Protocol
1 배아 바디 (EB) 형성
- 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에 유지 된 ESCS을 젤라틴 - 적응. 통로 ESCS MEFs을 제거하기 위해 0.1 % 젤라틴으로 코팅 여섯 잘 조직 배양 접시에 세 번.
- (표 1) 미분화 세포를 유지하기 위해 함께 LIF ESC 유지 매체를 세포 성장. 확인 세포가 결코 80 %의 합류를 초과하지합니다. 분화 세포 (MEFs에서 제거한 후 10 이하 통로) 낮은 통로를 사용합니다.
- ESCS는 EB의 분화 배양되기 전에 날, 통로 세포는 그래서 그들은 약 50-70% 합류 다음 날이 될 것입니다. 세포의 다 능성을 유지하는 ESC 유지 배지에서 세포 배양을 계속한다.
- 6 웰 플레이트 잘 당 : 분화, 흡인 ESC 유지 보수 매체와의 일에 1 ㎖의 인산염 완충 생리 식염수 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 11.9 mM의 인산염 완충액 pH 7.4의 PBS)으로 씻는다.
- 0.25 %의 tryps의 200 μl를 추가/ 각 EDTA 잘에서 3 분 동안 37 ° C에서 배양한다.
- 차별화 매체의 800 μL와 트립신 / EDTA를 비활성화합니다. 피펫 위아래 P200 팁 2 ㎖의 혈청 학적 피펫에서 휴식 - 최대 세포를 단일 세포 현탁액으로. 미디어 피펫 팁 인터페이스 사이에 이동되지 않도록 P200 팁 끝에 딱 맞는 있는지 확인합니다.
- 피펫은 위아래로 약 5 ~ 10 배. 피펫 팅하는 동안 거품을 만들 않도록주의하십시오.
- 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. PBS 10 ML에 볼륨을 가져와. 실온에서 5 분 동안 315 XG에 원심 분리기.
- 상층 액을 제거합니다. LIF를 포함 남은 용지를 제거하는 5 ㎖의 PBS로 두 번 세척 할 것. 각 세척 단계와 1.4에서와 같이 원심 분리기.
- 분화 매체 (표 2) 2 ㎖의 최종 세포 펠렛을 재현 탁.
- 혈구 또는 셀 카운터 세포를 세어 10cm 페트리 접시에 6,000-10,000 세포 / ml를 판(비 조직 배양 치료).
- 각 ESC 라인에 대한 경험적으로 정확한 세포 / ml를 결정합니다. 일반적으로 세균 작업 또는 낮은 부착 판에 사용되는 멸균 페트리 접시를 사용합니다.
주 : 최상의 차별화 결과, 사채가 판에 연결하지 않고도 정지에 남아있는 구체를 형성해야한다. 최소한의 준수와 사람을 찾기 위해 판의 여러 브랜드를 테스트합니다. - 5 % CO 2와 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 차별화 ESCS을 품어.
- 각 ESC 라인에 대한 경험적으로 정확한 세포 / ml를 결정합니다. 일반적으로 세균 작업 또는 낮은 부착 판에 사용되는 멸균 페트리 접시를 사용합니다.
| 시약 | 주식 | 최종 농도 | 볼륨 | 회사 | 카탈로그 번호 |
| DMEM | 1 배 | 410 ml의 | S IGMA / 알드리치 | D5796 | |
| FBS (ES 선별) | 백퍼센트 | 15 % | 75 ML | Hyclone | SH30070.03E |
| 비 필수 아미노산 | 100 배 | 1 배 | 5 ML | Life 기술 | 11140 |
| L-글루타민 | 100 배 | 1 배 | 5 ML | Life 기술 | 35050 |
| Penncillin / 스트렙토 마이신 | 100 배 | 1 배 | 5 ML | Life 기술 | 15070 |
| β-머 캅토 에탄올 | 14.3 M | 114 μM | 4 μL | 시그마 / 알드리치 | M3148 |
| 백혈병 억제 인자 (LIF) | 10 7 단위 / ㎖ | 1,000 개 / ㎖ | 50 μL | 밀리 포아 | ESG1107 |
| 시약 | 주식 | 최종 농도 | 볼륨 | 회사 | 카탈로그 번호 |
| DMEM | 1 배 | 410 ml의 | 시그마 / 알드리치 | D5796 | |
| FBS (사용자가 최적의 차별화에 대한 검사) | 백퍼센트 | 15 % | 75 ML | Hyclone | SH30070.03E |
| 비 필수 아미노산 | 100 배 | 1 배 | 5 ML | Life 기술 | 11140 |
| L-글루타민 | 100 배 | 1 배 | 5 ML | 생활 TECHNOLOGIES | 35050 |
| Penncillin / 스트렙토 마이신 | 100 배 | 1 배 | 5 ML | Life 기술 | 15070 |
| β-머 캅토 에탄올 | 14.3 M | 114 μM | 4 μL | 시그마 / 알드리치 | M3148 |
표 2 : 차별화 미디어.
바이러스 감염에 대한 2 준비 EB 세포
- 개발의 원하는 단계에서 (일 2 일 3 사이), 15 ML 원뿔 관에 10cm 페트리 접시에서 교환 사채를 전송합니다. 5 ㎖의 PBS로 접시를 씻고 원뿔 튜브에 세척을 추가합니다.
- 5 분 동안 실온에서 315 XG에 사채 펠렛. 5 ㎖의 PBS와 EB 세포를 씻으십시오.
- 해동 세포 분리 솔루션 (포함하는 단백질 분해 및 collagenolytic 효소) 1 ㎖를 추가하고 OCC 30 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 튜브 (또는 창업)을 배치(플릭 또는 빛 소용돌이로 교반부터) asional 교반.
- 차별화 미디어의 한 ML을 추가합니다. 상하 피펫 P200 피펫 팁 2ml를 피펫으로. 30 ~ 60 분 동안 다시 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 놓습니다.
- 5 분 동안 315 XG에서 세포를 스핀 다운 및 PBS로 세포를 씻어.
3 바이러스 감염
- 분화 매체의 1.5 ml의 세포를 재현 탁. 6 잘 아닌 조직 문화 처리 플레이트에 세포 현탁액을 전송합니다.
- 미리의 표준 기술에 의해 레트로 바이러스를 준비합니다. 바이러스 역가에 따라 세포에 바이러스 뜨는 5-100 μl를 추가합니다. 이 사채의 후속 개혁을 억제로 감염을 향상시키기 위해 폴리 브렌를 추가하지 마십시오.
- 실온에서 90 분 동안 2,120 XG에서 원심 분리하여 바이러스와 세포를 Spinoculate.
4 매달려 방울에 바이러스 성 감염 EB 세포 차별화
- 난의 각 웰에 차별화 미디어의 두 ML을 추가nfected EB 세포 현탁액.
- 피펫 multipipettors에 대한 멸균 시약 저수지에 감염된 EB 세포 현탁액의 3.5 ML. 팔 20 μL의 15 ~ 20 행 15cm 페트리 접시의 반전 뚜껑에 방울을 피펫하는 multipipettor를 사용합니다.
- 페트리 접시의 아래쪽에 멸균 PBS 또는 물 10ml를 추가합니다. 그런 다음 페트리 접시에 방울과 장소 뚜껑을 반전. 방울 챔버 가습 유지하기 위해 거꾸로 PBS 이하 물 뚜껑 매달려되어 있는지 확인합니다.
- 5.0 %의 CO 2와 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
- 이일 후, 차별화 미디어의 4.5 ml의 뚜껑을 세척 반전에 의해 삭제 교수형에 형성 사채를 수집합니다.
- 새 10cm가 아닌 조직 배양 페트리 접시로 전송 미디어 및 사채. 차별화 미디어와 10cm 플레이트로 전송의 3 ㎖로 한 번 뚜껑을 세척 할 것.
- 세포 계측법 (8)의 총 후 흐름에 의한 분석을위한 수확 세포차별화 미디어 (-LIF)에 대한 세포의 초기 전송부터 일 문화.
흐름 사이토 분석을위한 5 준비 셀
- 10 ml의 피펫과 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. 5 ㎖의 PBS로 접시를 씻고 같은 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 315 X g에서 펠렛 세포. 10 ml의 PBS와 펠렛을 씻으십시오.
- 해동 세포 분리 용액 1 ㎖를 추가하고 가끔 교반과 함께 30 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 배치합니다. 일부 세포 표면 항원의 검출을 위해, 트립신이 대신 사용될 수있다.
- 1 ml의 차별화 미디어를 추가하고 최대 피펫 및 2 ml의 피펫과 함께 아래로. 도와 피펫의 끝 P200 팁을 사용하여 해체 단일 세포 현탁액으로 EB 소화.
- 세포막 단백질을 세포 표면에 재활용하기 위해서는 60 분 동안 다시 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 놓습니다.
- 5 분 동안 315 XG에서 세포 펠렛.
- 세포 위스콘신 씻으일 0.1 % 소 혈청 알부민 분수 PBS (PBS / BSA)에서 제조 한 V (BSA)와 특정과 세포를 배양는 형광 항체를 태그.
조혈 전구 세포에 대한 6 유동 세포 계측법 분석
- 5 ㎖의 12 × 75 라운드 MM 하단 튜브에 열 여섯 EB 파생 된 세포를 놓습니다. 보상 설정 사이토 흐름을 조절하기위한, 제조사의 지시에 따라 보상 비드를 사용한다.
- 315 X g에서 펠렛 세포. 튜브 잔류 PBS / BSA 용액에 뜨는에 resuspend 펠렛을 붓고.
- ESC의 HPC를 검출, 형광 표지 된 항체와 세포를 배양 : 항 - 마우스 CD41-PE (R-Phycoerytherin) 및 항 - 마우스 CD117 (cKit) -APC / CY7 (알로 피코시 아닌 7).
- 항체 1을 희석 : PBS / BSA 100을. 각 샘플에 희석 항체의 100 μl를 추가합니다. 각 공급 업체, 복제, 로트 또는 항체에 대한 항체의 정확한 희석을 결정합니다. 개별적으로 세포를 라벨에 대한 최적의 희석을 결정합니다.
- 30 분 동안 어둠 속에서 얼음에 샘플을 품어.
- 5 분 동안 315 XG에 2 ㎖의 PBS / BSA 및 펠릿 세포를 추가합니다.
- 기음 상층 액 300 ㎕의 PBS 또는 다른 등장 버퍼에 resuspend 펠렛.
- 셀 스트레이너 캡 (0.35 μM)를 통해 필터 재현 탁 세포 대 세포 집합체를 제거합니다.
- 플로우 사이토에 세포를 분석 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RW4을 젤라틴이 연구에서 사용 된 ESCS (129X1 / SVJ 마우스 변형에서 파생). 교환 사채는 차별화 삼일에 고립되었다. 최상의 결과를 위해 사채는 구형 및 비 부착 (그림 1A, B)해야한다. 바이러스가 관심의 유전자와 함께 형광 마커 GFP를 공동으로 표현하는 spinoculation 후, 교환 사채는 매달려 드롭 방식으로 개혁되었다. 사채 성공적 2.0, 2.5, 및 3.0 일 사채로부터 제조 세포 현탁액으로부터 개질 하였다. 그러나 사채는 일 4.0 사채로부터 제조 된 세포 현탁액에서 개혁 할 수 없습니다. 감염과 감염되지 않은 세포 사이 사채의 키메라 비율은 분화의 8 일 (도 2A, B)로 형광 현미경으로 관찰 하였다. 사채의 밀도는 종종 사채 100 % GFP 양성으로 나타날 수있다. 그러나, 다른 초점면에 포커싱하면 사채 (도 2B)로 GFP 양성 및 음성 세포의 기여를 밝힐 수있다.
FOHPC 개발 R 분석은 키메라 사채 분화는 8 일 후 단일 세포 현탁액으로 분해 하였다. mirn23a의 miRNA 클러스터 (들)의 활성을 길항 (미르-23A, 24-2, 및 -27) ESCS의 무능력의 결과 (제조에 원고) 혈액 전구 세포로 분화 할. mirn23a 클러스터의 과발현은 반대의 효과가 있는지 확인하려면, ESCS는 차별화의 시작에 감염되었다. 그러나이 HPC의 감소의 발생을 초래. mirn23a 클러스터가 18 ~ 21 신호 TGFß / BMP / TGF 계통에 관여 할 수 있기 때문에 BMP4 활성화 Smad1 단백질 12, 13과 유사한 EB 개발의 여러 단계에서 표현 될 때, 클러스터는 별개의 효과를 가질 수있다. 이 프로토콜을 이용하여, EB 단일 세포 현탁액은 분화 후 3 일 후 감염된. 교환 사채는 CD41와 CD117 세포 표면 expressio 시금에 의해 드롭을 걸어서 개혁, 이후 HPC 생성을위한 일 8에서 분석 하였다유동 세포 계측법에 의해 명. CD41 + CD117 + 세포는 최종의 HPC (22, 23)를 포함하는 반면 CD41 + 단일 양성 세포는 원시적이고 결정적인 HPC의 풀입니다. 우리 MSCV 제어 바이러스 감염된 세포 (도 3)에 비해 mirn23a MSCV-감염된 세포에서 CD41 +의 HPC의 전체 인구의 상당한 증가를 관찰 하였다. 도면은 또한 개질 사채에 감염된 세포의 높은 기여를 달성 할 수 있음을 보여준다. 이는 제어 바이러스 모두 단독으로 형광 단백질을 발현뿐만 아니라 실험 세포 바이러스 감염과 감염 사채하는 것이 중요하다. 감염된 인구 (GFP의 +는) 다음 표현형의 차이를 비교해야합니다. 감염된 세포에 비해 감염되지 않은 세포 사이의 차이점 조사는 잘못된 결과를 제공 할 수 있습니다. (감염되지 않은) GFP- 및 GFP +을 (감염) 비교하는 것은 MSCV 및 MSCV-mirn23a 문화 (그림 3) 모두에서 CD41 인구의 차이가 인구. 이러한 증가가 원인 일 수 있습니다레트로 바이러스 증식 세포를 감염.
그림 1 : 대표 3 일 배아 기관 RW4 ESCS 차별화 매체에 ESC 유지 보수 매체로 전환하고 10cm 접시에서 배양 하였다 (A) 4X와 (B) 10X 이미지가 문화의 삼일 후에 개발 된 배아 체의 표시됩니다... 10X 이미지에 줄이 400 μm의를 나타내는 반면, 4X 이미지에서 바는, 1000 μm의를 나타냅니다.
그림 2 : 레트로 바이러스에 감염된 일 3 EB 세포에서 개혁 여덟 일 배아 바디 (EB). (A) 좌측 이미지는 밝은 필드이다. (B) 우측의 형광 화상의 세 형광 열 DIF에서 찍은 동일하다 EB초점 평면을 ferent. 10X 이미지에 줄이 400 μm의를 나타내는 반면, 4X 이미지에서 바는, 1000 μm의를 나타냅니다.
그림 3 :. 키메라 EBS의 생산 조혈 전구 세포의 유동 세포 계측법 분석 단일 세포 현탁액은 표시된 레트로 바이러스와 교환 사채 (D3)에서 제조하고, 감염되었다. 교환 사채는 드롭을 교수형 개혁 및 추가 팔일을 배양 하였다. 단일 세포 현탁액을 생성하여 CD41 및 CD117에 형광 표지 된 항체와 함께 배양 하였다. 왼쪽 손 히스토그램 플롯 GFP- (감염되지 않은 세포)와 GFP + (감염된 세포) 문을 보여줍니다. 오른쪽 패널은 CD41 양성 세포의 컬러 도트 플롯 및 CD117의 발현 GFP- 및 GFP + 게이트를 보여줍니다. 원시 조혈 전구 세포는 CD41 + 분수에서 발견되며, 최종 전구 세포는 CD41 + CD 모두에 존재117- 및 CD41 + CD117 + 분수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
상술 한 바와 같이, inducibly 관심 유전자를 발현 ESC 클론 독시사이클린 시스템을 사용하여 생성 될 수 있지만,이 라인의 생성 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 이 프로토콜에서 설명하는 교환 사채 파생 ESC로부터 제조 된 단일 세포 현탁액에 대한 관심의 유전자를 표현하는 방법이다. 이 감염된 세포는 이후의 차별화를 검사 할 수 드롭을 걸어서 사채로 개편된다. 예를 (그림 3)에서는 차별화의 일 3 발현 때 mirn23a 클러스터의 표현 조혈 개발을 향상 표시됩니다. 이 시점에서 초기 배아 층 조직의 발달은 혈액 전구 세포를 일으킨다 이른 중배엽 포함 발생했습니다. RW4 ESC 분화 (PAX6), 내배엽 (FoxA2), 중배엽 (T, 트위스트, 그리고 Tbx6가) (Q-RT-PCR, 데이터하지 정량적 역전사 효소 PCR에 의해 감지 외배엽을 나타내는 유전자의 발현 일 2 및 3에서 참조). 마일을 위해rn23a는 HPC의 생산을 향상시키기 위해, 조기 중배엽에서 발현 될 필요가있다. 이 기법은 신규 유전자가 시약을 생성하기 위해 많은 노력을 늘리지 않고 시간적 식에 따라 다양한 효과가 있는지 확인하는 기능을 허용한다. 서로 다른 시간 표현과 관련된 표현형을 관찰하면, 조사관은 이제 유전자의 발현이 엄격하게 제어 할 수 있습니다 유도 선을 생성 할 수있는 노력을 투자 할 수 있습니다.
관심있는 유전자의 두 대립 유전자 (더블 넉 아웃 ESCS, DKOs) 삭제 된 경우이 기술에 대한 다른 응용 프로그램 ESCS에 구조 실험을 수행하는 것을 포함한다. 야생형 유전자 또는 삭제 된 유전자의 돌연변이 버전은 차별화 EB 세포로 재 도입 될 수있다. 삭제 된 유전자의 하류 유전자에 의한 표현형의 추가 구조는 정량 할 수있다. 이 방법은 관측 된 표현형의 셀 고유의 성질을 조사하는데 사용될 수있다. hematopo 예를 들면iesis는 결함 줄기 세포와 전구 (16, 24)의 개발을 지원하는 데 필요한 미세 세포에 영향을 미칠 수있는 조혈 줄기 및 전구 세포 자체 또는 때때로 결함 중 하나에 영향을주는 유전자에서 관찰되었다. 결함 조혈 전구 세포에 내재 경우,이 시스템에서는, 다음 야생형 유전자의 재 도입은 GFP + (레트로 바이러스 감염) 세포에서 조혈 개발 구출 것이다. 결함이 아닌 셀 자율적 인 경우, 다음의 레트로 바이러스 감염은 GFP + 및 GFP- 인구 모두에서 관찰되는 조혈 개발 구조 될 것이다.
이 프로토콜 유동 세포 계측법에서 CD41 및 CD117의 세포 표면 발현에 의해 조혈 전구 세포를 식별하기 위해 사용된다. 차별화 팔일이 GFP 감염 후 또는 + 세포는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)에 의해 분리 될 수있다. 격리 된 세포는 다음 (SP)의 존재를 정량 할 수있다메틸 미디어 조혈 식민지 분석하여 ecific 조혈 전구 세포는 우리가 이전에 (25), (26)을 설명하는 것처럼. 마찬가지로, 정렬은 RNA 세포로부터 추출하고, 혈통 특정 유전자의 발현을 위해 분석 될 수있다.
설명 된 기술의 장점은 필요한 시약을 생성하는 최소한의 노력이 필요하며, 현상 EB에서 유전자의 일시적 발현을 허용한다는 것이다. 형광 단백질과 관심의 유전자를 공동 발현하는 바이러스 벡터가 이미 사용할 수있는 경우 실험을 즉시 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하는 선택에 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 여기에 설명 된 기술은 분석을 위해 충분한 세포 수를 갖도록 고역가 레트로 바이러스를 생산하는 능력을 요구한다. 또한 레트로 바이러스의 사용은 표현형을 얻을 수에서 삽입 돌연변이가 발생할 수 있습니다. 그러나이 프로토콜은 대신에 감염된 세포의 풀을 조사되므로클론 집단, 그것에서 삽입에 의한 돌연변이 표현형 문화의 짧은 시간에 걸쳐 관찰 될 것이라는 가능성이 적다. (예 TET 시스템에서와 같은 유도 시스템에 비해) 기술의 주요 제한은 이후 시점에서 침묵 할 수없는 유전자의 발현이며, 발현 수준을 제어 할 능력이 없다. 그것뿐만 아니라 시간적 방식으로 유전자에 선회 가능하게 할뿐만 아니라 이후의 평가시기에 유전자를 해제 가능 보낸 독시사이클린 규제의 제어하에 도입 유전자가 발현 ESCS 유리하다. 이러한 독시사이클린 같은 유도제의 양을 변화 시키면 미세하게 조정할 표현을 사용자에게 허용 할 것이다. 이 프로토콜에서 레트로 바이러스 유전자의 발현이 키메라 반면 마지막 유도 시스템은, 모든 세포에서 유전자의 재현성있는 발현을 허용. 그러나 전술 한 바와 같이,이 키메라 표현은 일부 응용 프로그램에 대한 도움이 될 수 있습니다. 유도 시스템은 명확하게 제공많은 장점. 그러나 용이성에 기인하고 여기에 설명 된 기술의 비용을 감소, 많은 연구자들은 배아 줄기 세포 분화의 자신의 연구에 유용 찾을 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 경쟁 금융 이익을 더이 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
References
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Tian, X., Kaufman, D. S. Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls. Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
- Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336, 348-352 (1988).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323, 445-448 (1986).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors. Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment. Blood. 117, 6489-6497 (2011).
- Zafonte, B. T., et al. Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window. Blood. 109, 516-523 (2007).
- Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell. 109, 29-37 (2002).
- Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).
- Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. Mesodermal patterning activity of SCL. Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).
- Kyba, M., et al. Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).
- Cao, M., et al. MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells. Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).
- Chan, M. C., et al. Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression. EMBO J. 29, 559-573 (2010).
- Huang, S., et al. Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer. 123, (2008).
- Min, S., et al. TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7. Genes Immun. 13, 621-631 (2012).
- Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo. Blood. 101, 508-516 (2003).
- Mitjavila-Garcia, M. T., et al. Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells. Development. 129, 2003-2013 (2002).
- Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews. Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).
- Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development. Embo J. 21, 2220-2230 (2002).
- Dahl, R., et al. Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor. Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).
