Protocol
1。胚様体（EB）の形成
- マウス胚線維芽細胞（MEFを）上で維持されているのESCをゼラチン適応させる。通路のESCのMEFを除去するために0.1％ゼラチンでコーティングした6ウェル組織培養プレートに3回。
- （ 表1）未分化の細胞を維持するためにLIFとESCの維持培地中で細胞を成長させる。細胞が80％コンフルエンスを超えないことを確認してください。低継代細胞（MEFから除去した後、10以下の継代）細胞分化のために使用します。
- ESCははEB分化培養する前日に、継代細胞がので、彼らは約50〜70％コンフルエント翌日になります。細胞の多能性を保持するためにESCの維持培地中で細胞を培養し続ける。
- 6ウェルプレートのウェルあたり：分化、吸引ESCの維持培地との日に1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（137mMのNaCl、2.7mMのKCl、11.9 mMリン酸緩衝液、pH7.4 PBS）で洗浄した。
- 0.25％tryps200μlのを追加します。EDTA /中各ウェルに加え、3分間37℃でインキュベートする。
- 分化培地を800μlのトリプシン/ EDTAを不活性化する。ブレークアップするための細胞を単一細胞懸濁液にP200チップで2ミリリットル中に上下にピペットで血清学的ピペット。メディアはピペット先端インターフェイス間で上がらないようにP200チップは端にぴったりとフィットしていることを確認してください。
- 上下にピペットで約5〜10倍。ピペッティング時に泡を作成しないように注意してください。
- を15mlコニカルチューブに細胞を移す。 PBSで10ミリリットルにボリュームを起動します。室温で5分間、315×gで遠心分離する。
- 上清を取り除きます。 LIFを含む残りのメディアを削除するには5ミリリットルPBSで2回洗浄する。各洗浄のためのステップ1.4のように遠心分離する。
- 分化培地（ 表2）2ml中の最終細胞ペレットを再懸濁。
- 血球計または細胞カウンターで細胞を計数10cmのペトリ皿中6,000-10,000細胞/ mlをプレート（非組織培養処理）。
- 各ESC株について経験的に正確な細胞/ mlを決定します。通常、細菌仕事や低付着プレートに使用する無菌のペトリ皿を使用してください。
注：最良の分化の結果を得るには、EBをプレートに付着することなく、懸濁液中に残っている球体を形成すべきである。少なくともアドヒアランスを持つものを見つけるために、プレートのいくつかのブランドをテストします。 - 5％CO 2、37℃の組織培養インキュベーター中で分化するのESCをインキュベートする。
- 各ESC株について経験的に正確な細胞/ mlを決定します。通常、細菌仕事や低付着プレートに使用する無菌のペトリ皿を使用してください。
| 試薬 | ストック | 最終濃度 | ボリューム | 会社 | カタログ番号 |
| のDMEM | 1倍 | 410ミリリットル | S igma /アルドリッチ | D5796 | |
| FBS（ES選抜し） | 100％ | 15％ | 75ミリリットル | ハイクローン | SH30070.03E |
| 非必須アミノ酸 | 100X | 1倍 | 5ミリリットル | ライフテクノロジーズ | 11140 |
| L-グルタミン | 100X | 1倍 | 5ミリリットル | ライフテクノロジーズ | 35050 |
| Penncillin /ストレプトマイシン | 100X | 1倍 | 5ミリリットル | ライフテクノロジーズ | 15070 |
| βメルカプトエタノール | 14.3 M | 114μM | 4μlの | シグマ/アルドリッチ | M3148 |
| 白血病抑制因子（LIF） | 10 7単位/ ml | 千単位/ ml | 50μlの | ミリポア | ESG1107 |
| 試薬 | ストック | 最終濃度 | ボリューム | 会社 | カタログ番号 |
| のDMEM | 1倍 | 410ミリリットル | シグマ/アルドリッチ | D5796 | |
| FBS（ユーザーは、最適な分化についてスクリーニング） | 100％ | 15％ | 75ミリリットル | ハイクローン | SH30070.03E |
| 非必須アミノ酸 | 100X | 1倍 | 5ミリリットル | ライフテクノロジーズ | 11140 |
| L-グルタミン | 100X | 1倍 | 5ミリリットル | ライフ【分析シナジー | 35050 |
| Penncillin /ストレプトマイシン | 100X | 1倍 | 5ミリリットル | ライフテクノロジーズ | 15070 |
| βメルカプトエタノール | 14.3 M | 114μM | 4μlの | シグマ/アルドリッチ | M3148 |
表2：分化培地。
ウイルス感染のための2の準備EB細胞
- （2日目と3日目の間）、開発の目的の段階では、15ミリリットルコニカルチューブに10センチメートルペトリ皿からのEBを転送します。 5ミリリットルのPBSでプレートを洗浄し、円錐管に洗浄を追加します。
- 5分間室温で315×gでのEBをペレット。 5ミリリットルのPBSでEB細胞を洗浄。
- （タンパク質分解およびコラーゲン分解酵素を含む）解凍した細胞剥離溶液1mlを加え、37℃の水浴（またはインキュベーター）内チューブを配置OCCで30分間（フリックまたは軽ボルテックスから）asionalに攪拌。
- 分化培地の1ミリリットルを追加します。ピペットで上下にP200ピペットチップで2ミリリットルをピペットで。 30〜60分間、再び37℃の水浴中にチューブを置きます。
- 5分間315×gで細胞をスピンダウンし、PBSで細胞を洗浄。
3。ウイルス感染
- 分化培地1.5 mlの細胞を再懸濁。 6ウェル非組織培養処理プレートに細胞懸濁液を移す。
- 事前に標準的な技術によって、レトロウイルスを準備します。ウイルス力価に応じて、細胞へのウイルス上清の5から100を添加する。これはEBのその後の改革を阻害するとして、感染を強化するためにポリブレンを追加しないでください。
- 室温で90分間、2,120×gで遠心分離することによってウイルスで細胞をSpinoculate。
4ハンギングドロップでウイルス感染のEB細胞を分化
- 私の各ウェルに分化培地2 mlを加えnfected EB細胞懸濁液。
- ピペットでmultipipettorsための滅菌試薬槽への感染のEB細胞懸濁液3.5ミリリットル。 820μlの15〜20行をピペットするためにマルチピペッターを使用して、15センチメートルペトリ皿の反転蓋の上にドロップします。
- ペトリ皿の下半分に、滅菌PBSまたは水10mlを追加します。その後、ペトリ皿の上に落下し、市町村と蓋を反転。滴が、チャンバの加湿を保つために逆さまにPBSで蓋または下記の水からぶら下がっていることを確認します。
- 5.0％CO 2、37℃の組織培養インキュベーターに皿を置き。
- 2日後、吊り内に形成されたEBは、分化培地中の4.5 mlの蓋と洗浄を反転させることにより低下集める。
- 新しい10センチメートル非組織培養ペトリ皿へ伝達媒体とのEB。分化培地と10cmプレートへの転送3ミリリットルでもう一度蓋を洗ってください。
- 8の合計の後にフローサイトメトリーによる分析のために細胞を回収する日間の培養は、分化培地（-LIF）への細胞の初期転送から開始する。
フローサイトメーター分析のための5。の準備細胞
- 10ミリリットルピペットで15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す。 5ミリリットルのPBSでプレートを洗浄し、同じ円錐チューブに移す。
- 315×gで細胞をペレット化。 10ミリリットルのPBSでペレットを洗浄する。
- 解凍した細胞剥離溶液1mlを加え、時折撹拌しながら30分間37℃の水浴中にチューブを置き。いくつかの細胞表面抗原の検出のために、トリプシンを用いてもよい。
- 1ミリリットル分化培地を追加し、ピペッティングし、2mlピペットでダウン。助けるためにピペットの先端にP200チップを使用ブレークアップ単一細胞懸濁液にEBを消化した。
- 内在性膜タンパク質は、細胞表面にリサイクルするために60分間再び37℃の水浴中に管を置き。
- 5分間315×gで細胞をペレット化。
- 細胞w iを洗う第0.1％ウシ血清アルブミンフラクションV（BSA）をPBS（PBS / BSA）中で調製し、特異的な蛍光タグ化抗体で細胞をインキュベートする。
造血前駆細胞のための6。フローサイトメトリー分析
- 5ミリリットル12×75ミリメートルの丸底チューブ中の10 6のEB由来細胞を配置します。補償の設定フローサイトメーターを調整するために、製造者の指示に従って補償ビーズを使用しています。
- 315×gで細胞をペレット化。チューブ内の残留PBS / BSA溶液中で上清と再懸濁ペレットをオフに注ぐ。
- ESCのHPCを検出するために、蛍光標識抗体で細胞をインキュベートする：抗マウスCD41-PE（R-フィコエリトリン）および抗マウスCD117（cKitの）-APC / CY7（アロフィコシアニン7）。
- PBS / BSA中100：抗体1に希釈する。各サンプルに希釈した抗体を100μlを加える。各ベンダー、クローン、ロット又は抗体に対する抗体の正確な希釈を決定します。個別の細胞を標識するための最適な希釈を決定します。
- 暗所で30分間氷上でサンプルをインキュベートする。
- 5分間315×gで2ミリリットルのPBS / BSAおよびペレットの細胞を追加します。
- 300のPBSμlあるいは他の等張緩衝液中に吸引し上清とペレットを再懸濁し。
- 大きな細胞凝集体を除去するためにセルストレーナーキャップ（0.35μM）を介して再懸濁した細胞をフィルタリングします。
- フローサイトメーターで細胞を分析します。
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Representative Results
これらの研究ではESCを使用した（129X1 / SVJマウス系統由来）RW4を糊化。 EBを分化の3日後に単離した。最良の結果を得るにはEBを球状と非接着性（ 図1A、B）である必要があります。ウイルスは、目的の遺伝子と一緒に蛍光マーカーGFPを共発現したピノキュレーションした後、EBをハンギングドロップ法により改質された。 EBを成功裏に2.0、2.5、および3.0日EBから調製した細胞懸濁液から改革された。しかし、EBは、一日4.0 EBから調製した細胞懸濁液から改革することができませんでした。感染および非感染細胞との間のEBのキメラ化は、分化の8日目（ 図2A、B）の蛍光顕微鏡で観察した。 EBの密度は、多くの場合、EBを100％のGFP陽性のように見せます。しかし、異なる焦点面上に焦点合わせたEB（ 図2B）にGFP陽性および陰性細胞の寄与を明らかにすることができる。
フォーHPC開発のr個の分析は、キメラのEBは、分化の8日後に単細胞懸濁液に解離した。 mirn23aクラスターの miRNAの活性（群）拮抗（のmiR-23aは、24-2、および-27）、血液前駆細胞（投稿準備中）に分化するESCのできないことになる。 mirn23aクラスターの過剰発現は逆の効果を持つかどうかを判断するには、ESCを分化の開始時に感染させた。しかし、これは減少したのHPCの生成をもたらす。 mirn23aクラスタが18-21シグナル伝達、TGFβ/ BMP / Smadのに関与する可能性があるので、BMP4活性化酸化Smad1タンパク質12,13と同様のEBの発達の異なる段階で発現された場合、クラスターは明確な効果を有し得る。このプロトコルを使用して、EB単一細胞懸濁液は、分化の3日後に感染させた。 EBは、CD41とCD117細胞表面expressioを測定することにより、ドロップを掛けて改革し、続いて、HPC生成のための8日目に分析したフローサイトメトリーによりn。 CD41 + CD117 +細胞が唯一の決定的なのHPC 22,23が含まれているのに対し、CD41 +単陽性細胞は、原始的かつ決定的なのHPCのプールです。私たちは、MSCVコントロールウイルス感染細胞（ 図3）と比較して、MSCV-mirn23a感染細胞におけるCD41 + HPCは全体の人口の大幅な増加を観察した。図はまた、改質のEBに感染した細胞の高い貢献度を達成することができることを示している。これは、対照ウイルスは、単独で蛍光タンパク質を発現するだけでなく、実験的なウイルスに細胞を感染させるの両方でのEBを感染させることが重要である。感染集団（GFP +）を、表現型の違いを比較する必要があります。感染した細胞対非感染細胞との違いを調べると、誤った結果を与える可能性があります。 GFP-（非感染）を比較し、GFP +（感染した）集団MSCVおよびMSCV-mirn23a培養（ 図3）の両方でCD41集団の差があります。この増加はあってもよいレトロウイルスに増殖性細胞を感染させる。
図1：代表的な3日目胚様体 RW4 ESCの分化培地中にESCの維持培地に切り替えると10cmプレートで培養した（A）4Xおよび（B）10X画像は、培養の3日後に開発された胚様体を示している。 10Xイメージにバーは400μmで表すのに対し、4倍画像ではバーは、1000μmのを表しています。
図2：レトロウイルス感染3日目のEB細胞から改革八日の胚様体（EB）。同じEBがDIFで撮影されている（A）左側の画像は右に明視野（B）蛍光画像の3つの蛍光列である焦点面をferent。 10X画像にバーが400ミクロンを表すのに対し、4倍の画像ではバーは、1000μmのを表しています。
図3：キメラのEBで産造血前駆細胞のフローサイトメトリー分析単一細胞懸濁液をd3としたEBから調製し、示されたレトロウイルスを感染させた。 EBは、ドロップ絞首刑改革し、さらに8日間培養した。単一細胞懸濁液が生成され、CD41、およびCD117に対する蛍光標識抗体と共にインキュベートした。左手ヒストグラムプロットは、GFP-（非感染細胞）およびGFP +（感染細胞）のゲートを示している。右側のパネルは、GFP-およびGFP +ゲート内のCD41、およびCD117の発現について陽性細胞の色ドットプロットを示している。原始造血前駆細胞は、CD41 +画分に見出され、そして決定的な前駆細胞は、CD41 + CDの両方に存在している117-、およびCD41 + CD117 +画分。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
上述したように、誘導的に目的とする遺伝子を発現ESCクローンはドキシサイクリンシステムを使用して生成することができるが、これらの株の生成は、時間がかかり、労働集約的である。このプロトコールに記載されたEB由来ESCから調製単一細胞懸濁液中の目的の遺伝子を発現する方法である。これらの感染した細胞は、その後の分化を調べるために、ドロップを掛けてEBをに改質されている。実施例（ 図3）においては、分化の3日目に発現した場合mirn23aクラスターの発現は、造血発生を増強することが示されている。この時点で、初期の胚葉組織の発生は、血液前駆細胞を生じさせる初期中胚葉を含むが発生した。 2日目およびRW4 ESCの分化の3胚葉（Pax6の）を表す遺伝子の発現は、内胚葉（のFoxA2）、および中胚葉（T、ねじれ、およびTbx6）は、定量的逆転写酵素PCR（Q-RT-PCRによって検出され、データはない示されている）。 マイルのためにrn23aはHPC産生を増強するためには、初期中胚葉で発現される必要がある。この技術は、導入遺伝子が新規試薬を生成するために多くの労力を費やすことなく、一時的な発現の際に異なる効果を有するかどうかを決定する能力を可能にする。明確な時間的発現に関連した表現型を観察すると、研究者は現在、導入遺伝子の発現を厳密に制御することができ、誘導系を生成するための努力を費やすことをお勧めします。
この技術のための他の用途には、目的の遺伝子の両方の対立遺伝子（ダブルノックアウトESCは、DKOs）を削除されているのESCでレスキュー実験を実行することを含む。野生型遺伝子または削除された遺伝子の変異したバージョンでは、分化したEB細胞に再導入することができた。また削除された遺伝子の下流遺伝子による表現型の救済を検定することができます。この方法は、観察された表現型の細胞固有の性質を調べるために使用できる。 hematopoにおける例えばiesisは、欠陥が幹細胞および前駆細胞16,24の開発を支援するために必要とされる微小環境中の細胞に影響を与える可能性があり、造血幹細胞および前駆細胞自体または時には欠陥のいずれかに影響を与える遺伝子で観察されている。欠陥が造血前駆細胞に固有のものである場合は、このシステムでは、、その後、野生型遺伝子の再導入は、GFP +（レトロウイルス感染）細胞における造血発生を救出します。欠陥が非細胞自律的であった場合には、レトロウイルス感染は、GFP +およびGFP-集団の両方で観察され造血発生の救助をもたらすであろう。
このプロトコルでは、フローサイトメトリーは、CD41およびCD117の細胞表面発現によって造血前駆細胞を同定するために使用される。分化の8日にGFPを感染した後、あるいは、+細胞は、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）により単離することができる。単離された細胞は次に種の存在についてアッセイすることができる私たちは以前に25,26を記載しているようにメチルセルロース培地中の造血コロニーアッセイによるecific造血前駆細胞。同様に、RNAは、ソートされた細胞から抽出し、系統特異的遺伝子の発現について分析することができる。
記載された技術の利点は、必要な試薬を生成するために、最小限の労力を必要とすることで、現像EBにおける導入遺伝子の時間的発現を可能にする。蛍光タンパク質と目的の遺伝子を共発現するウイルスベクターはすでに利用可能である場合、実験は、直ちに行うことができる。このプロトコルを使用することを選択したことにより、考慮すべきいくつかの制限があります。ここで説明する技法は、分析のための十分な数の細胞を有するように高力価レトロウイルスを産生する能力を必要とする。また、レトロウイルスの使用は、表現型をもたらし得る挿入突然変異誘発をもたらすことができることに注意してください。しかし、このプロトコルは、のではなく、感染した細胞のプールを検討しているので、クローン集団は、それが挿入突然変異に起因する表現型は、培養の短時間にわたって観察されるという可能性は低い。 （例えば、tetオペレーターシステムにおけるような誘導性システムに比べて）技術の主要な制限は、導入遺伝子の発現は、後の時点でサイレンシングすることができないことであり、発現のレベルを制御する能力は存在しない。それは一時的な様式で遺伝子をオンにすることができるだけでなく、しかし、後の時点で遺伝子をオフにすることを可能にするので、ドキシサイクリン調節の制御下で導入遺伝子を発現ESCは有利である。ドキシサイクリンなどの誘導物質の量を変化させることも微調整式にユーザーができるようになります。このレトロプロトコルで導入遺伝子のキメラ式があるのに対し、最後に誘導系は、全ての細胞において導入遺伝子の再現可能な発現を可能にする。しかし上述したように、このキメラの発現は、いくつかの用途のための価値あるかもしれない。誘導系は明らかに提供しています多くの利点。しかし、使いやすさのために、ここに記載された技術の費用を減少し、多くの研究者は、胚性幹細胞分化の勉学のためにそれが役に立つでしょう。
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Disclosures
著者らは、開示することなく、競合する金融利害関係はありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
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