Protocol
Prosedyrer som involverer dyr ble utført i henhold til protokoller N ° 071140-000821-12 og 08.052.010 godkjent av Honorary kommisjonen for forsøk med dyr og direktivet Board of School of Medicine, Universidad de la Republica - Uruguay.
1. Sublingualt Administrasjon av det terapeutiske midlet
- Klargjør oppløsning inneholdende det terapeutiske middel som skal testes. Juster konsentrasjon å administrere et maksimalt volum på 10 mikroliter per mus.
MERK: For renset flagellin fra Salmonella enterica serovar Typhimurium den optimale dosen for å indusere beskyttelse i mus infisert med den første dødelig dose av S. pneumoniae serotype en E1586, forårsaker dødelighet 100% er 10 mikrogram / mus. Flagellin-løsning må være oppvarmet til 65 ° C i 5 minutter for å sikre frigjøring av monomerene. For mer informasjon om flagellin rensing se referanse 26.- Vary effektiv konsentrasjon av forskjellige immunmodulerende midler i henhold til dens molekylstørrelse, renhet, følsomhet overfor proteolyse og bruk av mukoadhesive midler. Juster optimal konsentrasjon for hver forbindelse som skal testes for å maksimere dens virkninger. Ved tidligere undersøkelser etter intranasal rute er blitt utført for en spesiell forbindelse, brukes en startdose 5 til 10 ganger høyere for å teste dets virkning ved sublingual vei.
- Anaesthetize musene ved å injisere en cocktail inneholdende 110 mg / kg ketamin med 5,5 mg / kg Xylacine og la dyrene hvile i 7 til 10 minutter.
- Bekreft riktig for anestesi ved å trykke forsiktig poten til en av bakbena; dersom den skal bedøves dyret ikke vil bevege seg i respons på stimuli.
- Spre et tynt lag av veterinær salve over øynene til hver mus for å hindre tørrhet mens under anestesi.
MERK: ved innånding bedøvelse som isofluorane kan også brukes i stedet Ketamin / Xylacine hvis et system utstyreped med induksjon kammer og nese kjegler er tilgjengelig. Bruk induksjonskammeret å bedøve dyrene og administrere immunostimulant ved sublingual rute. Umiddelbart koble dyret til et nesepartiet i minst 15 min for å holde den under anestesi for å unngå å svelge og tillate absorpsjon av den terapeutiske forbindelse. - Pipetter oppløsning inneholdende den immunostimulant eller kjøretøy kontrolløsning; ved hjelp av tommelen og pekefingeren på den ikke-dominerende hånd ta mus og holde den i vertikal stilling.
- Bruke dominerende hånd sted et par lukkede tang under tungen og holde den på plass ved hjelp av de midterste og ringfinger, åpne tang litt å løfte tungen.
- Ta pipette og administrere løsningen på gulvet av munnen og ryggsiden av tungen.
- Fjern pinsett og la musen hvile i 3 til 5 minutter før du setter den tilbake i buret. For å sikre at normothermia opprettholdes i bedøvet mice, kobler burene til et bur varmeapparat system. Dersom et slikt system ikke er tilgjengelig, place mus som tilhører samme behandlingsgruppen tilbake til det tilsvarende bur en ved siden av hverandre over sengetøy og delvis dekke dem med rene silkepapir ark for å hjelpe dem til å opprettholde kroppstemperatur.
- Samle vevsprøver som helst punkt etter instillasjon av immunmodulerende middel for å analysere endringer i cellepopulasjoner som induseres av behandlingen.
MERK: I denne spesielle protokollen administrasjon av flagellin ble utført 2 t før utfordring. Bestem optimal tid mellom behandling og utfordring for hver bestemt terapeutisk middel og patogen som skal testes.
2. Utarbeidelse av bakteriell suspensjon og intranasal Challenge med Streptococcus pneumoniae
MERK: S. pneumoniae er en naturlig menneskelig patogen som kan føre til livstruende sykdommer som invasiv lungebetennelse, sepsisog hjernehinnebetennelse. Overføring kan forekomme ved innånding eller i kontakt med slimhinne. Derfor er alle prøvene som kan ha vært i kontakt med S. pneumoniae må håndteres på en hensiktsmessig Biosikkerhet nivå II anlegget ved hjelp av en klasse II biosikkerhet skap. Sjekk Standard Operating Procedures for ditt institusjon vedrørende behandling av Type II patogener for verneklær, avfallshåndtering og ekstra sikkerhetstiltak som kan gjelde. Infiserte dyr bør holdes i individuelt ventilerte bur i isolatorer er utstyrt med HEPA filter. Anti-pneumokokk vaksiner og antibiotikabehandling er tilgjengelig. For mer informasjon se referanser 27 og en.
- Tin opp en delmengde av en arbeidslager suspensjon av Streptococcus pneumoniae av kjent bakteriell CFU antall fremstilt som beskrevet i 15.
- Sentrifuger i 5 minutter ved 2500 xg og RT.
- Kast supernatanten og vask det bakterielle pellet ved å suspendere den i 1 ml av sterile saltløsning. Bruk filter tips når du forbereder bakteriell suspensjon, fortynninger eller for dyr utfordring.
- Igjen som sentrifuge beskrevet i trinn 2.2.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i en passende mengde steril saltløsning for å oppnå en suspensjon av 5 4x10 CFU / 50 pl. Denne dose tilsvarer den minste dose av bakteriell S. pneumoniae serotype 1 E1586 som forårsaker 100% dødelighet i BALB / c-mus i henhold til tidligere studier 15.
MERK: Ved å etablere en modell av pneumokokk-pneumoni i mus, minimum bakteriell dose som forårsaker 100% dødelighet må bestemmes for hver spesielle kombinasjon av bakteriestammen, serotype og mus belastning. - Homogenisere bakteriell suspensjon ved å virvle eller pipettering opp og ned fem ganger.
- Laste 50 pl av bakteriesuspensjonen med en steril filter tip og innpode det totale volum inn i neseborene til en bedøvet mus. Hold muse uprikjempe for 2 min og la den hvile i ryggposisjon for 2 flere min. Påfør dyrlege salve på øynene og gå tilbake dyrene til buret; sørg for å opprettholde normothermia mens under anestesi.
NB: I denne studie bakteriell utfordring ble utført i et volum på 50 pl for å sikre levering av i det minste 90% av den totale CFU inn i lungene som bestemt tidligere i 15,28. For å minimalisere ubehag fra dyrets mindre volumer (f.eks, 20 ul) kan brukes. Imidlertid må effektiv levering av bakterier i lungene kontrolleres; Dette kan gjøres ved å høste lungene 5 minutter etter utfordring, og telle CFU i lungene "homogenater ved utsåing seriefortynninger på blod-agar-platene. - Bekreft CFU tallene i bakteriell suspensjon brukes for smitte ved plating serie 10-fold fortynninger bort på blodagarplater. Inkuber O / N ved 37 ° C med 5% CO 2 og telle antallet kolonier slimaktig å presentere en grønn ring karakteristisk for alpha hemolytiske bakterier.
3. vevsoppsamling og Prøvepreparering flowcytometri (FACS) Analyse
3.1) Tissue samling
- Avlive dyret ved halshugging eller ved hjelp av en CO 2 kammer; åpne brysthula hele veien opp til nakken og gjør et snitt langs forbena å avsløre ventral side av halsen og kjeveområdet.
- Med fin spiss buet pinsett forsiktig trekke opp spyttkjertlene og tilstøtende mykt vev for å eksponere den dorsale side av munnen gulvet. Ved hjelp buet tynne tuppen pinsett, ta kjeve og tilbehør underkjevens lymfeknuter ved å trekke forsiktig opp og plassere dem i et rør som inneholder komplett RPMI (cRPMI, for 500 ml- 10% Foetal Bovine Serum, 5 ml av en løsning som inneholder 10 000 U / ml Penicillin og 10 mg / ml streptomycin-løsning og 5 ml L-Glutamine 200 mM) eller nukleinsyre konserverende oppløsning i henhold til fremgangsmåten som vil nedstrømsutføres senere.
- Å åpne brysthula gjøre et snitt i mellomgulvet; ved hjelp av et par av rotte-toothed tang klemme xyphoid brusken i brystbenet og nøye kutte ribbeina på begge rygg sider med start fra falske ribbeina hele veien opp til du kommer til det punktet hvor de sanne ribbeina møtes manubrium av sternum.
- Ved å holde xyphoid brusk av sternum med pinsett, trekke opp forsiktig for å eksponere de organene i brysthulen.
- Fjern ribbeina helt ved å kutte de første ribbeina og krageben. Den thymus vil vises som et hvitt struktur av to fliker som ligger i anteroventral parti av thorax nær bunnen av hjertet.
- Ta en av de lappene ved å klemme den med en pinsett og bruke en saks for å fjerne leddbånd mellom sin underlegne ansikt og hjerteposen. Fortsett å fjerne den andre lobe.
- Identifiser bukhulen og åpne den ved å skjære langs midtaksen av muscular veggen for å eksponere de organer. Med en pinsett kutte bakre vena cava og thorakalaorta; fjerne overskudd av blod med en absorberende klut.
- For å analysere de fastboende og infiltrere cellepopulasjoner i alveolene utføre bronchoalveolar lavage (BAL). Skjær musklene i ventral del av nakken for å avdekke luftrøret og spiserøret; for å skille dem gjør innsnitt ved laterale og rygg sider av konstruksjonene.
- Løft opp luftrøret med pinsett og lage et lite snitt med en skalpell til å innføre en tynn-tip overføringspipetten fylt med 1 ml PBS uten Ca 2 + / Mg 2 + pluss 1 mM EDTA. Instil og suge totalvolum minst tre ganger; aspirer og overføre cellesuspensjonen til et sterilt 1,5 ml tube og plassere den på is.
- For å analysere de cellepopulasjoner som er tilstede i lunge parenchyma, først perfuse lungene ved å injisere 5 ml PBS uten Ca2 + / Mg 2 + plus 1 mM EDTA inn i den høyre ventrikkelav hjertet.
MERK: Dette vil eliminere de fleste av de røde blodceller og immunceller til stede i lungene 'blodkar. Hvis perfusjon ble utført riktig, vil lungene farge skifte fra rosa til hvitt. - Isoler hjertet fra lungene ved å klemme det fra bunnen av den venstre ventrikkel og delikat kuttet blodkar med saks for å fjerne den fullstendig. Ta lungene perfusert og plassere dem i cRPMI eller nukleinsyre konserverende oppløsning avhengig av genetisk analyse som skal utføres.
- For analyse av cellepopulasjoner i sublingual slimhinner, isolere hodet på dyret og fjerne spyttkjertlene og tilstøtende bløtvev hvis det ikke har blitt gjort i trinn 3.2.1.
- Gjøre et snitt på hver side av munningen til n kjeven leddet og separer den nedre kjeve sammen med tungen og gulvet i munnen, ved hjelp av pinner fastsette den på disseksjon bord. Trekk opp tungen; ved hjelp av en skalpell gjøre et snitt der base av tungen treffer gulvet i munnen til n tredje molarer å eksponere sublingual mucosa.
- Fjern tungen helt; ta en 0,5 mm biopsi punsj og plassere den ved siden av de nedre fortenner. Kuttet fra gingival innsetting av sublingual vev og trykk forsiktig til gulvet i munnen har blitt kuttet helt ut.
- Gjenta en gang til nå plassere biopsi dor nær den tredje molarer for å fullføre fjerningen av sublingual vev. Plasser på et rent rør som inneholder cRPMI eller nukleinsyre konserveringsmiddel.
3.2) Prøvepreparering for FACS analyse.
- Overfør lungenes vev isolert fra hver mus i en 24-brønns plate og hakke dem med en ren saks til å oppnå små stykker av vev på ca 2 mm. Tilsett 1 ml pr brønn av fordøyelsen medium inneholdende 30 mg av type II Collagenase, 50 mikrogram DNAse I-i 1 ml RPMI uten FBS. Pipette opp og ned fem ganger og inkuber ved37 ° C og 5% CO2 i 40 minutter.
- For analyse av cellepopulasjoner i sublingual vev, erstatte fordøyelsen medium 3.2.1 med en som inneholder to enheter av dispase, 30 mg kollagenase type II, 50 mikrogram DNAse-I i 1 ml RPMI. Inkuber vevet innsamlet fra én mus i 500 pl av fordøyelsen medium i 20 min ved 37 ° C på en orbital rystemaskin ved 50 rpm.
- Etter inkubasjon pipette opp og ned opptil 10 ganger eller 30 sek inntil mesteparten av vevet er blitt avbrutt. Filtrer cellesuspensjonen selv om en 40 um steril celle sil og vaskes med 5 ml PBS supplert med 5 mM EDTA.
MERK: fullstendig nedbrytning av den ekstracellulære matriks og bindevev vil ikke bli oppnådd. Imidlertid er lengre inkubasjonstid i nærvær av kollagenase og / eller dispase eller aggressiv trituration anbefales ikke, da det vil føre til økt celledød og ødeleggelse av ekstracellulære proteiner som påvirker samlede resultat av FACS analyse. - Sentrifuger ved 400 x g, 5 min, 4 ° C.
- For analyse av cellepopulasjoner i BAL, sentrifuger cellene ved 400 x g, 5 min, ved 4 ° C, og videre til trinn 3.2.4.
- For analyse av cellepopulasjoner i lymfeknutene, plasserer en 70 mikrometer celle sil på en steril petriskål og sette lymfeknutene sammen med 1 ml cRPMI inn silen. Ta ut skrittet fullt ut av en 2 ml steril sprøyte og bruke det som en støter til å knuse lymfeknutene mot silen sin mesh. Skyll celle sil med 1 ml friskt cRPMI og overføre cellene fra petriskålen til et sterilt rør.
- Ta en representativ delmengde av hver prøve og flekke den med Trypan blå for å bestemme levedyktig celleantall.
- Resuspender cellene i FACS-EDTA: PBS-5 mM EDTA-1% okseserum Albumin- å gjøre opp en suspensjon av 7 2x10 celler / ml og tilsett 50 pl i en cytometer rør.
- Forbered en 2X antistoff blanding som inneholder caopriate kombinasjoner av antistoffer mot overflatemarkører og fluorokromer i henhold til den tilgjengelige FACS-instrumentet. Tilsett 50 ul av 2X antistoff blanding i hvert rør inneholdende cellesuspensjonen.
MERK: Titrer hvert fluorokrom-merket antistoff for å bestemme den optimale mengde som skal anvendes, for en detaljert protokoll se referanse 29. - Inkuber i 30 min på is i mørket.
- Vask en gang med 3 ml FACS-EDTA og spinne ned cellene ved sentrifugering ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C, resuspender cellene i 200 pl av samme buffer og analysere i et flowcytometer.
MERK: Ved håndtering av et stort antall prøver, kan fargingen protokoll for FACS-analyse som er beskrevet ovenfor bli utført i U-bunn 96-brønners plater i stedet for cytometer rør. Imidlertid, ved bruk av 96-brønners plater vasketrinnene må utføres ved å tilsette opp til 200 pl FACS-EDTA og gjenta det 4 ganger spinne ned cellene ved 400 x g i 5 min ved 4 ° C mellom hver washing trinn. - På dette punktet, fikse prøvene for analyse i strømningscytometeret senere (opptil 72h etter fiksering).
- For å fikse cellene, etter merking med FACS-antistoffer vaske cellene i PBS ingen Ca 2 + / Mg 2 +, 1 mM EDTA uten FBS. Suspender cellene i 50 ul av den samme buffer og tilsett 50 ul av en ferskt fremstilt 4% paraformaldehyd i hypertonisk oppløsning (2X) PBS uten Ca 2 + / Mg 2 +.
- Inkuber i 20 min ved RT og vaskes tre ganger i FACS-EDTA.
- Resuspender cellene i 200 pl av FACS-EDTA og oppbevares ved 4 ° C og beskyttet mot lys i opp til 72 timer.
MERK: FSC-SSC kan påvirkes av fiksering. Hvis fikse prøvene sjekke kompatibiliteten fluorescensmerkede antistoffer med produsent siden tandem fargestoffer kan brytes ned i nærvær av festing agenter. Hvis prøvene stammer fra infiserte dyr fiksering er sterkt anbefalt for å sikre at ingen levedyktige patogener vil være til stede når analysynge prøvene i FACS maskin siden microaerosols kan genereres under oppkjøpet av prøven.
4. Total RNA Utvinning, cDNA Synthesis og Real Time PCR.
4.1) RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese.
- Homogenisere vevet i nukleinsyre konserverende oppløsning av valget av mekaniske forstyrrelser (for eksempel ved hjelp av en rotor-stator-homogenisator med høy hastighet risting vev-ruptor og perler, etc.). Sentrifuger ved 12600 xg i 15 min, og 4 ° C for å fjerne vev rusk. Overfør supernatanten til et rent rør.
- Ekstraher den RNA med metoden for valg etter produsentens instruksjoner.
MERK: RNA er svært utsatt for nedbrytning, hvis det ikke skal brukes straks etter isolasjon, gjør porsjoner og lagre dem i RNase gratis rør ved -80 ° C. Unngå gjentatt frysing og tining. Rørene må håndteres med hansker til alle tider. Etter opptining prøvene enlways holde dem på is. - Mål absorbansen av nukleinsyrer ved 260 nm og beregner konsentrasjonen i ug / mL.
- Forbered DNAse-jeg blander med tillegg av (for 1 prøve): 7,6 mL av ultrarent vann, 1 mL av 10X DNAse-I buffer, 0,4 mL av DNAse-I (forsterkning grade) lager en U / mL, og legge til 8,4 mL den DNAse-I blandes til hver prøve inneholdende 1 mikrogram av total RNA.
- Bruk RNA i en konsentrasjon på 1 pg / pl og utfører retrotranscription reaksjon (RT-PCR) ved å tilsette en ul av det totale RNA som en mal. Hvis prøvene er for fortynnet og konsentrasjonen er lavere enn forventet, legge større volumer av total RNA i stedet for vann. Må ikke overstige 20% av den endelige reaksjonsvolum ved tilsetning av RNA spesielt dersom RNA ekstraksjon protokoll av valget involvert fenol-kloroformblanding siden fenol spor kan påvirke utbyttet av RT-PCR.
- Inkuber i 15 min ved RT, etterfulgt av 10 min ved 4 ° C eller ice. (Ikke overskrid inkubasjonstid !!)
- Tilsett 1 pl av 25 mM EDTA (molekylærbiologi karakter) til hvert rør og inkuberes ved 65 ° C i 10 min for å inaktivere DNAse-I.
- Forbered retrotranscription (RT) blanding som følger (i 1 reaksjon): 1 pl tilfeldig heksamer primer arkiv 0,2 mg / ml, 1 pl dNTPs lager 10 mm, 4 pl 5X M-MLV-RT-buffer, 2 pl 0,1 M DTT, 1 mikroliter RNAse OUT lager 40 U / mL, og en ul M-MLV retrotranscriptase lager 200 U / mL.
- Tilsett 10 pl av RT-PCR-blanding til 10 pl DNAse-I reaksjonsrøret.
- Utføre PCR-reaksjon i en termosykler i henhold til følgende program:
1X syklus: 10 minutter, 25 ° C; 50 min, 37 ° C; 15 min, 70 ° C - Fortynn cDNA 1: 5 ved tilsetning av 80 pl av ultrarent vann. Oppbevar ved -20 ° C.
4.2) Real time PCR (qPCR).
- Forbered qPCR reaksjon mix som følger (for en reaksjon): 5 ul mester blanding som inneholder Taq DNA Polymerase, SYBR grønt fargestoff, PCR buffer, dNTP mix og MgCl2 (se 4.2.2 nedenfor); 0,9 pl av en 10 mM stamløsning av den fremre primer, 0,9 ul av en 10 mM stamløsning av revers primer, 1,2 pl ultrarent vann, og 2 mikroliter av cDNA-template tidligere fortynnet som angitt i trinn 4.1.10.
NOTE: reagenskonsentrasjonen og sykkel protokollene som benyttes i denne delen ble optimalisert for å utføres spesielt med reagenser og instrumenter som er beskrevet i "Materialer og Table of Reagents", andre merker kan anvendes, men reaksjonsvolumer, kan reagenskonsentrasjonen og sykling protokoll variere. Se produsentens instruksjoner før du utfører RT-qPCR. - Sett opp qPCR instrumentet som følger:
1X syklus: 15 minutter, 95 ° C
40X sykluser: 15 sekunder, 95 ° C etterfulgt av 1 minutt, 60 ° C (ved dette punktet skaffe fluorescens).
MERK: For relativ kvantifisering av mRNA i henhold til Ct metode 30 en referansebrenslete genet må velges for normalisering av CT verdier. Referanse gen av valget bør testes under bestemte analysebetingelser som sitt uttrykk kan variere; ACTB, GAPDH eller 18S er noen av de genene som regel valgt som referanser. - Sett opp terskelverdi og analysere dataene.
Representative Results
Sublingual immunterapi kan med hell brukes til å modulere lungene "immunrespons. Vi har vist at en enkelt dose av flagellin, den TLR5 og NLRC4 agonist, kan indusere betydelig oppregulering av mRNA som koder for det kjemokiner CXCL1, CCL20 og cytokin IL-6 sammenlignet med saltvannsbehandlede kontroller. Fold induksjon av mRNA-nivåene nådde en topp ved 8 timer etter at slit og gå tilbake til basalnivåer etter 20 timer (figur 1). Imidlertid, når slit ble utført i 2 timer før intranasal infeksjon med S. Pneumoniae, nivåer av Cxcl1 og IL6 mRNA forble signifikant oppregulert selv 24 timer etter at slit sammenlignet med ikke-behandlede dyr (figur 2).
Analyse av cellepopulasjoner i BAL og lungevev etter FACS viste at dyr behandlet med FLIC ved sublingual vei hadde økt antall neutrofiler i luftveiene, men ikke i lungenes vev (figur 3).
figur 4, slit med flagellin fremmet beskyttelse og økt overlevelse mot akutt pneumococcal lungebetennelse.
Figur 1. Kinetics i lungene 'transkripsjonelle profilen etter sublingual immunterapi med flagellin. Åtte til 10 uker gamle BALB / c mus (n = 4) ble behandlet med 10 mikrogram av flagellin eller saltvann ved sublingual rute under anestesi. Lungene ble oppsamlet ved forskjellige tidspunkter og plassert i nukleinsyre konserveringsmiddel. Total RNA ekstraksjon ble utført og cDNA ble syntetisert. mRNA nivåer ble evaluert av real time PCR ved hjelp av spesifikke primere oppført i Table 1. Relativ kvantifisering ble utført i henhold ΔCt metode med ACTB mRNA nivåer for normalisering. Resultatene er vist som dobling sammenlignet med saltvann behandlede gruppen som median ± SEM. Stjernene indikerer statistisk signifikante forskjeller (p <0,05) beregnet i henhold til Mann-Whitney-test. Resultatene er representative for to uavhengige eksperimenter.
Figur 2. Lunger 'transkripsjonelle profilen under pneumokokk-pneumoni etter sublingual immunoterapi med (n n = 4 for kontroll-gruppen og = 7 for behandlet gruppe) flagellin. Åtte til 10 uker gamle BALB / c-mus ble behandlet med 10 mikrogram av flagellin eller saltvann ved sublingual rute under anestesi. 2 timer senere mus ble utfordret av intranasal rute med minimal dødelig dose (MLD) forårsaker 100% dødelighet av et klinisk isolat av S. pneumoniae serotype 1 E1585, tilsvarende 4x10 5 CFU / 50 pl. Lungene ble samlet 24 timer etter utfordringen, og lagret i nukleinsyre konserveringsmiddel inntil RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese ble utført. Real time PCR ble utført (Se primer listen i tabell 1) og relativ kvantifisering ble utført i henhold ΔCt metode med ACTB mRNA nivåer for normalisering. Resultatene er vist som dobling sammenlignet med saltvann behandlede gruppen som median ± SEM. Stjernene indikerer statistisk signifikante forskjeller (p <0,05) beregnet i henhold til Mann-Whitney-test.
Figur 3. Analyse av polymorfonucleære nøytrofile (PMN) rekruttering i lungene 'vev og luftveier etter splitten. Åtte til10 uker gamle BALB / c mus (n = 4) ble behandlet med 10 mikrogram av flagellin eller saltvann ved sublingual rute under anestesi. 2 timer senere mus ble utfordret av intranasal rute med MLD S. pneumoniae serotype en E1585. 24 timer etter smitte, ble BAL utføres og lungene ble behandlet for FACS analyse. PMN ble identifisert som Ly6G høy / CD11b høy / CD11c negative celler og basert på FCS-SSC-profil. Resultatene er uttrykt som prosentandel av PMN med respekt av totalt celle tall i BAL eller lungene. Søylene representerer median ± SEM. Stjernene indikerer statistisk signifikante forskjeller (p <0,05) beregnet i henhold til én-veis Mann-Whitney-testen.
Figur 4. SLIT med flagellin beskytter mus mot akutt pneumokokk lungebetennelse. S. pneumoniae serotype en E1585. Overlevelse ble vurdert på en daglig basis. Kaplan-Meier kurvene ble sammenlignet i henhold Log-rank (Mantel-Cox) test. Stjernene indikerer statistisk signifikante forskjeller (p <0,05) .Results er representative for to uavhengige eksperimenter.
| Navn | Sekvensen 5'-3 ' | PCR-produktet lengde (bp) |
| Mb-actin_F | GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT | 68 |
| Mb-actin_R | CGTCATCCATGGCGAACTG | |
| mCCL20_F | TTTTGGGATGGAATTGGACAC | 69 |
| mCCL20_R | TGCAGGTGAAGCCTTCAACC | |
| mCXCL1_F | CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA | 84 |
| mCXCL1_R | ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT | |
| mIL- 6_F | GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA | 78 |
| mIL- 6_R | AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA | |
| mTNFalpha_F | CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA | 63 |
| mTNFalpha_R | CCTCCACTTGGTGGTTTGCT | |
| mCxcl2_F | CCCTCAACGGAAGAACCAAA | 72 |
| mCxcl2_R | CACATCAGGTACGATCCAGGC |
Tabell 1. Primer listen benyttet for sanntid PCR-analyse. Spesifikke primer-sekvenser som benyttes for qPCR analyse. Forover og bakover primere for mus ACTB, er Cccl20, Cxcl1, IL6, TNFa og Cxcl1 presentert som 5'-3 'sekvenser og forventet produkt lengde er angitt i basepar (bp).
Discussion
Sublingual administrering av terapeutiske midler har vist seg som et nyttig middel for å modulere immunrespons i luftveiene. Den største fordelen med åpningen for behandling av luftveislidelser, er at den ikke involverer direkte levering av forbindelsene til lungene eller nesen, å være sikrere enn behandlinger basert på intranasal administrering 31.
Sublingual immunterapi kan brukes til å modulere immunresponsen på forskjellige måter, enten for induksjon av regulerende responser som kan bedre symptomene på allergisk inflammasjon og astma 32 eller for å indusere forbigående aktivering av medfødte immunmekanismer for å behandle akutte lungeinfeksjoner, som vist her.
Den musemodell presentert i denne video er en praktisk metode for screening av forskjellige forbindelser som terapeutiske midler for slit.
Dette dyret modellen tilbyr et nyttig middel for å fastslå effektenav sporet i lungene immunrespons, så vel som i andre organer (f.eks., drenerende lymfeknuter eller distale slimhinne nettsteder) som ikke kan bli etterlignet ved bruk av in vitro modeller. Selv om det er flere artikler som beskriver resultatene som er oppnådd ved bruk av sublingual immunterapi, har detaljerte metoder for prosedyrene for sublingual administrasjon ikke blitt gjort tilgjengelig ennå. I tillegg, kan modellen benyttes for evaluering av sublingual vaksiner tar sikte på å gi systemisk og lokalt vern i luftveiene.
Som vist på den medfølgende video, er sublingual administrering av forbindelsene til en enkel operasjon som lett kan utføres uten behov for omfattende opplæring. Vanligvis vil en person dyktig i dyr håndtering krever 1 time for å utføre sporet i en gruppe på 10 mus ved hjelp av injiserbare anestetika som beskrevet i denne protokollen. Hvis pneumokokk utfordring utføres i tillegg, vil 90 ekstra min bli pålagt å utarbeideden bakterielle suspensjon og utføre intranasal utfordring av dyrene.
FACS-protokollene som er presentert her tillater praktisk å karakterisere virkningen av spalten på den lokale administreringsstedet, drenerende lymfeknuter samt deres virkninger på lungene "celle dynamikk.
Separat analyse av bronchoalveolar innhold og lunge parenchyma er viktig å diskriminere luftrom immun bosatt og infiltrerende celletyper fra de som forblir i vevet. Analyse av BAL-innhold tillater studiet av alveolære makrofager så vel som omsetning av dynamikken i cellene rekruttering i de alveolære områder indusert av forskjellige behandlinger, f.eks. PMNs,, eosinofiler, monocytter. BAL kan også brukes til å vurdere nærværet av utskilte cytokiner og kjemokiner ved Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) eller påvisning av utskilte IgA-antistoffer fremkalt etter sublingual vaksinasjon. Studier av lungene 'vevvil tillate karakterisering av andre celletyper, klassisk dendrittiske celler, T-celler og B-celler.
Utarbeidelse av BAL prøver og lymfeknuter for FACS analyse er enkel. Etter prøvetaking, er normalt 60 minutter som kreves for å fullføre farging protokoll for prøvene 10-20. I motsetning til dette vil isolering av celler fra lungene eller sublingual vev krever mer tid siden fordøyelse av den ekstracellulære matriks er nødvendig. Absorpsjon av det terapeutiske middel som leveres av sublingual rute kan løses ved sporing av fluorescently eller radioaktivt merkede molekyler ved hjelp av in vivo bildesystemer.
Sublingual immunterapi er en attraktiv metode for å effektivt indusere immunresponser i luftveiene så vel som systemisk, som kan brukes for å behandle eller forebygge respiratoriske tilstander. Klarlegging av de mekanismene som bestemmer aktivering vs toleranse av immunrespons i luftrøret etter at spalte Is avgjørende for å tillate rasjonell design av nye terapeutiske strategier som kan brukes alene eller i kombinasjon med tilgjengelige behandlinger mot ulike luftveislidelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine solution (50 mg/ml) | Pharma Service, Uruguay | ||
| Xilacine solution (2 %) | Portinco S.A., Uruguay | ||
| Sterile 1 ml syringe | Modern, Uruguay | ||
| Sterile 27 G needle | Modern, Uruguay | ||
| RPMI 1640 | General Electric Health Care | E15885 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 302020 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | SIGMA | P4333 | |
| Sterile PBS without Ca2+/Mg2+ | PAA | H21002 | |
| Type-I Collagenase | Life Technologies/Gibco | 17100017 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse-I) | SIGMA | D4513 | |
| Dispase | Life Technologies/Gibco | 17105041 | |
| PerCP-Cy5.5 conjugated rat anti mouse IgG2b anti CD11b | BD | 550993 | Clone M1/70 |
| APC conjugated hamster anti mouse IgG1 anti CD11c | BD | 550261 | Clone HL3 |
| APC-Cy7 conjugated rat anti mouse IgG2a anti Ly6G | BD | 560600 | Clone 1A8 |
| Sterile Saline Solution | Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay | ||
| Tryptic Soy Agar | BD Difco, France | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | Biokey, Uruguay | ||
| Sterile Petri Dishes | Greiner | 633180 | |
| p10 Pipette | Gilson | F144802 | |
| p20 Pipette | Eppendorf | 3120000097 | |
| p200 Pipette | Gilson | F123601 | |
| p200 Pipette | Capp | C200 | |
| p200 Pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| p1000 Pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| Sterile Filter Tips p10 | Greiner | 771288 | |
| Sterile Filter Tips p200 | Greiner | 739288 | |
| Sterile Filter Tips p1000 | Greiner | 750288 | |
| Vortex | BIOSAN | V1-plus | |
| Stainless steel fine tip forceps | SIGMA | Z168785/Z168777 | Curved and straight |
| Dressing tissue forceps | SIGMA | F4392 | Length 8 inches |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4017 | Straight |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4142 | Curved |
| Mayo Scissors | SIGMA | Z265993 | |
| Scalpel | SAKIRA MEDICAL | ||
| Sterile Biopsy Punch Ø 3mm | Stiefel Laboratories Ltd. | 2079D | 5 mm diameter can also be used |
| Sterile 1.5 ml Tubes | Deltalab | 200400P | |
| Sterile 15 ml Tubes | Greiner | 188271 | |
| Sterile 50 ml Tubes | Greiner | 227261 | |
| Sterile serological pipettes 5 ml | Greiner | 606160 | |
| Sterile serological pipettes 10 ml | Greiner | 607160 | |
| Sterile serological pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Biological safety cabinet, class II | Thermo Scientific | 1300 series, type A2 | |
| Micro-Isolator Rack | RAIR IsoSystem | 76144W | Super Mouse 1800 AllerZone |
| Refrigerated Microcentrifuge | Eppendorf | Legend Micro 21R | |
| Microcentrifuge | Heraeus | Biofuge-pico | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorval ST40R | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Sterile Thin-tip pasteur pipettes | Deltalab | D210022 | |
| Sterile pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Sterile 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | T10282 | |
| Automatic Cell Counter - Countess | Life Technologies | C10227 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Life Technologies | C10312 | |
| Flow Cytometry Tubes | BD | 343675 | |
| Flow Cytometer - FACS Canto-II | BD | ||
| Real Time PCR Instrument - Rotor Gene Q or ABI 7900 | Qiagen / Applied Biosystems | ||
| Trizol Reagent | Life Technologies | 15596-026 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I | Life Technologies | 18068-015 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I Buffer 10X | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| EDTA 25 mM | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| Ultra-Pure Water | Life Technologies | 10977 | Molecular Biology Grade |
| RNAse Out | Life Technologies | 100000840 | Molecular Biology Grade |
| Random Hexamer Primers | Life Technologies | N8080127 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT buffer | Life Technologies | 18057-018 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT enzime | Life Technologies | 28025-021 | Molecular Biology Grade |
| QuantiTect Syber Green PCR Kit | Qiagen | 204143 | Molecular Biology Grade |
| Specific primers | Life Technologies | Molecular Biology Grade |
References
- Pneumococcal vaccines WHO position paper--2012. Weekly Epidemiological Record. 14, 129-144 (2012).
- Pneumonia - Facts Sheet N°331. , WHO. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en (2013).
- Appelbaum, P. C., et al. Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-a multicenter study with use of standardized methods. Clin Infect Dis. 23, 712-717 (1996).
- Ramirez, J. A., Anzueto, A. R.
- Cuburu, N., et al. Sublingual immunization induces broad-based systemic and mucosal immune responses in mice. Vaccine. 25, 8598-8610 (2007).
- Pedersen, G. K., et al. Evaluation of the sublingual route for administration of influenza H5N1 virosomes in combination with the bacterial second messenger c-di-GMP. PLoS One. 25, 1-12 (2011).
- Song, J. H., et al. Sublingual vaccination with influenza virus protects mice against lethal viral infection. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1644-1649 (2008).
- Cogo, R., Ramponi, A., Scivoletto, G., Rippoli, R. Prophylaxis for acute exacerbations of chronic bronchitis using an antibacterial sublingual vaccine obtained through mechanical lysis: a clinical and pharmacoeconomic study. Acta Biomed. 74, 76-87 (2003).
- Rosaschino, F., Cattaneo, L. Strategies for optimizing compliance of paediatric patients for seasonal antibacterial vaccination with sublingually administered Polyvalent Mechanical Bacterial Lysates (PMBL). Acta Biomed. 75, 171-178 (2004).
- Senna, G., Caminati, M., Canonica, G. W. Safety and tolerability of sublingual immunotherapy in clinical trials and real life. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 13, 656-662 (2013).
- Mascarell, L., et al. Oral dendritic cells mediate antigen-specific tolerance by stimulating TH1 and regulatory CD4+ T cells. J Allergy Clin Immunol. 122, 603-609 (2008).
- Mascarell, L., et al. Mapping of the lingual immune system reveals the presence of both regulatory and effector CD4+ T cells. Clin Exp Allergy. 39, 1910-1919 (2009).
- Mascarell, L., et al. Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice. Mucosal Immunology. 4, 638-647 (2011).
- Hervouet, C., et al. Antigen-bearing dendritic cells from the sublingual mucosa recirculate to distant systemic lymphoid organs to prime mucosal CD8 T cells. Mucosal Immunology. 7, 280-291 (2014).
- Munoz, N., et al. Mucosal administration of flagellin protects mice from Streptococcus pneumoniae lung infection. Infect Immun. 78, 4226-4233 (2010).
- Hayashi, F., et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature. 410, 1099-1103 (2001).
- Lightfield, K. L., et al. Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nature Immunology. 9, 1171-1178 (2008).
- Lightfield, K. L., et al. Differential requirements for NAIP5 in activation of the NLRC4 inflammasome. Infect Immun. 79, 1606-1614 (2011).
- Honko, A. N., Mizel, S. B. Mucosal administration of flagellin induces innate immunity in the mouse lung. Infect Immun. 72, 6676-6679 (2004).
- Janot, L., et al. Radioresistant cells expressing TLR5 control the respiratory epithelium's innate immune responses to flagellin. Eur J Immunol. 39 (6), 1587-1596 (2009).
- Van Maele, L., et al. TLR5 signaling stimulates the innate production of IL-17 and IL-22 by CD3(neg)CD127+ immune cells in spleen and mucosa. J Immunol. 185, 1177-1185 (2010).
- Lee, S. J., et al. Neurologic adverse events following influenza A (H1N1) vaccinations in children. Pediatrics international: official journal of the Japan Pediatric Society. 54, 325-330 (2012).
- Lewis, D. J., et al. Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin. PLoS One. 4, e6999 (2009).
- Mutsch, M., et al. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland. N Engl J Med. 350, 896-903 (2004).
- Kuo, C. H., Wang, W. L., Chu, Y. T., Lee, M. S., Hung, C. H. Sublingual immunotherapy in children: an updated review. Pediatr Neonatol. 50, 44-49 (2009).
- Nempont, C., Cavet, D., Rumbo, M., Bompard, C., Villeret, V., Sirard, J. C. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J. Immunol. 181, 2036-2043 (2008).
- Pathogen Regulation Directorate, Public Health Agency of Canada . Streptococcus pneumoniae: Pathogen Safety Data Sheet - Infectious Substances. , Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php (2011).
- Marques, J. M., et al. Protection against Streptococcus pneumoniae serotype 1 acute infection shows a signature of Th17- and IFN-gamma-mediated immunity. Immunobiology. 217, 420-429 (2012).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J., et al. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. 4, Unit 4.1 (2001).
- Kubista, M., et al.
- Pedersen, G., Cox, R. The mucosal vaccine quandary: intranasal vs. sublingual immunization against influenza. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 8, 689-693 (2012).
- Vitaliti, G., et al. Mucosal immunity and sublingual immunotherapy in respiratory disorders. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 26, S85-S93 (2012).
