Protocol
1. embryoide Krop (EB) Stiftelse
- Gelatine-tilpasse økonomiske og sociale råd, der er blevet opretholdt på mus fibroblaster (MEF). Passage ESC 3 gange på 6 brønds vævskulturplade overtrukket med 0,1% gelatine til fjernelse MEF'er.
- Dyrk celler i ESC vedligeholdelse medier med LIF at holde cellerne ikke-differentierede (tabel 1). Sørg for, at celler aldrig overstige 80% konfluens. Brug lav passage (10 eller færre passager efter fjernelse fra MEF'er) celler til differentiering.
- På dagen før ESC dyrkes i EB differentiering passage cellerne, så de vil være ca 50-70% konfluente den næste dag. Fortsæt dyrkning af celler i ESC vedligeholdelsesmedium at bevare celle pluripotens.
- På dagen for differentiering, aspireres ESC vedligeholdelse medier og vask med 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS: 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, og 11,9 mM phosphatpuffer, pH 7,4) pr brønd af en 6-brønds plade.
- Tilsæt 200 pi af 0,25% trypsi / EDTA til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 3 minutter.
- Inaktivere trypsin / EDTA med 800 pi af differentiering medier. Pipette op og ned i et 2 ml serologisk pipette med en P200 spids til at bryde op på de celler til en enkelt celle suspension. Sørg for, at P200 spids passer stramt på enden, så medierne ikke går op mellem pipetten og drikkepenge interface.
- Pipette op og ned omkring 5-10 gange. Pas på ikke at skabe bobler under pipettering.
- Overfør celler til en 15 ml konisk rør. Bring op til et rumfang på 10 ml med PBS. Centrifugeres ved 315 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten. Vask to gange med 5 ml PBS for at fjerne de resterende medier indeholdende LIF. Centrifugeres som i trin 1.4 for hver vask.
- Resuspender den endelige cellepellet i 2 ml differentiering medier (tabel 2).
- Tæl cellerne med et hæmocytometer eller celletæller og pladen 6,000-10,000 celler / ml i en 10 cm petriskål(Ikke-vævskultur behandlet).
- Bestemme den nøjagtige celler / ml empirisk for hver ESC linje. Brug sterile petriskåle normalt anvendes til bakteriel arbejde eller lav adhærens plader.
BEMÆRK: Du opnår de bedste differentiering resultater, bør EBS danne sfærer, der forbliver i suspension uden at knytte til pladen. Test flere mærker af plader til at finde dem med den mindste tilslutning. - Inkuber de differentierende ESC i et 37 ° C vævskultur inkubator med 5% CO2.
- Bestemme den nøjagtige celler / ml empirisk for hver ESC linje. Brug sterile petriskåle normalt anvendes til bakteriel arbejde eller lav adhærens plader.
| Reagens | Lager | Slutkoncentration | Volumen | Virksomhed | Katalognummer |
| DMEM | 1x | 410 ml | S IGMA / Aldrich | D5796 | |
| FBS (ES Skærmet) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Ikke-essentielle aminosyrer | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 35050 |
| Penncillin / Streptomycin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-mercaptoethanol | 14,3 M | 114 uM | 4 pi | Sigma / Aldrich | M3148 |
| Leukæmiinhiberende faktor (LIF) | 10 7 enheder / ml | 1.000 enheder / ml | 50 pi | Millipore | ESG1107 |
| Reagens | Lager | Slutkoncentration | Volumen | Virksomhed | Katalognummer |
| DMEM | 1x | 410 ml | Sigma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (Bruger screenet for optimal differentiering) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Ikke-essentielle aminosyrer | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologier | 35050 |
| Penncillin / Streptomycin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-mercaptoethanol | 14,3 M | 114 uM | 4 pi | Sigma / Aldrich | M3148 |
Tabel 2: Differentiering Medier.
2. Forberedelse EB Celler til virusinfektion
- På den ønskede udviklingstrin (mellem dag 2 og dag 3), overføre EB'er fra 10 cm petriskål til 15 ml koniske rør. Vask pladen med 5 ml PBS, og tilsæt vask den koniske rør.
- Pelletere EB'er ved 315 xg ved stuetemperatur i 5 min. Vask EB celler med 5 ml PBS.
- Der tilsættes 1 ml optøet celle detachement (indeholdende proteolytisk og collagenolytiske enzymer) og placere rørene i et 37 ° C vandbad (eller inkubator) i 30 min med OCCasional agitation (fra svirpe eller lys vortexbehandling).
- Der tilsættes 1 ml differentiering medier. Pipette op og ned med en 2 ml pipette med en p200 pipettespids. Glasset anbringes i 37 ° C vandbad igen i 30-60 min.
- Spin ned cellerne ved 315 x g i 5 minutter og vask af cellerne med PBS.
3. Virus Infektion
- Resuspender celler i 1,5 ml differentiering medier. Overfør cellesuspensionen til en 6-brønds ikke-vævskulturbehandlede plade.
- Forbered retrovirus ved standardteknikker før tid. Tilføj 5 til 100 ul virussupernatant til celler, afhængigt af virustiter. Må ikke tilføje polybrene at forbedre infektion, da dette hæmmer efterfølgende reformation EBS.
- Spinoculate cellerne med virus ved centrifugering ved 2.120 x g i 90 min ved stuetemperatur.
4. Differentiering virusinficerede EB Celler i hængende Dråber
- Tilsæt 2 ml differentiering medier til hver brønd af infected EB cellesuspension.
- Pipetter 3,5 ml inficeret EB cellesuspension i en steril reagens reservoir for multipipettors. Brug multipipettor at pipettere 15-20 rækker af otte 20 ul dråber på den omvendte låg 15 cm petriskål.
- Tilsæt 10 ml sterilt PBS eller vand til den nederste halvdel af petriskål. Derefter vendes låget med dråber og sted onto Petri pladen. Sørg for, at dråberne hænger på hovedet ned fra låget med PBS eller vand nedenfor for at holde kammeret befugtet.
- Placer servicet i 37 ° C vævsdyrkningsinkubator med 5,0% CO 2.
- Efter 2 dage, indsamle EB dannet i hængende dråber ved inverterende låg og vask med 4,5 ml differentiering medier.
- Overfør medier og EBS til en ny 10 cm ikke-vævskultur petriskål. Vask låget endnu en gang med 3 ml differentiering medier og overførsel til 10 cm plade.
- Harvest celler til analyse ved hjælp af flowcytometri efter i alt 8dages dyrkning fra det indledende overførsel af celler til differentiering medier (-LIF).
5. Forberedelse Celler til flowcytometer Analyse
- Overfør cellerne til et 15 ml konisk rør med en 10 ml pipette. Vask pladen med 5 ml PBS og overføres til den samme koniske rør.
- Pellet cellerne ved 315 x g. Vask pellets med 10 ml PBS.
- Der tilsættes 1 ml optøet celle løsrivelse opløsning og placere rørene i et 37 ° C vandbad i 30 minutter med lejlighedsvis omrøring. Til påvisning af nogle celleoverfladeantigener kan trypsin anvendes i stedet.
- Tilsæt 1 ml differentiering medier og pipetteres op og ned med en 2 ml pipette. Brug en p200 spids til enden af pipetten for at hjælpe med at bryde op fordøjet EB i enkelt cellesuspension.
- Glasset anbringes i et 37 ° C vandbad igen i 60 minutter for at de integrerede membranproteiner at genbruge til celleoverfladen.
- Pelletere cellerne ved 315 xg i 5 minutter.
- Vask cellerne with 0,1% bovint serumalbumin fraktion V (BSA) fremstillet i PBS (PBS / BSA) og inkuberes cellerne med specifik fluorescens mærkede antistoffer.
6. Flowcytometri Analyse for hæmatopoietiske progenitorer
- Placer 10 6 EB-afledte celler i en 5 ml 12 x 75 mm rundbundet rør. Til justering flowcytometer indstillinger kompensation bruge kompensation perler overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Pellet cellerne ved 315 x g. Hæld supernatanten og resuspender pelleten i tilbageværende PBS / BSA-opløsning i røret.
- Til påvisning af ESC HPC'er inkuberes cellerne med fluorescerende mærkede antistoffer: anti-muse-CD41-PE-(R-phycoerytherin) og anti-muse-CD117 (cKit) APC / CY7 (allophycocyanin Cyanin 7).
- Fortyndet antistoffer 1: 100 i PBS / BSA. Tilsæt 100 pi fortyndet antistof til hver prøve. Bestem den korrekte fortynding af antistof til hver leverandør, klon og parti eller antistof. Bestem optimal fortynding til mærkning celler individuelt.
- Inkuber prøverne på is i mørke i 30 minutter.
- Tilsæt 2 ml PBS / BSA og pellet celler ved 315 xg i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten og resuspender pellet i 300 pi PBS eller en anden isotonisk puffer.
- Filter resuspenderet celler gennem et cellefilter hætte (0,35 uM) for at fjerne store celleaggregater.
- Analysér cellerne på et flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I disse undersøgelser gelatiniserede RW4 (Afledt af 129X1 / SVJ musestamme) ESC blev anvendt. EB blev isoleret ved 3 dages differentiering. For de bedste resultater EBS skal være sfærisk og ikke-klæbende (figur 1A, B). Efter spinoculation med virus co-udtrykker fluorescerende markør GFP sammen med et gen af interesse, blev EB reformeret af hængende dråbe-metoden. EB'er lykkedes reformeret fra cellesuspensioner fremstillet fra 2,0, 2,5, og 3,0 dage EB'er. Imidlertid kunne EB ikke reformeres fra cellesuspensioner fremstillet fra dag 4.0 EB'er. Den kimærisme EBS mellem inficerede og ikke-inficerede celler blev observeret ved fluorescensmikroskopi på dag 8 af differentiering (figur 2A, B). Densiteten af EB ofte gør EBS synes at være 100% GFP-positive. Dog kan fokusere på forskellige fokusplaner afsløre bidrag GFP positive og negative celler til EB (figur 2B).
For analyse HPC udvikling blev kimære EB dissocieres i enkelte cellesuspensioner efter 8 dage af differentiering. Antagonisere aktiviteten af miRNA (r) i mirn23a klynge (Mirs-23a, 24-2, og -27) resulterer i en manglende evne til økonomiske og sociale råd til at differentiere til blod stamceller (Manuskript under udarbejdelse). At afgøre, om overekspression af mirn23a klynge har den modsatte effekt, blev ØSR smittet ved starten af differentiering. Dette resulterer imidlertid i generation af nedsat HPCs. Da mirn23a klynge kan være involveret i TGFß / BMP / Smad signalering 18-21, kan klyngen have forskellige virkninger, når de udtrykkes på forskellige stadier af EB udvikling svarende til BMP4 aktiveret Smad1 protein 12,13. Ved anvendelse af denne protokol blev EB enkelt cellesuspensioner inficeret efter 3 dages differentiering. EB blev reformeret ved hængning dråbe, og efterfølgende analyseret på dag 8 for HPC generation ved analyse CD41 og CD117 celleoverfladen expression ved flowcytometri. CD41 + enkelt positive celler er en pulje af primitive og endelige HPCs, mens CD41 + CD117 + celler indeholder alene endelige HPCs 22,23. Vi observerede en betydelig stigning i den samlede population af CD41 + HPCs i MSCV-mirn23a inficerede celler sammenlignet med MSCV kontrol virusinficerede celler (Figur 3). Figuren viser også, at en høj bidrag inficerede celler til de reformerede EB kan opnås. Det er vigtigt at inficere EB'er med både en kontrol virus, der udtrykker det fluorescerende protein alene, samt at inficere celler med den eksperimentelle virus. Inficerede populationer (GFP +) skal derefter sammenholdes for forskelle i fænotype. Undersøgelse forskelle mellem ikke-inficerede celler versus inficerede celler kan give fejlagtige resultater. Sammenligning GFP- (inficerede), og GFP + (inficeret) befolkningsgrupper der er en forskel i CD41 befolkninger i både MSCV og MSCV-mirn23a kulturer (Figur 3). Denne stigning kan skyldestil retrovirus inficerer proliferative celler.
Figur 1: Repræsentant Dag 3 embryoide Organer RW4 økonomiske og sociale råd blev skiftet fra ESC vedligeholdelse medier i differentiering medier og dyrket i 10 cm plader (A) 4X og (B) 10X billeder vises af embryoide organer, der er udviklet efter 3 dages dyrkning... I 4X billedet baren repræsenterer 1.000 um, mens baren i 10X billedet repræsenterer 400 um.
Figur 2: Otte dages embryoide Bodies (EB) reformeret fra retrovirale inficerede dag 3 EB celler. (A), venstre side billeder er lyse felt. (B) De tre fluorescerende søjler af fluorescerende billeder til højre er de samme EB taget i difskellige brændpunktsflader. I 4X billeder baren repræsenterer 1.000 um, mens baren i 10X billeder repræsenterer 400 um.
Figur 3:. Flowcytometrianalyse af hæmatopoietiske progenitorceller produceret i kimære EB enkeltceller suspensioner blev fremstillet ud fra d3 EB'er, og inficeret med de angivne retrovira. EB blev reformeret ved hængning dråbe, og dyrkes yderligere 8 dage. Enkelte cellesuspensioner blev dannet og inkuberet med fluorescensmærkede antistoffer mod CD41 og CD117. Venstre hånd histogram plots viser GFP- (ikke-inficerede celler) og GFP + (inficerede celler) porte. De rigtige paneler hånd viser farvepunkt plot af celler er positive for CD41 og CD117 ekspressionen i GFP- og GFP + porte. Primitive hematopoietiske progenitorer findes i CD41 + fraktioner, og endelige progenitorer er til stede i både CD41 + CD117-, og CD41 + CD117 + fraktioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som beskrevet ovenfor, kan ØSU kloner, som inducerbart udtrykker et gen af interesse genereres ved hjælp af doxycyclin systemer dog generation af disse linjer er tidskrævende og arbejdskrævende. Beskrevet i denne protokol er en metode til at udtrykke et gen af interesse i en enkelt celle suspension fremstillet fra ESC afledte EB'er. Disse inficerede celler bliver derefter reformeret i EB'er ved hængning slip for at undersøge efterfølgende differentiering. I eksemplet (figur 3) er det vist, at ekspression af mirn23a klynge forbedrer hæmatopoietisk udvikling, når de udtrykkes på dag 3 af differentiering. På dette punkt af udviklingen af spirende kim lag væv har fundet sted, herunder tidlig mesoderm, der giver anledning til blod stamceller. På dag 2 og 3 i RW4 ESC differentiering, ekspression af gener, der repræsenterer ectoderm (Pax6), endoderm (FoxA2), og mesoderm (T, Twist, og Tbx6) påvises ved kvantitativ revers transkriptase PCR (Q-RT-PCR, Data ikke vist). For mirn23a at øge HPC produktion, kan det være nødvendigt at udtrykkes i tidlig mesoderm. Denne teknik gør det muligt for evnen til at afgøre, om en transgen har forskellige virkninger på dens tidsmæssige udtryk uden expending en stor indsats for at generere nye reagenser. Ved at observere fænotyper forbundet med tydelig tidsmæssig udtryk, kan en investigator vil nu tilbringe en indsats for at generere inducerbare linjer, hvor ekspressionen af transgen kan stramt kontrolleret.
Andre applikationer til denne teknik omfatter udførelse af rednings eksperimenter i økonomiske og sociale råd, hvor begge alleler af et gen af interesse er blevet slettet (Dobbeltværelse Knockout økonomiske og sociale råd, DKOs). Vildtype genet eller muterede versioner af slettede gen kunne genindføres i de differentierende EB celler. Derudover redning af en fænotype af gener nedstrøms for det deleterede gen kan analyseres. Denne metode kan bruges til at undersøge celle iboende natur af de observerede fænotyper. For eksempel i hematopoiesis har defekter blevet observeret i gener, som påvirker enten hæmatopoietiske stamceller og stamceller selv eller undertiden defekten kan påvirke celler i mikromiljø, der er nødvendige for at støtte udviklingen af stamceller og stamceller 16,24. I dette system, hvis fejlen er væsentlig for hæmatopoietiske progenitorceller, så genindførelse af vildtype-genet, vil kun redde hæmatopoietiske udvikling i GFP + (retrovirale inficerede) celler. Hvis defekten var ikke-celleautonom, så retroviral infektion ville resultere i en redning af hæmatopoietisk udvikling bliver observeret i både GFP + og GFP- populationer.
I denne protokol flowcytometri anvendes til at identificere hæmatopoietiske progenitorceller af celleoverfladeekspression af CD41 og CD117. Alternativt, efter 8 dages differentiering inficeret GFP +-celler kan isoleres ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). De isolerede celler kan derefter undersøges for tilstedeværelsen af specific hæmatopoietiske stamfædre af hæmatopoietiske koloniassays i methylcellulose medier, som vi tidligere har beskrevet 25,26. Ligeledes kan RNA ekstraheres fra sorterede celler og analyseret for ekspression af slægt specifikke gener.
Fordelen ved den beskrevne teknik er, at det kræver en minimal indsats for at generere de nødvendige reagenser og giver mulighed for tidsmæssig ekspression af et transgen i udviklingslandene EB. Hvis en viral vektor co-ekspression af genet af interesse med et fluorescerende protein, der allerede er tilgængelige forsøget kan udføres straks. Der er nogle få begrænsninger, der skal overvejes med at vælge at bruge denne protokol. Teknikken er skitseret her kræver evnen til at producere høj-titer retrovirus til at have et tilstrækkeligt antal celler til analyse. Bemærk også, at brugen af retrovirus kan resultere i insertionsmutagenese, der kunne give en fænotype. Men da denne protokol undersøger en pulje af inficerede celler i stedet for etklonpopulation, er det mindre sandsynligt, at en fænotype skyldes insertionsmutagenese vil blive observeret i løbet af kort tid af kulturen. Den største begrænsning for teknikken (sammenlignet med et inducerbart system, såsom ved tet system), er, at ekspression af transgenet kan ikke afbrydes på et senere tidspunkt, og der er ingen mulighed for at kontrollere niveauet af ekspression. ESC, der udtrykker et transgen under kontrol af doxycyclin regulering er fordelagtig, eftersom den gør det muligt ikke blot at tænde for genet i en temporal måde, men giver også mulighed for at slukke genet på et senere tidspunkterne. Variere mængden af en induktor, som f.eks doxycyclin vil også give brugeren mulighed for at finjustere udtryk. Endelig de inducerbare systemer giver mulighed for reproducerbare ekspression af transgenet i alle celler, mens der i denne retroviral protokol der er kimære ekspression af transgenet. Som diskuteret ovenfor om dette kimære udtryk kan være værdifuld for nogle anvendelser. De inducerbare systemer klart give enmasse fordele. Men på grund af den lethed og faldt bekostning af den her beskrevne teknik, vil mange forskere finder det nyttigt for deres studier af embryonal stamcelle-differentiation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
References
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Tian, X., Kaufman, D. S. Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls. Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
- Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336, 348-352 (1988).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323, 445-448 (1986).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors. Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment. Blood. 117, 6489-6497 (2011).
- Zafonte, B. T., et al. Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window. Blood. 109, 516-523 (2007).
- Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell. 109, 29-37 (2002).
- Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).
- Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. Mesodermal patterning activity of SCL. Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).
- Kyba, M., et al. Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).
- Cao, M., et al. MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells. Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).
- Chan, M. C., et al. Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression. EMBO J. 29, 559-573 (2010).
- Huang, S., et al. Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer. 123, (2008).
- Min, S., et al. TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7. Genes Immun. 13, 621-631 (2012).
- Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo. Blood. 101, 508-516 (2003).
- Mitjavila-Garcia, M. T., et al. Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells. Development. 129, 2003-2013 (2002).
- Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews. Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).
- Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development. Embo J. 21, 2220-2230 (2002).
- Dahl, R., et al. Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor. Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).
