Protocol
1，胚状体（EB）形成
- 明胶调整已维持在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）胚胎干细胞。通路胚胎干细胞在6孔组织培养板3次涂覆有0.1％明胶去除的MEF。
- 生长的细胞在ESC维持培养基与LIF，以保持未分化（ 表1）的细胞。确保电池不会超过80％汇合。细胞分化（由MEF除去后10个或更少的通道）使用低传代。
- 关于前胚胎干细胞可用于EB分化培养一天，通道的细胞，使它们将约为50-70％汇合的第二天。继续维持ESC培养基中培养细胞，保留细胞的多能性。
- 在分化，吸ESC维持培养基和当天洗用1ml磷酸盐缓冲盐水（PBS：137 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，和11.9 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4）中每一个6孔板的。
- 加入200微升的0.25％tryps在/ EDTA至各孔中，在37℃下进行3分钟。
- 灭活胰蛋白酶/ EDTA与800微升分化培养基中。吸取上下在2 ml血清吸管用P200尖分手的细胞成单细胞悬液。确保P200尖端完全吻合的末尾，以便媒体不上去的吸管和小费接口之间。
- 吸取上下约5-10倍。小心不要移液过程中产生的气泡。
- 细胞转移到15毫升锥形管。调出量10毫升的PBS中。离心机在315×g离心5分钟，在室温下进行。
- 取出上清液。用5毫升的PBS洗两次，以除去含LIF剩余的介质。离心机在每次洗涤步骤1.4。
- 重悬在2ml的分化培养基（ 表2）的最终的细胞沉淀。
- 计数细胞，血球或细胞计数和板10cm的培养皿6000-10000个/ ml（非组织培养处理）。
- 确定确切的细胞/ ml凭经验每个ESC线。使用通常用于细菌工作或低粘附板的无菌皮氏培养皿。
注：为了获得最佳的差异化效果，胚体应形成保持悬浮而不附着在平板领域。测试几个品牌平板找到那些用最少的坚持。 - 孵育分化的胚胎干细胞在37℃组织培养箱5％的CO 2。
- 确定确切的细胞/ ml凭经验每个ESC线。使用通常用于细菌工作或低粘附板的无菌皮氏培养皿。
| 试剂 | 股票 | 终浓度 | 成交量 | 公司 | 目录编号 |
| DMEM | 1个 | 410毫升 | Š IGMA /奥尔德里奇 | D5796 | |
| FBS（ES屏蔽） | 100％ | 15％ | 75毫升 | Hyclone公司 | SH30070.03E |
| 非必需氨基酸 | 100X | 1个 | 5毫升 | Life Technologies公司 | 11140 |
| L-谷氨酰胺 | 100X | 1个 | 5毫升 | Life Technologies公司 | 35050 |
| Penncillin /链霉素 | 100X | 1个 | 5毫升 | Life Technologies公司 | 15070 |
| β-巯基乙醇 | 14.3 M | 114微米 | 4微升 | 西格玛/ Aldrich公司 | M3148 |
| 白血病抑制因子（LIF） | 10 7个/毫升 | 1000个/毫升 | 50微升 | 密理博 | ESG1107 |
| 试剂 | 股票 | 终浓度 | 成交量 | 公司 | 目录编号 |
| DMEM | 1个 | 410毫升 | 西格玛/ Aldrich公司 | D5796 | |
| FBS（用户筛选最佳的分化） | 100％ | 15％ | 75毫升 | Hyclone公司 | SH30070.03E |
| 非必需氨基酸 | 100X | 1个 | 5毫升 | Life Technologies公司 | 11140 |
| L-谷氨酰胺 | 100X | 1个 | 5毫升 | 生活TECHNOLO吉斯 | 35050 |
| Penncillin /链霉素 | 100X | 1个 | 5毫升 | Life Technologies公司 | 15070 |
| β-巯基乙醇 | 14.3 M | 114微米 | 4微升 | 西格玛/ Aldrich公司 | M3148 |
表2：差异化媒体。
2，准备EB细胞病毒感染
- 在发展的所需阶段（第2天第3天之间），从10cm培养皿的胚转移到15毫升锥形管中。用5ml PBS洗涤板和洗涤添加到锥形管中。
- 沉淀在胚胎发育第315 XG在室温下搅拌5分钟。用5毫升的PBS洗EB细胞。
- 加入1毫升解冻细胞分离液（含蛋白酶和胶原溶解酶），置于37℃水浴管（或孵化器）30分钟与OCCasional搅拌（自弹或轻涡旋）。
- 加入1 ml分化培养基中。吸取上下以2毫升移液管与P200的枪头。再次将管子在37℃水浴30〜60分钟。
- 降速的细胞在315×g离心5分钟，并用PBS洗涤细胞。
3，病毒感染
- 重悬在1.5ml分化培养基中的细胞。细胞悬液转移到6孔非经组织培养物处理板。
- 准备逆转录病毒通过提前的标准技术。添加5〜100μl病毒上清液，以根据病毒滴度的细胞。不添加聚凝胺，以提高感染，因为这抑制了EBS的后续改革。
- 通过在2,120 XG离心，在室温下90分钟Spinoculate细胞与病毒。
4，区分病毒性感染的EB细胞悬滴
- 加入2mL分化培养基对我每口井nfected EB细胞悬液。
- 移液管将3.5毫升感染EB细胞悬液放入无菌试剂水库multipipettors。使用multipipettor到吸管15-20行8 20微升滴到15厘米培养皿的反转盖子。
- 加入10毫升无菌PBS或水的底部的培养皿的一半。然后反转的下降和地点到培养皿的盖子。确保滴挂在锅盖用PBS或以下的流水倒扣，以保持室内加湿。
- 将菜在37℃组织培养箱有5.0％的CO 2。
- 后第2天，收集滴通过反转盖子和洗涤用4.5ml分化培养基中形成的悬挂的EB。
- 传输介质和EBS到一个新的10厘米非组织培养培养皿。用3毫升分化培养基并转移至10cm平板的洗盖一次。
- 收获细胞共8后流式细胞仪分析流程天的培养，从细胞的初始传送到分化培养基（-LiF）开始。
在流式细胞仪分析5。准备细胞
- 细胞转移到15毫升锥形管，用10毫升吸管。用5ml PBS洗涤该板，并转移到同一个锥形管。
- 颗粒细胞在315×g的。洗粒料用10ml PBS中。
- 加入1 ml的解冻细胞分离溶液，然后将试管在37℃水浴中30分钟，偶尔搅拌。用于检测某些细胞表面抗原，可以使用胰蛋白酶代替。
- 加入1 ml分化培养基和吸管上下2毫升移液管。使用P200尖吸管的一端，以帮助分手EB消化成单细胞悬液。
- 再次将管在37℃水浴中60分钟，以使整合膜蛋白，以再循环到细胞表面。
- 沉淀细胞，在315×g离心5分钟。
- 洗细胞无线网络在PBS（PBS / BSA）中制备次0.1％的牛血清白蛋白级分V（BSA）孵育的细胞的特异性荧光标记的抗体。
对造血祖细胞6流式细胞仪分析
- 将106 EB的细胞在5ml的12×75毫米圆底管。用于调节流动血细胞计数补偿设定，根据制造商的说明使用补偿珠。
- 颗粒细胞在315×g的。倒掉上清，重悬沉淀在管残余的PBS / BSA溶液。
- 用于检测ESC高性能计算机，孵育细胞与荧光标记的抗体：抗小鼠CD41-PE（R-藻红蛋白）和抗小鼠CD117（CKIT）-APC / CY7（别藻蓝蛋白花青7）。
- 稀释抗体1：在PBS / BSA 100。加入100μl的稀释抗体至每个样品。确定正确的稀释抗体对每个供应商，克隆和地段或抗体。确定最佳稀释单独标记的细胞。
- 在冰上孵育的样品在黑暗中30分钟。
- 加入2毫升的PBS / BSA和颗粒细胞在315×g离心5分钟。
- 吸出上清液，在300微升PBS或其他缓冲等渗重悬沉淀。
- 通过细胞过滤器盖（0.35微米）过滤悬浮细胞，除去大细胞聚集。
- 在流式细胞仪分析细胞。
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Representative Results
在这些研究中胶凝RW4胚胎干细胞（从129X1 / SVJ小鼠品系派生）被使用。胚中分离在分化的3天。为了达到最佳效果EBS的应是球形和非贴壁（ 图1A，B）。 spinoculation与病毒共表达与感兴趣的基因的荧光标记的GFP后，胚被悬滴法改性。胚成功从2.0，2.5，和3.0天胚制备细胞悬液改革。但是，胚不能从4.0天的EB制备细胞悬浮液改性。受感染的和未感染的细胞之间的EB的嵌合体观察通过荧光显微术在分化第8天（ 图2A，B）。 EBS的密度往往使得胚似乎是100％的GFP阳性。但是，着眼于不同的焦平面可以揭示GFP阳性和阴性细胞向胚体（ 图2B）的贡献。
佛HPC发展ŕ分析，嵌合胚8天后分化的被离解成单细胞悬浮液。拮抗miRNA的（多个）mirn23a集群的活性（的miR-23a中，24-2，和-27）导致胚胎干细胞的无能分化为血液祖细胞（手稿中制备）。以确定是否mirn23a簇的表达具有相反的效果，胚胎干细胞被感染，在分化的发作。然而，这导致在产生的降低高性能计算机。由于mirn23a簇可能参与TGFß/ BMP / Smad信号18-21，群集可具有不同的作用，当在EB发展类似于BMP4激活的Smad1蛋白12,13不同阶段的表达。通过此协议，光大单细胞悬液后，分化为3天被感染。胚是由悬滴通过测定CD41和CD117的细胞表面expressio改革，并随后在高性能计算代8天的分析N以流式细胞仪。 CD41 +单阳性细胞是原始的，明确的高性能计算机池，而CD41 + CD117 +细胞只含有明确的高性能计算机22,23。我们观察到相对于MSCV对照病毒感染的细胞（ 图3）显著增加CD41 +高性能计算机中的MSCV-mirn23a感染细胞的总人口。该图还显示，受感染的细胞，以改革胚高贡献才能实现。它感染的EB与两个对照病毒表达的荧光蛋白单独，以及与实验病毒感染的细胞是重要的。受感染的人群（GFP +）然后应该比在表型差异。与受感染的细胞未受感染的细胞之间的差异研究可能会导致错误的结果。比较GFP-（未感染）和GFP +（感染）人口都处于两者MSCV和MSCV-mirn23a培养物（ 图3）的CD41群的差。这种增加可能是由于以反转录病毒感染增殖细胞。
图1：代表性的3天胚体 RW4胚胎干细胞是从ESC维持培养基切换到分化培养基中，并在10厘米平板上培养（A）4X和（B）的 10倍的图像示后培养3天后，发达国家的胚状体的。在4X图像的条代表1000μm以下，而在10X图像的条表示400微米。
图2：八天的胚状体（EB）的逆转录病毒感染第3天的EB细胞的改革。 （一）左侧图像是亮场（B）荧光图像的三个荧光列右边都是相同的EB中DIF采取同的焦平面。在4X图像的条代表1000μm以下，而在10X图像的条表示400微米。
图3：流式细胞术在嵌合胚产生造血祖细胞的分析单细胞悬液，从D3的EB制备和感染所指示的逆转录病毒。胚是由悬滴改革，培养了8天。生成并孵育荧光标记的抗体与CD41和CD117的单细胞悬浮液。左手直方图显示了GFP-（未感染的细胞）和GFP +（感染细胞）门电路。右侧的面板显示阳性细胞CD41的颜色散点图和CD117表达的GFP-和GFP +门。原始造血祖细胞中发现的CD41 +级分，和确定的祖细胞中都存在的CD41 + CD117-和CD41 + CD117 +级。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
如上所讨论的，可以使用多西环素系统产生ESC克隆诱导地表达感兴趣的基因，然而，产生这些线是耗时且劳动密集型的。另外，在本协议是为了表达从ESC准备单细胞悬液衍生胚目的基因的方法。然后，这些被感染的细胞改造成胚体由悬滴检查后续的分化。在这个例子中（ 图3），它示出了mirn23a簇的表达增强了造血发育时，在分化的第3天表达。在这一点上已发生新生胚层组织的发展，包括早期的中胚层，使人们产生血祖细胞。在RW4 ESC分化，基因代表外胚层（Pax6基因），内胚层（FOXA2）和中胚层（T，扭曲，并Tbx6）通过定量逆转录聚合酶链反应（Q-RT-PCR数据未检测到表达2天和第3天示出）。对于MIrn23a提升HPC生产，它可能需要被表达在早期中胚层。这种技术允许以确定是否有转基因在它的时空表达不同的效果，而无需花费大量的精力去创造新的试剂的能力。当观察到具有不同的时间表达相关联的表型，调查员可能希望现在花的精力来产生，其中所述转基因的表达可被严格控制的诱导线。
这种技术的其他应用包括胚胎干细胞进行救援实验中目的基因的两个等位基因已被删除（双基因敲除的胚胎干细胞，DKOs）。野生型基因或缺失的基因的突变形式可以被重新引入到分化的EB的细胞。通过删除基因的下游基因另外救援的表型可以进行检测。该方法可用于检查所观察到的表型的细胞的内在性质。例如在hematopoiesis，缺陷已在基因的影响或者造血干细胞和祖细胞本身或有时该缺陷可能会影响细胞中都需要支持干细胞和祖细胞16,24的发展，该微环境变化。在这个系统中，如果缺陷是固有的造血祖细胞，然后在野生型基因的再次投入只会营救造血发育中的GFP +（逆转录病毒感染的细胞）。如果缺陷是无细胞自主，然后逆转录病毒感染会导致造血发育的救援两种GFP +和GFP的人口被观察到。
在这个协议流式细胞术所使用的CD41和CD117的细胞表面表达来识别造血祖细胞。或者，在8天后分化的感染的GFP +细胞可以通过荧光激活细胞分选（FACS）分离。将分离的细胞然后可以测定菌的存在ecific造血祖细胞在甲基纤维素介质的造血集落测定法如我们先前描述的25,26。类似地，RNA可以从分选的细胞中提取，并用于谱系特异性基因表达进行分析。
所描述的技术的优点是，它需要最小的努力来产生所需要的试剂，并允许在显影EB转基因的瞬时表达。如果病毒载体共表达的与荧光蛋白感兴趣的基因是已经可用的实验就可以立即执行。有被认为是与选择使用此协议的一些限制。这里概述的技术确实需要以产生高滴度逆转录病毒具有细胞进行分析的足够数量的能力。还注意，使用逆转录病毒可导致插入突变可能产生的表型。然而，由于该协议正在研究的感染细胞池，而不是克隆群体，这是不太可能的是，由于插入突变的表型将在培养的短的时间内观察到。该技术的主要限制（相对于可诱导的系统在TET系统等）的转基因的表达不能在以后的时间点沉默，并且没有能力控制的表达水平。胚胎干细胞的表达多西环素调节的控制下的转基因是有利的，因为它不仅允许在一个时间的方式转动的基因上，而且还允许用于关闭该基因在稍后的时间点。不同的诱导物的量，例如多西环素也将允许用户微调表达。最后可诱导的系统允许在所有细胞中的转基因的可再现表达，而在此逆转录协议有转基因的嵌合体的表达。如上述，虽然讨论了该嵌合表达可能对于某些应用价值。该诱导系统清楚地提供了很多优点。然而，由于方便和降低费用这里说明的技术，许多研究人员会发现它是有用的胚胎干细胞分化的研究。
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Disclosures
作者们没有竞争的经济利益披露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
References
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