו בשלבים שונים של פיתוח EB דומים לחלבון Smad1 BMP4 מופעל 12,13. שימוש בפרוטוקול זה, השעיות תא בודד EB נדבקו לאחר 3 ימים של בידול. EBS היה רפורמה בתליית ירידה, ולאחר מכן נותח ביום 8 לדור HPC על ידי מנסה לאמוד expressio CD41 ותא שטח CD117n על ידי cytometry זרימה. CD41 + תאים חיוביים יחידים הם בריכה של HPCs הפרימיטיבי והמוחלט, ואילו תאים CD41 + CD117 + מכילים רק HPCs הסופי 22,23. אנו נצפו עלייה משמעותית באוכלוסייה הכוללת של CD41 + HPCs בתאי MSCV-mirn23a נגוע בהשוואה לתאי וירוס שליטת MSCV הנגוע (איור 3). הדמות גם מוכיחה כי תרומה גבוהה של תאים נגועים לEBS הרפורמה יכולה להיות מושגת. חשוב להדביק EBS עם שני וירוס שליטה המבטא את חלבון פלואורסצנטי לבד, כמו גם הדבקה של תאים בווירוס הניסיוני. אוכלוסיות נגועות (+ GFP) אמורות להיות בהשוואה להבדלים בפנוטיפ. הבדלי בחינה בין תאים נגוע לעומת תאים נגועים עשויים לתת תוצאות שגויות. השוואת GFP- (נגוע), וGFP + (נגוע) אוכלוסיות יש הבדל באוכלוסיות CD41 בשני MSCV ותרבויות MSCV-mirn23a (איור 3). גידול זה יכול להיות בגלללרטרווירוסים מדביקים תאי שגשוג.

איור 1
3 גופי יום נציג Embryoid ESCs RW4 היה עבר מתקשורת תחזוקת ESC לתקשורת בידול ותרבותי ב10 צלחות סנטימטר () תמונות 4X ו( B) 10X מוצגות גופי embryoid שהתפתחו לאחר 3 ימים של תרבות: איור 1... בתמונה 4X בר מייצג 1,000 מיקרומטר, ואילו בתמונה 10X בר מייצג 400 מיקרומטר.

איור 2
איור 2: גופות שמונה יום Embryoid (EB) רפורמה מיום 3 תאי EB retroviral נגועים. (א) שמאל תמונות הצד השני הן בשדה בהיר. (ב ') שלוש עמודות הניאון של תמונות ניאון מימין הן אותו הדבר EB נלקחו בDIFferent מטוסי מוקד. בתמונות 4X בר מייצג 1,000 מיקרומטר, ואילו ב10X תמונות הבר מייצג 400 מיקרומטר.

איור 3
איור 3:. השעיות זרימת cytometry הניתוח של תאי אבות היווצרות הדם מיוצרים בEBS chimeric תאים בודדים הוכנו מd3 EBS, ונגוע ברטרווירוסים שצוינו. EBS היה רפורמה בתליית ירידה, ותרבית 8 ימים נוספים. השעיות תא בודדות נוצרו וטופחו עם נוגדנים שכותרתו fluorescently לCD41, וCD117. חלקות יד היסטוגרמה עזבו להראות GFP- (תאים הנגועים באי) וGFP + (תאים נגועים) שערים. לוחות יד ימין להראות עלילת צבע נקודה של תאים חיוביים לCD41, וביטוי CD117 בGFP- וGFP + שערים. אבות היווצרות הדם פרימיטיביים נמצאים בCD41 + השברים, ואת האבות סופיים נמצאים בשני CD41 + CD117-, וCD41 + CD117 + שברים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאמור לעיל, השיבוטים ESC שinducibly להביע גן של עניין יכולים להיות שנוצרו תוך שימוש במערכות דוקסיציקלין, לעומת זאת, הדור של שורות אלה הוא הזמן רב ועבודה אינטנסיבית. שתואר בפרוטוקול זה הוא שיטה להביע את הגן של עניין בהשעית תא בודד שהוכנה מESC נגזרת EBS. לאחר מכן תאים נגועים אלה רפורמה לEBS בתליית טיפה לבחון בידול שלאחר מכן. בדוגמא (איור 3), שהוא מופיע ביטוי זה של אשכול mirn23a משפר את התפתחות hematopoietic כאשר הביעו ביום 3 של בידול. בשלב זה הפיתוח של רקמת שכבת נבט המתהווה התרחש כולל המזודרם המוקדם שמעורר אבות דם. ביום 2 ו -3 של בידול RW4 ESC, ביטוי של גנים המייצגים האאקטודרם (Pax6), האנדודרם (FoxA2), והמזודרם (ט, טוויסט, וTbx6) מזוהים על ידי PCR טרנסקריפטאז כמותית (Q-RT-PCR, נתונים לא מוצג). למילrn23a כדי לשפר את ייצור HPC, זה ייתכן שיצטרך לבוא לידי ביטוי בהמזודרם המוקדם. טכניקה זו מאפשרת ליכולת לקבוע אם transgene יש השפעות שונות על ביטויה הזמני ללא משקיע הרבה מאמץ כדי ליצור חומרים כימיים רומן. על התבוננות פנוטיפים הקשורים לביטוי זמני מובהק, עשוי חוקר רוצה עכשיו להשקיע את המאמץ כדי ליצור קווים מושרה בי הביטוי של transgene ניתן לשלוט בחוזקה.

יישומים אחרים לטכניקה זו כוללים ביצוע ניסויי הצלה בESCs שבו שני אללים של גן של עניין נמחקו (Knockout ESCs זוגי, DKOs). גן wildtype או גרסאות מוטציה של הגן שנמחק יכול להיות מחדש לתאי EB הבחנה. בנוסף הצלה של הפנוטיפ על ידי הגנים במורד הזרם של הגן נמחק ניתן להיות assayed. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבחון את הטבע הפנימי התא של פנוטיפים שנצפו. לדוגמא בhematopoiesis, פגמים נצפו בגנים המשפיעים על גזע hematopoietic ובתאים עצמם או לפעמים הפגם עלול להשפיע על תאים בmicroenvironment כי יש צורך לתמוך בפיתוח של תאי גזע ואב 16,24. במערכת זו, אם הפגם הוא מהותי לתאי אבות היווצרות הדם, ואז השבה לטבע של גן wildtype רק להציל פיתוח hematopoietic בGFP + תאים (retroviral נגועים). אם הפגם היה שאינו תא אוטונומי, אז זיהום retroviral יביא הצלה של פיתוח hematopoietic שנצפה בשני GFP + ואוכלוסיות GFP-.

בזרימת cytometry פרוטוקול זה משמש לזיהוי תאי אבות היווצרות הדם על ידי הביטוי פני התא של CD41 וCD117. לחלופין, לאחר 8 ימים של בידול נגוע GFP + תאים יכולים להיות מבודדים על ידי תא הקרינה מיון מופעל (FACS). התאים המבודדים אז יכולים להיות assayed עבור הנוכחות של spאבות היווצרות הדם ecific על ידי מבחני מושבה hematopoietic בתקשורת methylcellulose כפי שתוארנו קודם לכן 25,26. בדומה לכך, ניתן לחלץ RNA מהתאים ממוינים ונותח לביטוי של גנים ספציפיים שושלת.

היתרון של הטכניקה המתוארת הוא שזה דורש מאמץ מינימאלי על מנת ליצור את חומרים כימיים הדרושים, ומאפשר לביטוי זמני של transgene בEB הפיתוח. אם וקטור ויראלי שיתוף המבטא את הגן של עניין עם חלבון פלואורסצנטי זמין כבר הניסוי יכול להתבצע באופן מיידי. יש כמה מגבלות שיש להתחשב בבחירה להשתמש בפרוטוקול זה. הטכניקה המתוארת כאן דורשת היכולת לייצר רטרווירוס גבוה כייל יש מספר מספיק של תאים לניתוח. כמו כן שימו לב כי השימוש ברטרווירוס יכול לגרום mutagenesis insertional שיכול להניב פנוטיפ. עם זאת מאז פרוטוקול זה בוחן בריכה של תאים נגועים במקוםאוכלוסייה משובט, זה פחות סביר שפנוטיפ בשל mutagenesis insertional יקויימו על הזמן הקצר של התרבות. המגבלה העיקרית של הטכניקה (בהשוואה למערכת מושרה כמו במערכת ט ') היא ביטוי של transgene לא יכול להיות מושתקת בנקודת זמן מאוחרת יותר, ואין כל יכולת לשלוט על רמות ביטוי. ESCs המבטא transgene תחת השליטה של ​​הרגולציה דוקסיציקלין הוא יתרון שכן הוא מאפשר לא רק להפעלת הגן באופן זמני, אלא גם מאפשר לכיבוי הגן בנקודת זמן מאוחרת יותר. שונה הסכום של inducer כגון דוקסיציקלין גם יאפשר למשתמש לביטוי לכוונן. לבסוף המערכות מושרה לאפשר ביטוי לשחזור של את הגן בכל התאים, ואילו בפרוטוקול retroviral זה יש ביטוי chimeric של transgene. כפי שנאמר לעיל שהביטוי chimeric זה יכול להיות בעל ערך עבור יישומים מסוימים. המערכות מושרה מציעות באופן ברורהרבה יתרונות. עם זאת, בשל הקלות והעלויות קטנה של הטכניקה המתוארת כאן, חוקרים רבים ימצאו אותו שימושיים עבור לימודיהם של התמיינות תאי גזע עוברית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אי לנו אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma/Aldrich D5796
β-mercaptoethanol Sigma/Aldrich M3148
FBS (ES Screened) Hyclone SH30070.03E
FBS (Defined) Hyclone SH30070.03
Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140
L-Glutamine Life Technologies 35050
Penn/Strep Life Technologies 15070
Trypsin/EDTA Life Technologies 25200
LIF ESGRO Millipore ESG1107
ACCUMAX Millipore SCR006
Trypsin/EDTA Life Technologies 25200
Falcon Tissue Culture Plates 6-well Fisher Scientific 08-772-1B
Falcon Non-treated Plates 6-well Fisher Scientific 08-772-49
Falcon Petri dish 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Falcon Petri dish 15 cm Fisher Scientific 08-757-148
Falcon Tube 5 ml Fisher Scientific 14-959-11A
Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap Fisher Scientific 08-771-23
White sterile resevoirs U.S.A. Scientific 111-0700
Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated Biolegend 133906
Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated Biolegend 105826
RW4 ESCs ATCC CRL-12418

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  2. Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).
  3. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  4. Tian, X., Kaufman, D. S. Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls. Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).
  5. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
  6. Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336, 348-352 (1988).
  7. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323, 445-448 (1986).
  8. Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
  9. Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).
  10. Smith-Arica, J. R., et al. Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors. Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).
  11. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
  12. Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment. Blood. 117, 6489-6497 (2011).
  13. Zafonte, B. T., et al. Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window. Blood. 109, 516-523 (2007).
  14. Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell. 109, 29-37 (2002).
  15. Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).
  16. Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. Mesodermal patterning activity of SCL. Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).
  17. Kyba, M., et al. Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).
  18. Cao, M., et al. MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells. Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).
  19. Chan, M. C., et al. Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression. EMBO J. 29, 559-573 (2010).
  20. Huang, S., et al. Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer. 123, (2008).
  21. Min, S., et al. TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7. Genes Immun. 13, 621-631 (2012).
  22. Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo. Blood. 101, 508-516 (2003).
  23. Mitjavila-Garcia, M. T., et al. Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells. Development. 129, 2003-2013 (2002).
  24. Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews. Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).
  25. Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development. Embo J. 21, 2220-2230 (2002).
  26. Dahl, R., et al. Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor. Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 92 תאי גזע עובריים גוף Embryoid תאי hematopoietic אב רטרווירוס ביטוי גנים ביטוי גנים זמני
זיהום retroviral של Murine גזע עוברי תאי Embryoid גוף תא נגזר לניתוח של בידול המטופואטיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bikorimana, E., Lapid, D., Choi, H., … More

Bikorimana, E., Lapid, D., Choi, H., Dahl, R. Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation. J. Vis. Exp. (92), e52022, doi:10.3791/52022 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter